Charakterisierung funktioneller Domänen für GABA und Furosemid auf GABA A-Rezeptoren

ZUSAMMENFASSUNGDie schnelle inhibitorische Neurotransmission im Säugerhirn ist wesentlich GABA-erg vermittelt.Neben GABA binden u.a. Picrotoxinin und TBPS (tert-Butylbicyclophosphorothionat) am GABAA-Rezeptor. Die Bindung von [35S]TBPS wird durch alle am GABAA-Rezeptor bindenden Substanzen moduliert. Zur Untersuchung der GABAA-Rezeptor-Funktionen wurden TBPS-Bindungsstudien an rekombinant exprimierten Rezeptoren in vitro und nativen Rezeptoren in situ verwendet.Die alpha-Untereinheiten spielen bei der gehirnarealspezifischen Auswirkungen verschiedener GABA-Mimetika, der Charakterisierung subtypspezifischer Substanzen und der Ausprägung der GABA-Sensitivitäten eine große Rolle. Für die Detaillierung der höheren GABA-Sensitivität alpha6-enthaltender Rezeptoren wurden Chimären und Punktmutationen zwischen den Untereinheiten alpha1 und alpha6 hergestellt. Nach Austausch des Asparagins 188 in der alpha1-Untereinheit durch das alpha6-entsprechende Lysin zeigten Rezeptoren in Kombination mit den Untereinheiten beta3 und gamma2 eine erhöhte GABA-Sensitivität gegenüber dem Wildtyp. Dementsprechend wiesen alpha6-enthaltende Rezeptoren mit der umgekehrten Punktmutation L187N eine geringere GABA-Sensitivität auf. Furosemid wirkt ausschließlich auf alpha6beta2/3-enthaltende GABAA-Rezeptors GABA-agonistisch. [35S]TBPS-Bindungsstudien an chimären alpha1/alpha6-Rezeptoren weisen auf eine niedrigpotente Bindungsstelle für Furosemid im extrazellulären Sequenzabschnitt zwischen der Aoc I-Schnittstelle und der TM3-Region hin. Die Substanz 4 PIOL zeigte subtypspezifischen Charakter am GABAA-Rezeptor. In den [35S]TBPS-Autoradiographien und den Bindungsstudien an Membranen wirkte 4 PIOL auf alpha6-enthaltende Rezeptoren schwach GABA-mimetisch bzw. agonistisch, in den [35S]TBPS-Bindungsstudien an alpha6-enthaltenden rekombinanten Rezeptoren schwach negativ modulatorisch oder antagonistisch.

ABSTRACTIn mammalien brain, fast inhibitory neurotransmission is mostly mediated by GABA. In addition to GABA the GABAA receptors bind Picrotoxinin and TBPS (tert-butylbicyclophosphorothionat). [35S]TBPS binding is modulated by all GABAA receptor binding ligands. TBPS binding studies were used to analyze GABAA receptor function in heterologously-expressed receptors in vitro or native receptors in situ. The alpha subunits play an important role for brain area-specific effects of different GABA mimetics, characterisation of subtyp specific substances and expression of GABA-sensitivity. To identify the determinants of increased GABA-sensitifity in alpha6-containing receptors, chimeras and pointmutations between alpha1 and alpha6 subunits were constructed. Following replacement of asparagin 188 (alpha1 subunit) by lysin (alpha6 subunit), in combination with beta3/gamma2 subunits showed increased GABA-sensitivity compared to the wildtyp. The complementary mutation L187N in alpha6-containing receptors showed decreased GABA-sensitivity.Furosemid is an antagonist only on GABA alpha6beta2/3-containing GABAA receptors.[35S]TBPS-bindingsstudies on chimeric alpha1/alpha6-receptors indicate a lower potential binding site for Furosemid in an extracellular loop. The substance 4-PIOL shows subtyp specific action on GABAA-receptors. In [35S]TBPS-autoradiographs and [35S]TBPS-bindingstudies on membranes, 4-PIOL showed low GABA-mimetic or agonistic effects, whereas in [35S]TBPS-bindingstudies on alpha6-containing recombinant receptors it acted as a low negativ modulator or an antagonist.