Estudio del receptor 5HT2A y de la vía Akt/GSK3 como mecanismos moleculares de la psicosis inducida por el consumo crónico de cannabis

La esquizofrenia es una enfermedad mental de carácter crónico que afecta aproximadamente al 1% de la población , principalmente con edades comprendidas entre los 15 y 4 5 años . Se trata de una enfermedad de inicio en la adolescencia o comienzo de la madurez y cuyo potencial discapacitante persiste y se agrava a lo largo de la vida. La etiología de la esquizofrenia es multifactorial con evidencias de factores genéticos y ambientales. El carácter hereditario de la esquizofr e nia se ha estimado en un 73 - 90% y los factores genéticos que predisponen a la enfermedad son múltiples y heterogéneos. Los estudios epidemiológicos parecen sugerir que el mayor riesgo de desarrollar esquizofrenia es prod ucto de interacciones genético/ ambi entales (predisposición genética a agresiones ambientales) y del fenómeno de epistasis (fenotipo dependiente de la interacción entre diversos genes). Las manifestaciones clínicas de la esquizofrenia se dividen en síntomas positivos, síntomas negativos y dé ficits cognitivos. A causa de los déficits asociados y de su carácter crónico, la esquizofrenia se encuentra entre las diez causas principales de discapacidad por enfermedad del mundo y según la World Health Organization (2001), se estima que es la quinta enfermedad más costosa para la s ociedad en términos de atención requ erida y pérdida de productividad, con un coste anual en la Unión Europea que supera los 35 mil millones de €, según Andlin - Sobocki y Rössler (2005) . A nivel nacional, en el año 2009 los an tipsicóticos atípicos más empleados (risperidona y olanzapina) se encontraron entre los 8 primeros fármacos que más gasto generaron, con un coste económico superior a 350 millones de euros (Sistema Nacional de Salud (2010)) . Además, según el estudio de Pal mer et al. (2005), el riesgo de muerte prematura en la población esquizofrénica es aproximadamente dos veces mayor en la población general, siendo el suicidio la principal causa de este exceso de mortalidad, con una prevalencia estimada entre 5 - 10%. En est e sentido, se ha estimado que entre el 25% y 50% de los pacientes con esquizofrenia cometen por lo menos un intento de suicidio en su vida , según el estudio llevado a cabo por Meltzer (2002) . Dada su prevalencia, la tendencia a la cronicidad y el riesgo su icida de pacientes con esquizofrenia así como los elevados costes socio - sanitarios, la investigación de esta enfermedad es un objetivo prioritario de los sistemas de salud mundiales

Estratégias de inibição, mecanismos moleculares e interações intermoleculares em complexos macromoleculares

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)

Avaliação dos mecanismos moleculares envolvidos na instalação da resistência periférica à insulina em camundongos portadores de caquexia tumoral

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)

Nuevos mecanismos moleculares de tolerancia a sequía y otros tipos de estrés abiótico en especies arbóreas de interés económico

Las masas forestales tienen una importancia colosal para nuestra sociedad y el conjunto de la biosfera. Estudios recientes a escala mundial indican que la sequía es el factor abiótico que más afecta a su crecimiento y supervivencia, seguida por las temperaturas extremas y la salinidad. Aunque comprender los mecanismos con que las especies arbóreas toleran estas formas de estrés tiene un interés aplicado evidente, dichos mecanismos se han estudiado mucho más en especies herbáceas modelo o de interés agronómico. Existen sin embargo diferencias notables entre ellas, como se demuestra en esta tesis y en otros trabajos recientes. Nuestro estudio se centra concretamente en la respuesta molecular del chopo –el sistema modelo forestal más desarrollado– al estrés abiótico, con particular énfasis en la sequía. Utilizando una estrategia proteómica y tratamientos controlados, hemos identificado componentes mayoritarios de dicha respuesta. Su participación en la misma se ha validado mediante análisis transcripcionales detallados utilizando tecnología qRT-PCR (PCR cuantitativa en tiempo real). Hemos identificado proteínas cuyo nexo funcional con mecanismos de tolerancia ya era conocido, como chaperonas moleculares sHSP o enzimas que atenúan el estrés oxidativo, pero también proteínas cuya relación funcional con el estrés es menos clara o incluso novedosa, como polifenol oxidasas (PPO), deshidrogenasas/reductasas de cadena corta (SDR), o bicupinas (BIC), entre otras. El cuerpo central de la tesis consiste en la caracterización detallada de una PPO inusual, cuya inducción por estrés hídrico se describe por vez primera. Estas enzimas están ampliamente distribuidas en plantas, si bien su número es muy variable de unas especies a otras. Algunas, como nogal, tienen un único gen, mientras que Arabidopsis no tiene ninguno. En la última versión del genoma de chopo hemos identificado un total de 12 miembros bona fide, corrigiendo trabajos previos, y hemos caracterizado su expresión individual ante diferentes situaciones de estrés controlado y tratamientos hormonales. La isoforma antedicha es el único miembro de la familia que responde claramente a la deshidratación. También responde a salinidad y a la mayor parte de tratamientos hormonales ensayados, pero no a daño mecánico o tratamientos con metil jasmonato. Esto la diferencia de enzimas homólogas presentes en otras especies de plantas, que se han relacionado experimentalmente con estrés biótico. Los patrones de acumulación de transcritos en árboles adultos son compatibles con un papel protector frente a la sequía. La integración de nuestros estudios funcionales y filogenéticos sugiere que la familia ha sufrido un proceso reciente de diversificación y neofuncionalización, siendo la protección frente a deshidratación su papel primigenio. Aunque se conoce la actividad bioquímica in vitro de este tipo de enzimas, sus sustratos naturales son esencialmente una incógnita. Mediante expresión heteróloga en Escherichia coli BL21(DE3) hemos detectado que la enzima de chopo es capaz de oxidar L-DOPA a dopaquinona, siendo menos activa frente a otros sustratos. Por otra parte, hemos demostrado su localización cloroplástica mediante transformación transitoria de protoplastos con fusiones a la proteína fluorescente YFP. Mediante la obtención de plantas transgénicas de A. thaliana hemos demostrado que la enzima de chopo aumenta considerablemente la tolerancia in vivo frente a la deshidratación y al estrés salino. El análisis fenotípico detallado de las líneas transgénicas, combinando múltiples metodologías, nos ha permitido sustanciar que la tolerancia tiene una base compleja. Esta incluye una mayor protección del sistema fotosintético, una capacidad antioxidante muy incrementada y la acumulación de solutos osmoprotectores como la prolina. Los análisis metabolómicos nos han permitido asociar la expresión de la proteína a la síntesis de un flavano no descrito previamente en A. thaliana, vinculando la enzima de chopo con la síntesis de fenilpropanoides. También hemos observado alteraciones en los niveles hormonales que podrían subyacer a efectos pleiotrópicos con interés aplicado, como un aumento consistente del tamaño de la planta o el acortamiento del ciclo de crecimiento. Además de aportar datos novedosos sobre la funcionalidad in vivo de esta familia de oxidasas, los resultados de esta tesis demuestran que los árboles son sistemas de estudio interesantes para caracterizar nuevas estrategias de tolerancia al estrés abiótico con potencial aplicado. ABSTRACT Forests masses have an extraordinary importance for our society and the biosphere. Recent worldwide studies indicate that drought is the abiotic factor that affects more their growing and survival, followed by extreme temperatures and salinity. The understanding of how the arboreal species tolerate the stress has an evident practical interest, but their mechanisms have been studied much more in herbaceous species or with agronomic interest. However, considerable differences exist between them, as this thesis and recent studies show. Our study is focused on the molecular response of the poplar –the more developed forestry model system- to abiotic stress, specifically focused in the drought. Using a proteomic strategy and controlled treatments, we have identified main components in such response. Its participation has been validated through transcriptional analysis using qRT-PCR technology. We have identified proteins whose functional connection with tolerance mechanisms were already known, as molecular chaperones sHSP or enzymes that attenuate the oxidative stress, but also some proteins whose functional relationship with the stress is less clear or even novel, as polifenol oxidases (PPO), short chain deshidrogenases/reductases (SDR), or bicupines (BIC), among others. The central body of the thesis consists of the detailed characterization of an unsual PPO, whose induction due to drought stress is first described. These enzymes are thoroughly distributed in plants, but their number of members is very variable among species. Some of them, as the walnut tree, have a single gene, while Arabidopsis has none. We have identified a total of 12 members in the last version of the poplar genome, correcting previous works, and have characterized their individual expression against different situations of controlled stress and hormone treatments. The aforementioned isoform is the only member of the family that responds clearly to the drought. It also reacts to salinity and the majority of hormonal treatments tested, but it does not respond to mechanical damage or treatments with methyl jasmonate. This is the difference with homologue enzymes present in other plant species, which have been related experimentally with abiotic stress. The accumulation patterns of transcripts in adult trees are compatible with a protector role against drought. The integration of our functional and phylogenetic studies suggests that the family has suffered a recent process of diversification and neofunctionalization, being the protection against drought their original role. Although the in vitro biochemistry activity of this kind of enzymes is already known, their natural substracts are essentially a mystery. By means of heterologous expression of Escherichia coli BL21(DE3) we have detected that the enzyme of poplar is able to oxidize L-DOPA to dopaquinone, being less active against other substrates. Additionally, we have proven its chloroplastic location with transitory transformation of protoplasts with YFP protein fusion. By means of getting transgenic plants of A. thaliana, we have demonstrated that the poplar enzyme increases notably the in vivo tolerance against the drought and salinity stresses. The phenotypic analysis of the transgenic lines, and the use of multiple methodologies, allowed us to test the complexity of the tolerance. This includes a major protection of the photosynthetic system, a very increased antioxidant capacity and the accumulation of osmoprotectant solutes as the proline. The metabolic analysis has allowed to associate the protein expression with the synthesis of a Flavan non described previously in A. thalaiana, linking the enzyme of poplar with the synthesis of phenylpropanoids. We have observed alterations in the hormonal levels that could underlie pleiotropic effects with applied interest, as a consistent increase of the size of the plant and the reduction of the growth cycle. The results of this thesis, in addition to provide novel data about the in vivo functionality of the oxidase family, demonstrate that the trees are interesting systems of study to characterize new strategies of tolerance against abiotic stress with applied potential.

“Estudio de los mecanismos moleculares involucrados en la inmunosupresión observada durante la infección con Trypanosoma cruzi: Rol de la vía PD-1/PD1-L y E3 ubiquitina ligasas”.

Trypanosoma cruzi es el agente causal de la enfermedad de Chagas, un problema de salud importante en América Latina, así como también en América Central, ya que causa infección crónica afectando a millones de personas [1]. Durante esta enfermedad se han descripto varias alteraciones de la respuesta inmune, entre ellas una severa inmunosupresión durante la etapa aguda de la infección, tanto en humanos como en ratones. Células T provenientes de ratones infectados activadas in vitro, muestran reducción en la respuesta proliferativa a mitógenos, característica de un estado de inmunosupresión [2-4]. La falla del sistema inmune durante estadios tempranos de la infección probablemente colabore con la diseminación y el establecimiento del parásito. Un gran número de estudios se han focalizado en la identificación de mecanismos moleculares responsables del fenómeno de inmunosupresión, entre los mecanismos citados se ha demostrado presencia de células supresoras [5-9], factores inmunosupresores presentes en el parásito [2, 3, 10-13], producción excesiva de óxido nítrico [14], disminuida producción de IL-2 y reducida expresión del receptor de IL2 en células de bazo de animales infectados [9, 15-17]. Muchos de estos mecanismos han sido exhaustivamente investigados, sin embargo no está del todo claro si existen mecanismos adicionales involucrados en la inmunosupresión de la célula T. Adicionalmente, en los últimos años nuevas moléculas que median la regulación negativa de la célula T, entre las cuales están PD-1/PD1-L [18], arginasa [19] y E3 ubiquitina ligasas [20-22], han sido reportadas durante inmunosupresión en diversas infecciones.

Caracterização do material particulado e avaliação do risco ocupacional e mecanismos moleculares associados à queima artesanal da castanha de caju

Brazil is among the largest cashew nut producers of the world. However, the roasting process is still carried out artisanally, especially in the Brazilian semiarid region. In face of this occupational problem, the aim of this study was to perform a physical-chemical characterization of the particulate matter (PM) emitted by the roasting of cashew nuts, as well as to determine the occupational risk and molecular mechanisms associated. The most evident PM characteristics were the prevalence of fine particles, typical biomass burning morphologies such as tar ball and the presence of the elements K, Cl, S, Ca and Fe. In addition, atmospheric modeling analyses suggest that these particles can reach neighboring regions of the emission source. Polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) with carcinogenic potential, such as benzo[a]pyrene, dibenz[a,h]anthracene, benzo[a]anthracene, benzo[b]fluoranthene, chrysene, benzo[k]fluoranthene, indeno[1,2,3-c,d]pyrene and benzo[j]fluoranthene were the most abundant PAHs found in the two air monitoring campaigns. Among the identified oxy-PAH the benzanthrone (7H-benz[d,e]anthracen-7-one) had the highest concentration and the evaluation of lifetime cancer risk showed an increase of 12 to 37 cases of cancer for every 10,000 exposed people. Chemical analysis of roasted cashew nuts identified the PAHs: phenanthrene, benzo[g,h,i]perylene, pyrene and benzo[a]pyrene, besides the 3-pentadecilfenol allergen (urushiol analogue) as prevalent. Occupational exposure to PAHs was confirmed by the increase of urinary 1-hydroxypyrene levels and genotoxic effects were evidenced by the increase on micronuclei and nuclear bud frequency in exfoliated buccal mucosa cells among the exposed workers. Other biomarkers of effects such as karyorrhexis, pyknotic, karyolytic, condensed chromatin and binucleated cells also have their frequencies increased when compared to an unexposed control group. The investigation of the molecular mechanisms associated with the PM organic extract showed cytotoxicity in human lung cell lines (A549) at concentrations ≥ 4 nM BaPeq. Using non-cytotoxic doses the extract was able to activate proteins involved in the DNA damage response pathway (Chk1 and p53). Moreover, the specific contribution of the four most representative PAHs in the cashew nut roasting sample showed that benzo[a]pyrene was the most efficient to activate Chk1 and p53. Finally, the organic extract was able to increase persistently the mRNA expression involved in the PAHs metabolism (CYP1A1 and CYP1B1), inflammatory response (IL-8 and TNF-α) and cell cycle arrest (CDKN1A) for DNA repair (DDB2). The high PM concentrations and its biological effects associated warn of the serious harmful effects of artisanal cashew nut roasting and urgent actions should be taken to the sustainable development of this activity.

Caracterização do material particulado e avaliação do risco ocupacional e mecanismos moleculares associados à queima artesanal da castanha de caju

Brazil is among the largest cashew nut producers of the world. However, the roasting process is still carried out artisanally, especially in the Brazilian semiarid region. In face of this occupational problem, the aim of this study was to perform a physical-chemical characterization of the particulate matter (PM) emitted by the roasting of cashew nuts, as well as to determine the occupational risk and molecular mechanisms associated. The most evident PM characteristics were the prevalence of fine particles, typical biomass burning morphologies such as tar ball and the presence of the elements K, Cl, S, Ca and Fe. In addition, atmospheric modeling analyses suggest that these particles can reach neighboring regions of the emission source. Polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) with carcinogenic potential, such as benzo[a]pyrene, dibenz[a,h]anthracene, benzo[a]anthracene, benzo[b]fluoranthene, chrysene, benzo[k]fluoranthene, indeno[1,2,3-c,d]pyrene and benzo[j]fluoranthene were the most abundant PAHs found in the two air monitoring campaigns. Among the identified oxy-PAH the benzanthrone (7H-benz[d,e]anthracen-7-one) had the highest concentration and the evaluation of lifetime cancer risk showed an increase of 12 to 37 cases of cancer for every 10,000 exposed people. Chemical analysis of roasted cashew nuts identified the PAHs: phenanthrene, benzo[g,h,i]perylene, pyrene and benzo[a]pyrene, besides the 3-pentadecilfenol allergen (urushiol analogue) as prevalent. Occupational exposure to PAHs was confirmed by the increase of urinary 1-hydroxypyrene levels and genotoxic effects were evidenced by the increase on micronuclei and nuclear bud frequency in exfoliated buccal mucosa cells among the exposed workers. Other biomarkers of effects such as karyorrhexis, pyknotic, karyolytic, condensed chromatin and binucleated cells also have their frequencies increased when compared to an unexposed control group. The investigation of the molecular mechanisms associated with the PM organic extract showed cytotoxicity in human lung cell lines (A549) at concentrations ≥ 4 nM BaPeq. Using non-cytotoxic doses the extract was able to activate proteins involved in the DNA damage response pathway (Chk1 and p53). Moreover, the specific contribution of the four most representative PAHs in the cashew nut roasting sample showed that benzo[a]pyrene was the most efficient to activate Chk1 and p53. Finally, the organic extract was able to increase persistently the mRNA expression involved in the PAHs metabolism (CYP1A1 and CYP1B1), inflammatory response (IL-8 and TNF-α) and cell cycle arrest (CDKN1A) for DNA repair (DDB2). The high PM concentrations and its biological effects associated warn of the serious harmful effects of artisanal cashew nut roasting and urgent actions should be taken to the sustainable development of this activity.

Hiperagregabilidade plaquetária e depressão: é o óxido nítrico o mensageiro comum?

A depressão é uma doença grave que vem se tornando mais prevalente na população mundial e no Brasil. Segundo a Organização Mundial de Saúde (OMS), é a quarta doença mais incapacitante e estima-se que em 2020 ocupe o segundo lugar, ficando atrás apenas das doenças cardiovasculares (DCV), que são a principal causa de morte no mundo. O Transtorno depressivo maior (TDM) se caracteriza por humor deprimido, tristeza intensa ou desânimo ou perda de interesse ou de prazer por quase todas as atividades por, pelo menos, duas semanas. Além disso, tem um elevado índice de mortalidade cardiovascular, e esta associação parece ser multifatorial e altamente complexa, e ainda não está completamente elucidada. Recentes estudos sugerem que a ocorrência de aterotrombose e eventos cardiovasculares no TDM está associada a uma diminuição na biodisponibilidade do óxido nítrico (NO), um potente vasodilatador, anti-agregante plaquetário e neurotransmissor. O NO é um gás formado a partir da L-arginina, pela ação da família de enzimas NO sintases (NOS), e vai ocasionar um aumento de guanosina monofosfato cíclica (GMPc), que é posteriormente degradada pelas fosfodiesterases (PDE). A L-arginina participa em outras vias além da produção de NO, como a arginase. O estresse oxidativo também tem uma participação no desenvolvimento dos transtornos psiquiátricos e nas DCV, e pode reduzir a meia-vida do NO. O objetivo deste estudo é investigar a via NO-GMPc, o ciclo da uréia, marcadores de estresse oxidativo e de inflamação em plaquetas e a sua associação com a função plaquetária no TDM. Participaram da pesquisa nove pacientes com diagnóstico de depressão leve a moderada do Serviço de Psicologia Aplicada (SPA/UERJ) e onze indivíduos saudáveis pareados por idade como controles. Este projeto foi aprovado pelo Comitê de Ética e Pesquisa do Hospital Universitário Pedro Ernesto (1436-CEP/HUPE). A agregação plaquetária, a expressão e atividade da arginase II, a expressão da PDE 5, marcadores de estresse oxidativo (níveis de TBARS, carbonilação de proteínas, expressão da NADPH oxidase e da glutationa peroxidase (GPx) e atividade desta e da catalase (CAT), ambas enzimas anti-oxidantes) nas plaquetas e no soro, e o fibrinogênio sistêmico foram investigados. No presente estudo observou-se um aumento da agregação plaquetária induzida por ADP em pacientes com TDM comparados aos controles. Uma ativação da arginase II em plaquetas sem qualquer alteração na sua expressão foi demonstrada em pacientes com TDM. Além disso, um aumento na carbonilação de proteínas e na expressão de GPx, de NADPH e de PDE5 foi observado em plaquetas de pacientes com TDM. A produção de TBARS, a atividade de GPx e CAT nas plaquetas e no soro não foram afetados pelo TDM. Não houve diferença nos níveis de fibrinogênio entre pacientes com TDM e controles. A ativação da arginase, somada ao estresse oxidativo, reduziria a biodisponibilidade de NO levando à disfunção plaquetária nos pacientes com TDM. O presente estudo acrescenta dados importantes para a compreensão dos mecanismos celulares envolvidos na relação TDM e DCV. Além disso, abre caminho para a utilização de novas ferramentas farmacológicas, como os antioxidantes, para o tratamento do TDM.

Compostos de origem marinha com ação anti-inflamatória

Dissertação de mestrado, Ciências Farmacêuticas, Faculdade de Ciências e Tecnologia, Universidade do Algarve, 2015

Deciphering the molecular role of DJ-1 in the etiology of Parkinson’s and Huntingtons’s disease

Tese de doutoramento, Ciências Biomédicas (Neurociências), Universidade de Lisboa, Faculdade de Medicina, 2014

Modulation of calcitonin amyloid formation by anionic lipid membranes

Tese de mestrado em Bioquímica, apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, 2014

Retenção de clorofila em sementes de soja (Glycine max (L.) Merr.): estudos fisiológicos, bioquímicos e moleculares

Pós-graduação em Agronomia (Agricultura) - FCA

Investigação de mecanismos genéticos e epigenéticos em distúrbios do crescimento humano

Parcela considerável de pacientes com distúrbios de crescimento não têm a causa de seus quadros clínicos estabelecida, incluindo aproximadamente 50% dos pacientes com diagnóstico clínico de síndrome de Silver−Russell (SRS) e 10-20% dos pacientes com síndrome de Beckwith-Wiedemann (BWS). O objetivo deste estudo foi investigar as causas genéticas e epigenéticas de distúrbios de crescimento, de etiologia desconhecida, numa contribuição para o entendimento de mecanismos que regulam o crescimento. O estudo compreendeu: (1) a investigação de microdesequilíbrios cromossômicos, por aCGH; (2) a análise do perfil de expressão alelo-específica de genes sujeitos a imprinting (IG), por pirossequenciamento (PSQ) ou sequenciamento de Sanger; (3) a investigação do padrão de metilação global em pacientes com restrição de crescimento, utilizando microarray de metilação. A casuística constituiu-se de 41 pacientes não aparentados, com distúrbios de crescimento, de etiologia desconhecida: (1) 25, com hipótese diagnóstica de SRS; (2) seis, com restrição de crescimento intrauterino e peso ao nascimento abaixo do 10º percentil, associados a outros sinais clínicos; (3) sete, com hipótese diagnóstica de BWS; e (4) três, com macrossomia pré-natal ou pós-natal, associada a outros sinais. A investigação de microdesequilíbrios cromossômicos foi realizada em 40 pacientes. Foram detectadas 58 variantes raras em 30/40 pacientes (75%): 40 foram consideradas provavelmente benignas (18 pacientes, 45%), 12, com efeito patogênico desconhecido (11 pacientes, 27,5%), duas, provavelmente patogênicas (um paciente, 2,5%) e quatro, patogênicas (três pacientes, 7,5%). Essas frequências são comparáveis àquelas descritas em estudos que investigaram CNV em grupos de pacientes com distúrbios de crescimento e outras alterações congênitas, incluindo SRS, e mostram a importância da investigação de microdesequilíbrios cromossômicos nesses pacientes. A diversidade dos microdesequilíbrios cromossômicos identificados é reflexo da heterogeneidade clínica das casuísticas. Neste estudo, muitos dos pacientes com hipótese diagnóstica de SRS e BWS apresentavam sinais clínicos atípicos, explicando a ausência neles das alterações (epi)genéticas que causam essas síndromes. A identificação de CNV características de outras síndromes reflete a sobreposição de sinais clínicos com BWS e SRS. A análise do perfil de expressão alelo-específica de IG foi realizada em um subgrupo de 18 pacientes com restrição de crescimento. Trinta IG com função em proliferação celular, crescimento fetal ou neurodesenvolvimento foram inicialmente selecionados. Após seleção de SNP transcritos com alta frequência na população, genotipagem de pacientes, genitores e indivíduos controle, determinação da expressão dos IG em sangue periférico e seu padrão de expressão (mono ou bialélico), 13 IG, expressos no sangue, tiveram a expressão alelo-específica avaliada, sete deles por PSQ e seis por sequenciamento de Sanger. Alterações no perfil de expressão de dois genes, de expressão normalmente paterna, foram detectadas em 4/18 pacientes (22%). Este estudo é o primeiro a utilizar pirossequenciamento e sequenciamento de Sanger na avaliação do perfil de expressão alelo-específica de IG, em pacientes com restrição de crescimento. Apesar de terem limitações, ambas as técnicas mostraram-se robustas e revelaram alterações de expressão alélica interessantes; entretanto, a relação dessas alterações com o quadro clínico dos pacientes permanece por esclarecer. A investigação da metilação global do DNA foi realizada em subgrupo de 21 pacientes com restrição de crescimento e em 24 indivíduos controle. Dois tipos de análise foram realizados: (1) análise diferencial de grupo e (2) análise diferencial individual. Na primeira análise, em que foi comparado o padrão de metilação do grupo de pacientes com quadro clínico sugestivo de SRS (n=16) com o do grupo controle (n=24), não houve indicação de hipo ou hipermetilação global no grupo SRS. Na segunda análise, foi comparado o padrão de metilação de cada um dos 21 pacientes com restrição de crescimento e dos 24 indivíduos controle, com o padrão de metilação do grupo controle. O número médio de CpG hipermetilados e de segmentos diferencialmente metilados (SDM) foi significativamente maior nos pacientes. Foram identificados 82 SDM hipermetilados, estando 57 associados a gene(s) (69,5%), em 16 pacientes, e 51 SDM hipometilados, 41 deles associados a gene(s) (80,4%), em 10 pacientes. A análise de ontologia genética dos 61 genes associados aos SDM hipo ou hipermetilados nos pacientes destacou genes que atuam no desenvolvimento e na morfogênese do sistema esquelético e de órgãos fetais, e na regulação da transcrição gênica e de processos metabólicos. Alterações de metilação em genes que atuam em processos de proliferação e diferenciação celulares e crescimento foram identificadas em 9/20 dos pacientes (45%), sugerindo implicação clínica. Não foi detectada alteração epigenética comum aos pacientes com diagnóstico clínico de SRS, explicável provavelmente pela heterogeneidade clínica. A investigação de metilação global, utilizando microarray, produziu novos dados que podem contribuir para a compreensão de mecanismos moleculares que influenciam o crescimento pré- e pós-natal. Na translocação aparentemente equilibrada - t(5;6)(q35.2;p22.3)dn, detectada em paciente com suspeita clínica de SRS, a interrupção de um gene, pela quebra no cromossomo 6, pode ser a causa do quadro clínico; alternativamente, a translocação pode ter impactado a regulação de genes de desenvolvimento localizados próximos aos pontos de quebra. A análise de expressão em sangue periférico mostrou que os níveis de cDNA do gene, interrompido pelo ponto de quebra da translocação, estavam reduzidos à metade. Além de sinais típicos da SRS, a paciente apresentava algumas características clínicas sugestivas de displasia cleidocraniana. Assim, a translocação t(5;6) pode ter alterado a interação de genes de desenvolvimento e seus elementos reguladores, levando à desregulação de sua expressão espaço-temporal, e resultando num fenótipo atípico, com características sobrepostas de mais de uma síndrome genética

Mecanismos de neurotoxicidade induzidos pela Dopamina e pela 6–OH-dopamina num modelo celular humano: efeito da presença de extratos de algas com elevada capacidade antioxidante

O aumento da esperança média de vida tem elevado a prevalência de doenças neurodegenerativas, como é o caso da doença de Parkinson. Nos últimos anos a procura de novas soluções terapêuticas, assim como a minimização dos efeitos dos tratamentos atualmente utilizados tem promovido a procura de novas soluções. Deste modo, o objetivo deste trabalho consistiu no estudo dos mecanismos moleculares de neurotoxicidade induzidos pela dopamina (DA) e 6-hidroxidopamina (6-OHDA) num modelo celular do neuroblastoma humano (SH-SY5Y), bem como na avaliação do potencial neuroprotetor de extratos de algas com elevada capacidade antioxidante. O efeito neurotóxico da DA e 6-OHDA, assim como o efeito protetor dos extratos das algas com maior atividade antioxidante (Sargassum muticum, Saccorhiza polyschides, Padina pavonica, Codium tomentosum, Ulva compressa) foi avaliado através da viabilidade celular das células SH-SY5Y utilizando o método de MTT. De modo a compreender os efeitos induzidos na viabilidade celular pela DA e 6-OHDA procedeu-se ao estudo da atividade da caspase-3, alterações do potencial mitocondrial e quantificação de H2O2. Os resultados demonstraram um claro efeito dependente da concentração da DA (30-3000μM) e 6-OHDA (10-1000μM) na viabilidade celular das células SH-SY5Y, bem como do tempo de exposição (6-48h). No que diz respeito a prevenção do efeito neurotóxico da DA (1000μM (56,41±5,05% de células viáveis); 24h) e 6-OHDA (100μM (66,76±3,24% de células viáveis);24h) pelos extratos das algas (1mg/mL; 24h) verificou-se que os extratos que apresentaram um efeito preventivo mais marcado pertencem as algas Sargassum muticum (82,37±6,41% de células viáveis e 115,8±8,53% de células viáveis, após tratamento com DA e 6-OHDA, respetivamente), Saccorhiza polyschides (89,26±8,62% de células viáveis e 106,51±4,26% de células viáveis, após tratamento com DA e 6-OHDA, respetivamente) e Codium tomentosum (81,28±3,68% de células viáveis e 103,17±7,25% de células viáveis, após tratamento com DA e 6-OHDA, respetivamente). A morte celular induzida pela DA e pela 6-OHDA foi acompanhada pelo aumento da atividade da caspase-3 quando comparado com o controlo (DA - 66,46±1,49fluorescência (u.a)/mg de proteína/minuto; 6-OHDA - 22,56±1,71fluorescência (u.a)/mg de proteína/minuto; controlo – 4,8 ±0,48fluorescência (u.a)/mg de proteína/minuto), pela presença de elevadas quantidades de peróxido de hidrogénio (H2O2) (363,81±28,58 % do controlo e 214,26 ± 8,46 % do controlo, após tratamento com DA e 6-OHDA, respetivamente) e pela despolarização da membrana mitocondrial (162,3±2,34 % do controlo e 144,7±2,87 % do controlo, após tratamento com DA e 6-OHDA, respetivamente). Por sua vez, durante o tratamento com extratos das algas (1mg/mL) na presença de DA e 6-OHDA verificou-se uma inibição da atividade da caspase-3 induzida pelas algas Sargassum muticum (2,53±2,49fluorescência (u.a)/mg de proteína/minuto e 4,52±1,36 fluorescência (u.a)/mg de proteína/minuto, após tratamento com DA e 6-OHDA, respetivamente), Saccorhiza polyschides (4,71±0,70fluorescência (u.a.)/mg de proteína/minuto e 2,73±1,11 fluorescência (u.a.)/mg de proteína/minuto, após tratamento com DA e 6-OHDA, respetivamente) e Codium tomentosum (17,05±1,72fluorescência (u.a.)/mg de proteína/minuto e 2,58±1,77fluorescência (u.a)/mg de proteína/minuto, após tratamento com DA e 6-OHDA, respetivamente). De igual modo verificou-se uma diminuição da produção de H2O2 pelas células SH-SY5Y na presença dos extratos das algas Sargassum muticum (132,58 ± 10,68% controlo), Saccorhiza polyschides (150,54 ± 23,54% controlo) e Codium tomentosum (54,074 ± 6,66% do controlo), quando expostas a 6-OHDA, contudo não se verificou o mesmo efeito na presença de DA. Relativamente ao potencial mitocondrial observou-se uma inibição da despolarização mitocondrial induzida pela DA e 6-OHDA nas células SH-SY5Y pela presença dos extratos das algas Sargassum muticum (135,7±2,97% controlo e 49,3±1,17% controlo, após tratamento com DA e 6-OHDA, respetivamente), Saccorhiza polyschides (126,7±5,46% controlo e 94,3±1,70% controlo, após tratamento com DA e 6-OHDA, respetivamente). Os resultados obtidos demonstraram o potencial citoprotetor dos extratos de algas sobre efeitos neurotóxicos induzidos pela DA e 6-OHDA no modelo celular SH-SY5Y. O efeito protetor é mediado pela diminuição da condição de stress oxidativo, com redução da produção de H2O2, diminuição da atividade da caspase-3 e prevenção da alteração do potencial mitocondrial induzido pela DA e 6-OHDA. Conclui-se que os extratos de algas produzem moléculas bioativas com elevado potencial antioxidante, podendo ser uma fonte promissora de novos compostos neuroprotetores com aplicação terapêutica para doenças neurodegenerativas como a doença de Parkinson.

A importância do uso de métodos complementares para a avaliação da toxicidade de hidrocarbonetos aromáticos policíclicos

Hidrocarbonetos Aromáticos Policíclicos (HAPs) e seus derivados Halogenados (HHAPs) são conhecidos como um conjunto de contaminantes ambientais, classificados como potencialmente tóxicos, mutagénicos e carcinogénicos, sendo um assunto de extrema importância e preocupação para a saúde pública. Diversos estudos têm reportado o potencial efeito tóxico destes compostos após longos períodos de exposição, pelo uso de métodos colorimétricos como o ensaio de brometo de 3-[4,5- dimetil-tiazol-2-il]-2,5-difeniltetrazólio (MTT) e vermelho neutro. Contudo, apesar de estes métodos clássicos de avaliação da citotoxicidade in vitro permitirem, de forma rápida, identificar as propriedades nocivas dos compostos, não permitem compreender os mecanismos moleculares subjacentes responsáveis pela sua toxicidade. Deste modo, no presente estudo, para avaliar os efeitos à exposição aos compostos Pireno (Pir) e seu derivado resultante da desinfeção de águas por bromação, 1-BromoPireno (1-BrPir), foram utilizados outros métodos complementares como avaliação do stress oxidativo e vários fenómenos associados à morte celular programada. Os resultados obtidos comprovam não só a existência de efeitos citotóxicos dos poluentes quando acumulados, como também possíveis efeitos genotóxicos. Assim, pelos métodos complementares, foi possível a identificação de alvos moleculares passiveis de ação farmacológica, o que pode constituir o primeiro passo para o desenho de estratégias terapêuticas que visem prevenir ou tratar os danos provocados por estes poluentes no Homem.