Comparative genomic sequencing analysis of a region in human chromosome 11p15.3, mouse chromosome 7 and analysis of the novel STK33, Stk33 gene

The comparative genomic sequence analysis of a region in human chromosome 11p15.3 and its homologous segment in mouse chromosome 7 between ST5 and LMO1 genes has been performed. 158,201 bases were sequenced in the mouse and compared with the syntenic region in human, partially available in the public databases. The analysed region exhibits the typical eukaryotic genomic structure and compared with the close neighbouring regions, strikingly reflexes the mosaic pattern distribution of (G+C) and repeats content despites its relative short size. Within this region the novel gene STK33 was discovered (Stk33 in the mouse), that codes for a serine/threonine kinase. The finding of this gene constitutes an excellent example of the strength of the comparative sequencing approach. Poor gene-predictions in the mouse genomic sequence were corrected and improved by the comparison with the unordered data from the human genomic sequence publicly available. Phylogenetical analysis suggests that STK33 belongs to the calcium/calmodulin-dependent protein kinases group and seems to be a novelty in the chordate lineage. The gene, as a whole, seems to evolve under purifying selection whereas some regions appear to be under strong positive selection. Both human and mouse versions of serine/threonine kinase 33, consists of seventeen exons highly conserved in the coding regions, particularly in those coding for the core protein kinase domain. Also the exon/intron structure in the coding regions of the gene is conserved between human and mouse. The existence and functionality of the gene is supported by the presence of entries in the EST databases and was in vivo fully confirmed by isolating specific transcripts from human uterus total RNA and from several mouse tissues. Strong evidence for alternative splicing was found, which may result in tissue-specific starting points of transcription and in some extent, different protein N-termini. RT-PCR and hybridisation experiments suggest that STK33/Stk33 is differentially expressed in a few tissues and in relative low levels. STK33 has been shown to be reproducibly down-regulated in tumor tissues, particularly in ovarian tumors. RNA in-situ hybridisation experiments using mouse Stk33-specific probes showed expression in dividing cells from lung and germinal epithelium and possibly also in macrophages from kidney and lungs. Preliminary experimentation with antibodies designed in this work, performed in parallel to the preparation of this manuscript, seems to confirm this expression pattern. The fact that the chromosomal region 11p15 in which STK33 is located may be associated with several human diseases including tumor development, suggest further investigation is necessary to establish the role of STK33 in human health.

In der vorliegenden Arbeit wurde eine vergleichende Genomanalyse der humanen Chromosomenregion 11p15.3 mit dem homologen Bereich des murinen Chromosoms 7 zwischen den Genen ST5 und LMO1 durchgeführt. 158.201 Basenpaare der Maus wurden sequenziert und mit dem syntänen Bereich im Mensch-Genom verglichen, der zum Teil selbst sequenziert wurde und zum Teil in den Datenbanken verfügbar war. Die analysierten Bereiche weisen die typischen strukturellen Eigenschaften eines eukaryotischen Genoms auf, z.B. im Hinblick auf (G+C)-Gehalt und repetitive Sequenzen. Innerhalb dieser Region wurde ein für eine Serin/Threonin-Proteinkinase kodierendes neues Gen gefunden, das nach den Regeln des Human Genome Organisation Nomenclature Committee STK33 in Mensch und Stk33 in Maus genannt wurde. Der Nachweis dieses Gens zeigt die Effektivität der vergleichenden Genomanalyse-Strategie. Schwache Genvorhersage-Ergebnisse in der genomischen Sequenz der Maus wurden durch vergleichende Analyse mit der unvollständigen Sequenz des menschlichen Genoms korrigiert. Daraus konnten die vollständigen STK33/Stk33-Transkripte erschlossen werden

die durch Laborexperimente bestätigt wurden. Phylogenetische Analysen zeigen, dass STK33/Stk33 zu der Calcium/Calmodulin-abhängigen Protein-Kinasen Gruppe gehört und eventuell ein Novum der Chordaten ist. Das Gen scheint unter reinigender Selektion, ein Bereich sogar unter starker positiver Selektion zu evolvieren. Beide Versionen der Serin/Threonin-Kinase-33 in Mensch und Maus bestehen aus siebzehn Exonen, die hoch konserviert in den kodierenden Bereichen vorliegen, allen voran die für die Kinase-Domäne. Auch die Exon/Intron-Struktur ist in den kodierenden Bereichen zwischen Mensch und Maus gut konserviert. Der Nachweis der Expression des Gens wird durch Einträge in den EST-Datenbanken unterstützt und wurde in vivo durch Isolierung spezifischer Transkripte aus Gesamt-RNA des menschlichen Uterus und aus mehreren murinen-Geweben komplett bestätigt. Es wurden starke Hinweise auf differentielles Spleißen gefunden, was eventuell für gewebsspezifische Transkriptions-Startpunkte und verschiedene Protein-N-termini sprechen könnte. RT-PCR und Hybridisierungs-Experimente beweisen, dass STK33/Stk33 in nur wenigen Geweben und in relativ geringen Mengen exprimiert wird. STK33 ist in einigen Tumor-Geweben herunterreguliert, insbesondere in Ovarial-Tumoren. RNA in situ Hybridisierungs-Experimente mit Maus-spezifischen Sonden zeigen, dass Stk33 in teilenden Zellen aus Lungengewebe und des Germinalepithels aktiv ist und möglicherweise auch in Nieren- und Lungen-Makrophagen. Erste Tests mit Antikörpern, die in dieser Arbeit entworfen wurden, bestätigen dieses Expressionsmuster. Die Tatsache, dass der chromosomale Bereich 11p15, wo STK33 lokalisiert ist, mit mehreren menschlichen Krankheiten inklusive Tumorentwicklung in Verbindung gebracht wird, zeigt deutlich, dass weitere Untersuchungen nötig sind, um den Zusammenhang von STK33 mit der menschlichen Gesundheit zu klären.