Die Regulation des Interleukin-12 p40 Promotors in Monozyten und Makrophagen

Interleukin-12 ist ein Schlüsselregulator zellvermittelter Immunantworten. In der vorliegenden Dissertation wurde die Regulation des IL-12 p40 Promotors in Monozyten und Makrophagen untersucht. Mit Hilfe von 'In Vivo Footprinting'-, Bandshift- und Transfektionsexperimenten konnte eine wichtige Funktion der Transkriptionsfaktoren NF-kappaB, C/EBP-beta und PU.1 bei der Aktivierung des Promotors gezeigt werden. 'In Vivo Footprinting'-Experimente führten auch zur Identifikation eines bisher nicht beschriebenen regulatorischen Elementes im IL-12 p40 Promotor. Dieses GA-12 genannte Motiv war in unstimulierten primären Monozyten protektiert, nicht jedoch in Zellen, die mit LPS oder LPS/ Interferon-gamma stimuliert wurden. Eine genauere Charakterisierung ergab, daß dieses Motiv eine repressorische Funktion auf den Promotor ausübt und in unstimulierten, nicht jedoch in stimulierten Monozyten und Makrophagen von einem spezifischen GATA-ähnlichen Komplex (GAP-12) erkannt wird. Zudem führte die Behandlung von Monozyten mit Interleukin-4 und Prostaglandin-E2, Inhibitoren der IL-12 Produktion, zu einer Verstärkung der Komplexbildung am GA-12 Motiv. Zur Analyse der Promotorregulation im nukleosomalen Umfeld wurden außerdem IL-12 p40 Promotor/ Luziferase transgene Mäuse hergestellt. Die Analyse dieser Mäuse zeigte, daß der proximale Promotor ausreichend Sequenzinformation beinhaltet, um in vivo die stimulations- und gewebespezifische Regulation des Gens zu gewährleisten. Anhand der erhobenen Daten konnte ein Modell der Regulation des IL-12 p40 Promotors in Monozyten und Makrophagen entworfen werden.

Zur Zytotoxizität von enzymatisch verändertem Low Density Lipoprotein: Differenzielle Empfindlichkeit von Granulozyten und Makrophagen gegenüber E-LDL

Low density lipoprotein (LDL) wird in der Arterienwand enzymatisch gespalten. Das Produkt, E-LDL, enthält neben freiem Cholesterol unveresterte Fettsäuren und induziert die Produktion von Interleukin 8 (IL-8) in Endothelzellen. Der Transkriptionsfaktor nuclear factor-kappaB (NF-κB), der das IL-8-Gen normalerweise reguliert, wurde durch E-LDL jedoch nicht aktiviert: Das veränderte Lipoprotein bewirkte im Gegenteil eine Hemmung von NF-κB vor dessen Translokation in den Zellkern. In E-LDL enthaltene freie Fettsäuren waren für die Hemmung verantwortlich. Dagegen aktivierte E-LDL den Transkriptionsfaktor AP-1, wie durch Phosphorylierung von c-jun gezeigt wurde. IL-8 lockt polymorphkernige Granulozyten (PMN) an, die jedoch in der frühen atherosklerotischen Läsion nicht vorkommen. Die vorliegende Arbeit bietet eine mögliche Erklärung für ihre Abwesenheit: PMN zeigten sich wesentlich empfindlicher gegenüber der Toxizität von E-LDL als Makrophagen. Es ist denkbar, daß sie in die Läsion zwar einwandern, nach ihrem raschen Tod dort jedoch nicht mehr detektiert werden können. E-LDL aktivierte PMN, wie durch Superoxidbildung und Peroxidasefreisetzung gezeigt wurde. Sowohl Aktivierung als auch Toxizität wurden von den in E-LDL enthaltenen freien Fettsäuren verursacht, die eine direkte Schädigung der Zellmembran bewirkten. Die E-LDL-bedingte Freisetzung proinflammatorischer Substanzen aus PMN könnte ein Grund dafür sein, daß die Depletion dieser Zellen die Läsionsentwicklung hemmt.

DNA-Reparatur und Zelltod nach gentoxischem Stress in Monozyten, dendritischen Zellen und Makrophagen

Monozyten wie auch dendritische Zellen (DCs) und Makrophagen sind ein wichtiger Bestandteil des angeborenenen unspezifischen Immunsystems. Ein Kennzeichen dieser Zellen ist die Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) zur Abtötung von Pathogenen. Im Fall von chronischen Entzündungen oder Infekten kann es zu einer explosionsartigen Freisetzung freier Radikale kommen ('Oxidative Burst'). Aus vorangegangenen Untersuchungen war bekannt, dass die Expression der beiden Basen Exziosions Reparatur (BER)-Proteine XRCC1 und Ligase III während der Ausreifung humaner Monozyten zu DCs induziert wird (Briegert and Kaina, 2007). Dies lies vermuten, dass Monozyten aufgrund einer defekten BER eine hohe Sensitivität gegenüber ROS aufweisen. Um diese Hypothese zu überprüfen, wurde die Wirkung von ROS auf humane Monozyten und daraus abgeleiteten DCs und Makrophagen untersucht. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass Monozyten eine hohe Sensitivität gegenüber oxidativem Stress aufweisen, was auf eine höhere Einzelstrangbruch-Rate zurückzuführen war. Ursache hierfür ist das Fehlen der BER-Proteine XRCC1, Ligase III und PARP-1. Die fehlende Expression dieser Proteine resultierte letztendlich in Monozyten in einem Defekt der BER und DNA-Einzelstrangbruchreparatur. rnDie Proteine XRCC1, Ligase III und PARP-1 sind auch Bestandteil des Apparats des B-NHEJ ('backup-non homologous end joining'), was auf eine Beeinträchtigung der Monozyten hinsichtlich der Prozessierung von Doppelstrangbrüchen (DSBs) schließen lässt. Zur Untersuchung dieser Vermutung, wurde die Wirkung von Ionisierender Strahlung ('ionizing radiation'; IR) auf Monozyten, DCs und Makrophagen bestimmt. Monozyten zeigten eine signifikant höhere Sensitivität gegenüber IR als DCs und Makrophagen, was auf eine erhöhte DSB-Rate in den Monozyten nach IR zurückzuführen war. Expressionsanalysen und ein DNA-PK-Aktivitäts-Assay zeigten zusätzlich, dass Monozyten keine DNA-PKcs, ein bedeutender Faktor des C-NHEJ, exprimieren. Somit haben Monozyten sowohl einen Defekt im B-NHEJ als auch im C-NHEJ und sind demnach nicht in der Lage, DSBs zu reparieren.rnAuch gegenüber dem Alkylanz und Chemotherapeutikum Temozolomid bewirken die Reparaturdefekte eine hohe Sensitivität der Monozyten. Zur Therapie von Hirntumoren werden neben der Operation, die Bestrahlung und Chemotherapie mit Temozolomid angewendet. Die hohe Sensitivität von Monozyten gegenüber IR und Temozolomid könnte eine Erklärung für die starke Immunsuppression bei einer derartigen Therapie sein.rn

Protein-Disassembly im Verlauf der endosomalen Prozessierung

Die Prozessierung von internalisierten Proteinantigenen und die Beladung von MHC Klasse II – Heterodimeren mit den prozessierten Proteinfragmenten in Antigen präsentierenden Zellen sind Schlüsselprozesse der antigenspezifischen Immunantwort. In dieser Arbeit wurden grundlegende Studien durchgeführt, um die Antigenprozessierung in Makrophagen und dendritischen Zellen auf molekularer Ebene zu untersuchen. Als Sonde für die Antigenprozessierung wurde das Modellprotein Ovalbumin verwendet. Dieses wurde hoch gereinigt und mit einem Fluoreszenzmarker versehen. In Kinetikexperimenten wurde gezeigt, dass unabhängig vom Aktivierungszustand der akzessorischen Zellen ein Großteil des intakten Ovalbumins in den Zellen persistiert. Der Abbau des Proteins beginnt in den späten Endosomen und führt zu einem distinkten 40kD Abbaufragment. Der weitere schrittweise Abbau des Proteins findet in den Lysosomen statt. Die Edmann – Sequenzierung des Fragmentes ergab, dass die initiale Spaltung des Ovalbumin in einem zweistufigen Prozess abläuft. Beide Prozessierungsschritte erfolgen schnell aufeinander. Der erste Abbauschritt generiert das dominante Ovalbumin – Epitop OVA323-339.LPS – Stimulation der KMMÆ hatte zur Folge, dass die gleichen in nicht stimulierten Zellen beobachteten Fragmente gebildet wurden, jedoch zu einem erheblich späteren Zeitpunkt. In Gegenwart der Proteinase – Inhibitoren Leupeptin und Pepstatin A war diese verzögerte Degradierung nicht zu beobachten. LPS induziert vermutlich weitere Enzyme, die an der Prozessierung von Ovalbumin beteiligte Proteinasen beeinträchtigen. Eine vollständige Hemmung des Abbaus konnte jedoch nicht erreicht werden.Mit Molecular Modelling –Studien wurde ein Molekülmodell des Ratten MHC Klasse II – Moleküls RT1.Bl entwickelt und dessen Bindungsspezifität untersucht. Wesentliche Eigenschaften der RT1.Bl – Peptid Interaktionen wurden ermittelt. Auf der Grundlage der berechneten Molekülmodelle wurde ein Wirkmechanismus für die durch DM-Moleküle katalysierte Peptidbeladung von RT1.Bl postuliert. Bei einer Kooperativität der Wasserstoffbrücken – Bindungen genügt die Lösung einer einzigen Wasserstoffbrücke zwischen Peptid und MHC Klasse II – Molekül, um die Dissoziation von schwach gebundenen Peptiden erheblich zu beschleunigen. Hochaffine Binder werden hierdurch jedoch nicht beeinflusst.

Comparative genomic sequencing analysis of a region in human chromosome 11p15.3, mouse chromosome 7 and analysis of the novel STK33, Stk33 gene

The comparative genomic sequence analysis of a region in human chromosome 11p15.3 and its homologous segment in mouse chromosome 7 between ST5 and LMO1 genes has been performed. 158,201 bases were sequenced in the mouse and compared with the syntenic region in human, partially available in the public databases. The analysed region exhibits the typical eukaryotic genomic structure and compared with the close neighbouring regions, strikingly reflexes the mosaic pattern distribution of (G+C) and repeats content despites its relative short size. Within this region the novel gene STK33 was discovered (Stk33 in the mouse), that codes for a serine/threonine kinase. The finding of this gene constitutes an excellent example of the strength of the comparative sequencing approach. Poor gene-predictions in the mouse genomic sequence were corrected and improved by the comparison with the unordered data from the human genomic sequence publicly available. Phylogenetical analysis suggests that STK33 belongs to the calcium/calmodulin-dependent protein kinases group and seems to be a novelty in the chordate lineage. The gene, as a whole, seems to evolve under purifying selection whereas some regions appear to be under strong positive selection. Both human and mouse versions of serine/threonine kinase 33, consists of seventeen exons highly conserved in the coding regions, particularly in those coding for the core protein kinase domain. Also the exon/intron structure in the coding regions of the gene is conserved between human and mouse. The existence and functionality of the gene is supported by the presence of entries in the EST databases and was in vivo fully confirmed by isolating specific transcripts from human uterus total RNA and from several mouse tissues. Strong evidence for alternative splicing was found, which may result in tissue-specific starting points of transcription and in some extent, different protein N-termini. RT-PCR and hybridisation experiments suggest that STK33/Stk33 is differentially expressed in a few tissues and in relative low levels. STK33 has been shown to be reproducibly down-regulated in tumor tissues, particularly in ovarian tumors. RNA in-situ hybridisation experiments using mouse Stk33-specific probes showed expression in dividing cells from lung and germinal epithelium and possibly also in macrophages from kidney and lungs. Preliminary experimentation with antibodies designed in this work, performed in parallel to the preparation of this manuscript, seems to confirm this expression pattern. The fact that the chromosomal region 11p15 in which STK33 is located may be associated with several human diseases including tumor development, suggest further investigation is necessary to establish the role of STK33 in human health.

Alkylantien induzierte Zytotoxizität, DNA-schadensinduzierte Reparaturkapazität und Apoptoseinduktion von Immunzellen

Monozyten und Monozyten-abgeleitete Dendritische Zellen (DCs) spielen eine bedeutende Rolle im Immunsystem. Da DCs bei der Tumorabwehr mitwirken, ist es wichtig, dass Monozyten als auch DCs sich gegenüber zytotoxischen Agenzien aus der Chemotherapie wehren können. Chemotherapeutika reagieren mit der DNA, jedoch die DNA-Reparaturkapazität von Monozyten und DCs wurde noch nicht untersucht. Dazu wurde die Sensitivität in Monozyten und DCs gegenüber verschiedene genotoxische Agenzien untersucht. Dabei wurde herausgefunden, dass Monozyten sensitiv auf methylierende Agenzien (MNNG, MMS und Temozolomid) reagieren und ein verstärktes Zellsterben und Apoptoseinduktion zeigen. Im Vergleich zu weiteren Zytostatika wie Fotemustin, Mafosfamid und Cisplatin reagierten Monozyten und DCs gleich sensitiv. Diese Ergebnisse weisen auf einen Defekt in der Reparatur von DNA-Methylierungsschäden in Monozyten hin. Da die Expression des Reparaturproteins O6-Methylguanin-DNA Methyltransferase (MGMT) in Monozyten höher war als in DCs und deren Inhibierung durch O6-Benzylguanin keinen Effekt auf die Sensitivität von Monozyten hatte, wurde der Reparaturweg der Basenexzisionsreparatur untersucht. Im Vergleich zu DCs waren die Monozyten unfähig die BER durchzuführen, welche durch Einzelzellgelelektrophorese gemessen wurde. Expressionsuntersuchungen ergaben, dass in Monozyten XRCC1 und Ligase IIIα fehlen im Vergleich zu DCs, Makrophagen, hämatopoetische Stammzellen und Lymphozyten, welche diese Proteine exprimieren. Diese Ergebnisse zeigen einen spezifischen DNA-Reparaturdefekt in einer bestimmten Blutzellpopulation. Durch den BER Defekt in Monozyten kann es durch methylierende Tumorwirkstoffe während einer Chemotherapie zur Depletion und zu einer abgeschwächten Immunantwort kommen.

Bedeutung der synovialen Strukturqualität für die Ernährung des Chondrozyten

In dieser Arbeit wird eine Einteilung der degenerativen strukturellen Veränderungen der Synovialmembran vorgestellt. Anhand der Kriterien Fibrosierung des Stromas, Rückgang des Gefäßnetzes, Auftreten von Hyalinose und chondroider Metaplasie mit und ohne Nachweis von CPPD Kristallen wurden Präparate der Synovialmembran von 59 Patienten mit Nachweis degenerativer strukturellen Veränderungen in 4 Stadien eingeteilt. rnHyalinose (Stadium 3) konnte in den untersuchten Schnitten nur relativ selten beobachtet werden, so dass am ehesten von einem Vorstadium zur chondroiden Metaplasie auszugehen ist. rnDie Verteilung der Erkrankungsdauer und des Alters in den verschiedenen Stadien lassen darauf schließen, dass höhere Stadien mit höherem Alter und längerer Erkrankungsdauer korrelieren. rnAus der vorhandenen Literatur ergeben sich Hinweise, welche Faktoren zu der Entstehung der strukturellen Veränderungen beitragen können: rnAus dem Netzwerk der Zytokine scheinen TGF-beta und die BMP’s an der Zunahme der Fibrose und an der Entstehung chondroider Metaplasie beteiligt zu sein. Makrophagen scheinen dabei eine wichtige Rolle zu spielen. Dies weist darauf hin, dass entzündliche und strukturelle Veränderungen miteinander vernetzt sind. rnBei der Entstehung der chondroiden Metaplasie kommen zusätzlich mechanische Einflüsse in Form von zyklischen Kompressionen als Einflussfaktor in Frage. rnDie Regulierung der Angiogenese ist noch zu wenig verstanden, um den Gefäßrückgang bei fortgeschrittenen strukturellen Veränderungen zu erklären. Erklärungsansätze sind zum einen zunehmende mechanische Schädigung bei zunehmender Inkongruenz der Gelenkflächen. Zum anderen könnte eine beginnende chondroide Metaplasie mit Expression von Chondromodulin I eine entscheidende Rolle spielen. rnInsgesamt muss man davon ausgehen, dass die zunehmenden strukturellen Veränderungen die Ernährung des Knorpels erschweren. Dabei ist an erster Stelle der Rückgang des Gefäßnetzes zu nennen. Dies erschwert nicht nur die Versorgung mit Nährstoffen, sondern auch den Abtransport von Stoffwechselprodukten. Ab einem gewissen Punkt ist aber auch davon auszugehen, dass die Funktion der Deckzellschicht beeinträchtigt wird. Wenn die Konzentration der Hyaluronsäure in der Synovia dadurch sinkt, kann dies durch eine vermehrte Permeabilität der Synovialmembran zum verstärkten Ausstrom von Wasser aus der Gelenkhöhle führen. Durch ein Ödem des umliegenden Gewebes kann dadurch der Blutfluss im Bereich des Gelenks zusätzlich vermindert werden. rnAuch die zunehmende Fibrosierung der Synovialmembran kann einen Einfluss auf die Permeabilität der Synovialmembran haben. Ob und in welchen Stadien der Veränderungen das einen relevanten Einfluss für die Ernährung der Chondrozyten hat, ist noch unklar.rn

In vivo consequences of AML1-ETO fusion protein expression for hematopoiesis

The t(8;21) (q22;q22) translocation fusing the ETO (also known as MTG8) gene on human chromosome 8 with the AML1 (also called Runx1 or CBFα) gene on chromosome 21 is one of the most common genetic aberrations found in acute myeloid leukemia (AML). This chromosomal translocation occurs in 12 % of de novo AML cases and in up to 40 % of the AML-M2 subtype of the French-American-British classification. To date, the in vivo function of aberrant AML1-ETO fusion protein expression has been investigated by several groups. However, in these studies, controversial results were reported and some key issues remain unknown. Importantly, the consequences of aberrant AML1-ETO expression for self-renewing hematopoietic stem cells (HSCs), multipotent hematopoietic progenitors (MPPs) and lineage-restricted precursors are not known. rn The aim of this thesis was to develop a novel experimental AML1-ETO in vivo model that (i) overcomes the current lack of insight into the pre-leukemic condition of t(8;21)-associated AML, (ii) clarifies the in vivo consequences of AML1-ETO for HSCs, MPPs, progenitors and more mature blood cells and (iii) generates an improved mouse model suitable for mirroring the human condition. For this purpose, a conditional tet on/off mouse model expressing the AML1-ETO fusion protein from the ROSA26 (R26) locus was generated. rn Aberrant AML1-ETO activation in compound ROSA26/tetOAML1-ETO (R26/AE) mice caused high rates of mortality, an overall disruption of hematopoietic organs and a profound alteration of hematopoiesis. However, since the generalized activity of the R26 locus did not recapitulate the leukemic condition found in human patients, it was important to restrict AML1-ETO expression to blood cell lineages. Therefore, bone marrow cells from non-induced R26/AE mice were adoptively transplanted into sublethal irradiated RAG2-/- recipient mice. First signs of phenotypical differences between AML1-ETO-expressing and control mice were observed after eight to nine months of transgene induction. AML1-ETO-expressing mice showed profound changes in hematopoietic organs accompanied by manifest extramedullary hematopoiesis. In addition, a block in early erythropoiesis, B- and T-cell maturation was observed and granulopoiesis was significantly enhanced. Most interestingly, conditional activation of AML1-ETO in chimeric mice did not increase HSCs, MPPs, common lymphoid precursors (CLPs), common myeloid progenitors (CMPs) and megakaryocyte-erythrocyte progenitors (MEPs) but promoted the selective amplification of granulocyte-macrophage progenitors (GMPs). rn The results of this thesis provide clear experimental evidence how aberrant AML1-ETO modulates the developmental properties of normal hematopoiesis and establishes for the first time that AML1-ETO does not increase HSCs, MPPs and common lineage-restricted progenitor pools but specifically amplifies GMPs. The here presented mouse model not only clarifies the role of aberrant AML1-ETO for shaping hematopoietic development but in addition has strong implications for future therapeutic strategies and will be an excellent pre-clinical tool for developing and testing new approaches to treat and eventually cure AML.rn

Assessing the role of sCYLD and Bcl-3 in immune regulation

CYLD is a deubiquitinating enzyme, which negatively regulates NF-κB signaling by removing Lys63-linked polyubiquitin chains from its substrates. In mice, there are two variants of CYLD: full-length CYLD (FL-CYLD) and its short splice variant sCYLD. sCYLD lacks the NEMO and TRAF2 binding sites and CYLDex7/8 mice, which have been generated in our laboratory, overexpress sCYLD in the absence of the full length transcript. In this thesis, we show that bone marrow-derived macrophages (BMDCs) overexpressing sCYLD display a hyperactive phenotype. They have increased levels of the inflammatory cytokines IL-6 and TNFα, have exaggerated stimulatory capacity and fail to induce tolerance in in vivo experiments. CYLDex7/8 BMDCs have increased levels of nuclear Bcl-3, which we could show to be directly induced by sCYLD expression. NF-κB signaling was markedly upregulated in CYLDex7/8 BMDCs.rnBcl-3 overexpressing BMDCs with normal CYLD expression, however, were not hyperactive, suggesting that Bcl-3 overexpression is not sufficient for causing the observed phenotype. Taken together we propose a model in which the exclusive overexpression of sCYLD with high nuclear levels of Bcl-3 in BMDCs is accompanied by an increased NF-κB activation, resulting in a hyperactive phenotype.rnWe further analyzed macrophages overexpressing sCYLD using the LysMcre CyldFL/FL strain, but could not detect differences in activation marker expression, cytokine secretion or iNOS production. LysMcre CyldFL/FL mice immunized with MOG35-55 peptide showed a more severe course of experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE), which could not be explained by enhanced levels of MHC class II on CNS-resident macrophages and microglia or increased T cell infiltration.rnMice overexpressing Bcl-3 in T cells develop spontaneous colitis. They have less peripheral memory/effector T cells and less Th1 cells, whereas Th17 numbers are normal. Naïve T cells overexpressing Bcl-3 show defects in in vitro differentiation to the Th1 or Th17 fate. CD4+ T cells overexpressing Bcl-3 show enhanced survival capacity in in vitro culture, but have a defect in proliferative capacity when stimulated in vitro or when adoptively transferred into lymphopenic hosts.

Die funktionelle Bedeutung von MSP und Lactadherin im Rahmen der Atherosklerose

Im Rahmen dieser Arbeit wurde der Einfluss zweier möglicher Biomarker auf die Atherosklerose untersucht.rnMilk fat globule-EGF factor 8 (MFG-E8, Lactadherin) ist ein Glycoprotein, das vornehmlich von Makrophagen, glatten Muskelzellen und Endothelzellen sezerniert wird. MFG-E8-/--Mäuse zeigen vermehrt apoptotische Zellen in der atherosklerotischen Plaque, verstärkte Inflammationszeichen und vergrößerte Läsionen. In situ-Hybridisierung und Immunfluoreszenz zeigen eine starke Lactadherin-Expression in den Schaumzellen atherosklerotischer Plaques von Apo E-/-, Apo E-/-/GPx 1-/-und LDLR-/- Mäusen, vor allem in der Nähe des Lipid Core. Dort kolokalisiert Lactadherin mit dem Makrophagenmarker CD 68 und dem Chemokin Fraktalkin, das die MFG-E8 Sekretion stimuliert und so die Phagocytose forciert. Untersuchungen mittels RTD-PCR ergaben, dass Peritonealmakrophagen der Genotypen Apo E-/-, Apo E-/-/GPx 1-/- und GPx 1-/-, deren Gemeinsamkeit eine höhere Empfindlichkeit gegenüberrnoxidativem Stress ist, mehr Lactadherin exprimieren als andere Genotypen (B6, LDLR-/-). Die Inkubation muriner oder humaner Makrophagen mit oxLDL und eLDL hat keinen Einfluss auf die Expression der MFG-E8 mRNA. Der Kontakt mit apoptotischer Zellen hingegen erhöht die Expression signifikant. Lactadherin ist entscheidend für die effektive Phagozytose apoptotischer Zellen in der atherosklerotischen Läsion. Seine Expression wird vermutlich durch die Apoptose in der Nähe liegender Zellen und das verstärkte Vorkommen von ROS reguliert. Macrophage stimulating protein (MSP) übt Einfluss auf Migration, Proliferation und Phagocytose von Makrophagen aus. Seine Beteiligung an inflammatorischen Vorgängen und der Karzinogenese ist intensiv untersucht worden, nicht jedoch der Einfluss auf die Atherosklerose. Es ist bekannt, dass der SNP rs3197999 mit chronisch entzündlichen Darmerkrankungen (CED) assoziiert ist. Zudem geht er vermutlich mit einem erniedrigten Atheroskleroserisiko einher. Der Polymorphismus c2078t hat den Aminosäureaustausch R689C zur Folge. Rekombinant erzeugtes, mutantes und wildtypisches MSP induziert Migration und Proliferation bei THP-1-Makrophagen. MSPmut vermittelt dies jedoch wesentliche effektiver als MSPwt. Apoptose hingegen wird durch keine der Formen induziert. R689C führt zu einem “gain of function” des MSP-Proteins in Bezug auf die Proliferations- und Migrationsfähigkeit von Makrophagen und verändert vermutlich deren Cytokinfreisetzung. Dies führt möglicherweise zu einer erhöhten Phagocytoseeffizienz in der atherosklerotischen Läsion (erniedrigtes Atherosklerose-Risiko), und zu einer aberranten immunologischen Reaktion im Rahmen der CED (erhöhtes CED-Risiko).

Untersuchung von T-Zell-vermittelten Immunantworten in der murinen und humanen kutanen Leishmaniasis

Für die Ausheilung von L. major-Infektionen ist eine effektive Th1-/Tc1-Antwort unerlässlich. Dennoch sind bis heute nicht alle Mechanismen der schützenden Immunabwehr beim Menschen und in der Maus endgültig geklärt. Deshalb bestand das Ziel der vorliegenden Arbeit darin, Th1-/Tc1-Antworten und damit die Schnittstelle zwischen angeborenem und adaptivem Immunsystem eingehender zu untersuchen. Für diesen Ansatz wurde zunächst der Einfluss des genetischen Hintergrundes auf den Verlauf der Infektion anhand von BALB/c- und C57BL/6-Zellen analysiert. Als entscheidender Faktor für Heilung und Suszeptibilität wurde mit Hilfe von Knochenmarkschimären die Herkunft der T und/oder B Zellen identifiziert. Erst die Aktivierung durch Th1-/Tc1-Zellen versetzt L. major-infizierte Makrophagen in die Lage, die intrazellulären Parasiten abzutöten. In diesem Aktivierungsprozess spielt die TNF-induzierte Signalweiterleitung über den TNF-Rezeptor 1 (TNF-R1) eine wichtige Rolle. TNF-R1 ist mit dem Signalmolekül FAN assoziiert. In dieser Arbeit konnte anhand von Mäusen, denen FAN fehlt, die Involvierung dieses Moleküls in der Induktion eines Th1-Zytokinsprofils und in der Kontrolle der Parasitenzahl sowie der lokalen Begrenzung der Infektion gezeigt werden. Weiterhin wurde unter Verwendung immundefizienter Mäuse die Realisierbarkeit eines PBMC-Transfermodells geprüft. Ein solches wird zur Validierung an Mäusen gewonnener Erkenntnisse und als präklinisches Testsystem der humanen kutanen Leishmaniasis dringend benötigt. In allen getesteten Stämmen ließ sich durch den Transfer humaner PBMC die L. major-Infektion beeinflussen. Humane CD4+ und CD8+ T-Zellen waren an den Infektionsstellen präsent und es konnten antigenspezifische Immunreaktionen nnachgewiesen werden. Das PBMC-Transfermodell konnte durch die Transplantation humaner Haut auf immundefiziente Mäuse zusätzlich entscheidend verbessert werden. In diesen Transplantaten ließen sich L. major-Infektionen etablieren und durch zusätzlichen Transfer von PBMC die Zahl humaner CD45+ Zellen an der Infektionsstelle deutlich steigern. In ihrer Gesamtheit trägt die vorliegende Arbeit wesentlich zum Verständnis der Determinanten von Heilung und Suszeptibilität der kutanen Leishmaniasis bei und zeigt neue Ansatzpunkte für eine Beeinflussung des Krankheitsverlaufes auf. Die Etablierung eines präklinischen Testmodells der humanen Leishmaniasis ist entscheidend, um das Wissen über die murine Leishmaniasis auf die humane Erkrankung zu übertragen. So kann dem dauerhaften Problem der Entwicklung von Vakzinen an Mäusen, die keine Wirksamkeit gegen die humane Erkrankung zeigen, begegnet werden. Ein vollständig etabliertes Modell wird es ermöglichen, der humanen Erkrankung zugrundeliegende Mechanismen zu untersuchen und Patienten-spezifisch aber auch allgemeingültig Vakzinierungs-Ansätze und Therapien unter experimentellen Bedingungen zu testen.

Pathogenetische Bedeutung der Glutathionperoxidase-1 in der arteriellen Gefäßwand

Die antioxidative Aktivität des Enzyms Glutathionperoxidase-1 (GPx-1) schützt vor Atherosklerose und ihren Folgeerkrankungen. In einer Vorstudie konnten wir zeigen, dass der Mangel an GPx-1 die Atheroskleroseentwicklung in Apolipoprotein E defizienten (ApoE-/-) Mäusen beschleunigt und modifiziert. Allerdings sind die Verteilung der GPx-1 in atherosklerotischen Läsionen und die Mechanismen für den erhöhten Makrophagengehalt in der Läsion noch nicht geklärt. Deshalb haben wir (1) die in-situ Expression der GPx-Isoformen in atherosklerotischen Läsionen von GPx-1-/-ApoE-/- und ApoE-/- Mäusen und (2) den Einfluss der GPx-1 Defizienz auf die Schaumzellbildung und Proliferation der Peritonealmakrophagen in ApoE-/- Mäusen untersucht. Die GPx-1-/-ApoE-/- und ApoE-/- Weibchen wurden für 6 und 12 Wochen auf einer atherogenen „Western-type“ Diät gehalten. Die in situ-Hybridisierung zeigte, dass die verschiedenen Isoformen der GPx (GPx-1, GPx-3, GPx-4) vorwiegend in Makrophagen, nicht jedoch in glatten Muskelzellen der atherosklerotischen Läsionen von ApoE-/- Mäusen exprimiert wurden. Für die in vitro Untersuchungen wurden 5 Monate alte, GPx-1 defiziente und Wildtyp-Mäuse, gehalten auf Normaldiät, verwendet. Die Öl-Rot-O Färbung zeigte, dass die GPx-1 Defizienz die OxLDL (oxidiertes LDL) - und E-LDL (enzymatisch modifiziertes LDL) - induzierte Schaumzellbildung förderte. Darüber hinaus war die OxLDL-induzierte Cholesterinakkumulation (zellulärer Cholesterinester/ Cholesterin-Gehalt) in GPx-1 defizienten Makrophagen verstärkt, sodass ein Mangel an GPx-1 die Aufnahme von OxLDL durch Monozyten und damit die Umwandlung in Schaumzellen beschleunigt. Hinsichtlich der Proliferation zeigte sich, dass MCSF (Macrophage Colony-Stimulating Facotr) ein stärkerer Stimulus als OxLDL ist. Ein Mangel an GPx-1 fördert die Proliferation zusätzlich. Daran ist die ERK1/2 (extracellular-signal regulated kinase 1/2) - Kaskade beteiligt, denn es wurde eine schnelle Phosphorylierung der ERK1/2-Kaskade durch MCSF und/oder OxLDL nachgewiesen. Entsprechend reduzieren ERK1/2-Inhibitoren die proliferative Aktivität der Makrophagen. Die Hemmung der p38-MAPK (p38 mitogen-activated protein kinase) führt zur vermehrten Proliferation und bei gleichzeitig verringerter Caspase-3/7 Aktivität der Makrophagen unabhängig von der Expression der GPx-1. Ein Mangel an GPx-1 hat auch keinen Einfluss auf die MCSF-vermittelte Aktivierung der p38-MAPK und JNK (c-Jun N-terminal kinase). Zusammenfassend läßt sich feststellen, dass die GPx-1-Defizienz einen signifikanten Einfluss auf die Schaumzellbildung und Proliferation von Makrophagen hat, was zur Beschleunigung der Atherosklerose und zu vermehrter Zellularität der entstehenden atherosklerotischen Läsionen führt. Die Proliferation wird über den ERK1/2 Signal-transduktionsweg positiv und über den p38-MAPK Weg negativ reguliert, wobei die ERK1/2-Kaskade empfindlich gegenüber oxidativem Stress bei GPx-1-Defizienz ist.

Leishmania major parasites and their interaction with human macrophages

First both life stages of Leishmania major (L. major) FEBNI parasites, promastigotes as well as amastigotes, were characterized. We found that the virulence marker GP63 and cysteine peptidase b (Cpb) were higher expressed by axenic amastigotes as compared to promastigotes. In addition to the L. major FEBNI strain, we applied and successfully modified our novel in vitro method to generate axenic amastigotes of the L. major Friedlin and 5ASKH strains. Interestingly, these L. major strains needed another temperature to be transferred into amastigotes in the axenic culture system. Investigating apoptosis mechanisms in both parasite life stages of L. major FEBNI we found both ROS dependent and independent cell death mechanisms. Focusing on promastigote and amastigote interaction with pro-inflammatory (MF I) and anti-inflammatory (MF II) macrophages we found amastigotes to be more infective as compared to promastigotes. Moreover, we could demonstrate that pro-inflammatory MF I were less susceptible to infection than anti-inflammatory MF II. Finally we investigated parasite stage-specific responses of MF I + II and their defense mechanisms against L. major. Using knockdown techniques for primary human macrophages we identified a new mechanism enabling intracellular killing of promastigotes inside MF I. This mechanism depends on the antimicrobial molecule cathelicidin (LL-37).

Einfluss Zelltod-inhibierender Proteine des murinen Cytomegalovirus auf die Initiation der antiviralen CD8 T-Zellantwort

Die Inhibition des programmierten Zelltods ist ein essentieller Faktor der viralen Replikationsfähigkeit. Das murine Cytomegalovirus kodiert deshalb für verschiedene Zelltod-inhibierende Gene, um dem programmierten Zelltod zu entgehen bis die Virusproduktion abgeschlossen ist. Da die Expression des viralen anti-apoptotischen Gens M36 infizierte Makrophagen vor der Apoptose schützt (Menard et al., 2003), wurde in der vorliegenden Arbeit unter Verwendung der Deletionsmutante mCMV-ΔM36 (ΔM36) der Einfluss von Apoptose auf das Priming Epitop-spezifischer CD8 T-Zellen untersucht.rnInteressanterweise waren die Frequenzen mCMV-spezifischer CD8 T-Zellen nach Infektion mit ΔM36 für alle getesteten Epitope sowohl im Haplotyp H-2d als auch im Haplotyp H-2b deutlich erhöht. Zusätzlich konnte mit Hilfe der mCMV-ORF-Library eine Verbreiterung des CD8 T-Zellepitop-Repertoire nach Infektion mit ΔM36 nachgewiesen werden, was neben der quantitativen auch eine qualitative Steigerung des CD8 T-Zell-Primings aufzeigt.rnIn der funktionellen Revertante ΔM36-FADDDN wird die anti-apoptotische Funktion durch eine dominant-negative Form des zellulären Adapterproteins FADD (FADDDN) substituiert (Cicin-Sain et al., 2008), die das Apoptose-Signaling verhindert. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass die Expression von FADDDN nicht nur den Apoptose-Phänotyp wieder revertiert, sondern auch die Verbesserung des CD8 T-Zell-Primings aufhebt. Diese Beobachtung belegt eindeutig, dass das verbesserte CD8 T-Zell-Priming auf einer verstärkten Apoptose-Induktion beruht.Bemerkenswerterweise konnte das verbesserte Priming auch nach Deletion des anti-nekroptotischen Gens M45 nachgewiesen werden. So konnte nach Infektion mit mCMV-M45-BamX (M45-BamX) (Brune et al., 2001) gezeigt werden, dass auch die Induktion der Nekroptose zu einem verbesserten CD8 T-Zell-Priming sowie zu einer Verbreiterung des CD8 T-Zellepitop-Repertoires führt.Nach Infektion von Cross-Priming-defizienten 3d-Mäusen (Tabeta et al., 2006) konnte eine Steigerung mCMV-spezifischer CD8 T-Zell-Frequenzen in Abwesenheit von M36 oder M45 nicht beobachtet werden. Dieser Befund lässt auf ein erhöhtes Cross-Priming von CD8 T-Zellen durch ΔM36 oder M45-BamX infolge einer verstärkten Induktion des programmierten Zelltods schließen.rnIn der vorliegenden Arbeit konnte erstmals gezeigt werden, dass die Inhibition des programmierten Zelltods durch die mCMV-Gene M36 und M45 das CD8 T-Zell-Priming limitiert. Somit fördern virale Zelltod-inhibierende Gene die virale Replikationsfähigkeit, indem sie die Virusproduktion per se in der individuellen Zelle steigern und zusätzlich die Immunkontrolle reduzieren, was wiederum eine verbesserte Dissemination in vivo ermöglicht.

Tissue engineering strategies for biomaterial-based anticancer drug delivery and enhancement of angiogenesis in tumor-resected bone

Patienten, die an Osteosarkom leiden werden derzeit mit intravenös applizierten krebstherapeutischen Mitteln nach Tumorresektion behandelt, was oftmals mit schweren Nebenwirkungen und einem verzögerten Knochenheilungsprozess einhergeht. Darüber hinaus treten vermehrt Rezidive aufgrund von verbleibenden neoplastischen Zellen an der Tumorresektionsstelle auf. Erfolgreiche Knochenregeneration und die Kontrolle von den im Gewebe verbleibenden Krebszellen stellt eine Herausforderung für das Tissue Engineering nach Knochenverlust durch Tumorentfernung dar. In dieser Hinsicht scheint der Einsatz von Hydroxyapatit als Knochenersatzmaterial in Kombination mit Cyclodextrin als Medikamententräger, vielversprechend. Chemotherapeutika können an Biomaterial gebunden und direkt am Tumorbett über einen längeren Zeitraum freigesetzt werden, um verbliebene neoplastische Zellen zu eliminieren. Lokal applizierte Chemotherapie hat diverse Vorteile, einschließlich der direkten zytotoxischen Auswirkung auf lokale Zellen, sowie die Reduzierung schwerer Nebenwirkungen. Diese Studie wurde durchgeführt, um die Funktionsfähigkeit eines solchen Arzneimittelabgabesystems zu bewerten und um Strategien im Bereich des Tissue Engineerings zu entwickeln, die den Knochenheilungsprozess und im speziellen die Vaskularisierung fördern sollen. Die Ergebnisse zeigen, dass nicht nur Krebszellen von der chemotherapeutischen Behandlung betroffen sind. Primäre Endothelzellen wie zum Beispiel HUVEC zeigten eine hohe Sensibilität Cisplatin und Doxorubicin gegenüber. Beide Medikamente lösten in HUVEC ein tumor-unterdrückendes Signal durch die Hochregulation von p53 und p21 aus. Zudem scheint Hypoxie einen krebstherapeutischen Einfluss zu haben, da die Behandlung sensitiver HUVEC mit Hypoxie die Zellen vor Zytotoxizität schützte. Der chemo-protektive Effekt schien deutlich weniger auf Krebszelllinien zu wirken. Diese Resultate könnten eine mögliche chemotherapeutische Strategie darstellen, um den Effekt eines zielgerichteten Medikamenteneinsatzes auf Krebszellen zu verbessern unter gleichzeitiger Schonung gesunder Zellen. Eine erfolgreiche Integration eines Systems, das Arzneimittel abgibt, kombiniert mit einem Biomaterial zur Stabilisierung und Regeneration, könnte gesunden Endothelzellen die Möglichkeit bieten zu proliferieren und Blutgefäße zu bilden, während verbleibende Krebszellen eliminiert werden. Da der Prozess der Knochengeweberemodellierung mit einer starken Beeinträchtigung der Lebensqualität des Patienten einhergeht, ist die Beschleunigung des postoperativen Heilungsprozesses eines der Ziele des Tissue Engineerings. Die Bildung von Blutgefäßen ist unabdingbar für eine erfolgreiche Integration eines Knochentransplantats in das Gewebe. Daher ist ein umfangreich ausgebildetes Blutgefäßsystem für einen verbesserten Heilungsprozess während der klinischen Anwendung wünschenswert. Frühere Experimente zeigen, dass sich die Anwendung von Ko-Kulturen aus humanen primären Osteoblasten (pOB) und humanen outgrowth endothelial cells (OEC) im Hinblick auf die Bildung stabiler gefäßähnlicher Strukturen in vitro, die auch effizient in das mikrovaskuläre System in vivo integriert werden konnten, als erfolgreich erweisen. Dieser Ansatz könnte genutzt werden, um prä-vaskularisierte Konstrukte herzustellen, die den Knochenheilungsprozess nach der Implantation fördern. Zusätzlich repräsentiert das Ko-Kultursystem ein exzellentes in vitro Model, um Faktoren, welche stark in den Prozess der Knochenheilung und Angiogenese eingebunden sind, zu identifizieren und zu analysieren. Es ist bekannt, dass Makrophagen eine maßgebliche Rolle in der inflammatorisch-induzierten Angiogenese spielen. In diesem Zusammenhang hebt diese Studie den positiven Einfluss THP-1 abgeleiteter Makrophagen in Ko-Kultur mit pOB und OEC hervor. Die Ergebnisse zeigten, dass die Anwendung von Makrophagen als inflammatorischer Stimulus im bereits etablierten Ko-Kultursystem zu einer pro-angiogenen Aktivierung der OEC führte, was in einer signifikant erhöhten Bildung blutgefäßähnlicher Strukturen in vitro resultierte. Außerdem zeigte die Analyse von Faktoren, die in der durch Entzündung hervorgerufenen Angiogenese eine wichtige Rolle spielen, eine deutliche Hochregulation von VEGF, inflammatorischer Zytokine und Adhäsionsmoleküle, die letztlich zu einer verstärkten Vaskularisierung beitragen. Diese Resultate werden dem Einfluss von Makrophagen zugeschrieben und könnten zukünftig im Tissue Engineering eingesetzt werden, um den Heilungsprozess zu beschleunigen und damit die klinische Situation von Patienten zu verbessern. Darüber hinaus könnte die Kombination der auf Ko-Kulturen basierenden Ansätze für das Knochen Tissue Engineering mit einem biomaterial-basierenden Arzneimittelabgabesystem zum klinischen Einsatz kommen, der die Eliminierung verbliebener Krebszellen mit der Förderung der Knochenregeneration verbindet.