Frankia的REP-PCR、RAPD-PCR鉴定及遗传多样性研究

本文采用溶菌酶法、CTAB法、微波法及CTAB+微波法等4种方法进行Frankia菌Cp11基因组DNA的提取。结果表明四种方式均可行，但以CTAB法及微波法最为有效。提取方法与REP-PCR带型间关系的研究表明，方法上的差异不会影响到REP-PCR带型的变化。对14株Frankia菌株作REP-PCR分析，并对之进行比较分类，证明REP-PCR方法不但能实现菌株间的差异鉴别，还能有效地进行Frankia菌的分类。这一结果与DNA同源相关性所得的分类结果具有良好的相关性。选用20个随机引物，对分自2个分类接种群的8株Frankia纯培养的总DNA进行随机扩增。其中引物OPW15和OPW16能扩增得到较为稳定的RAPD图谱。扩增产物分子量大都分布在0.5-4Kb之间。从稳定的RAPD扩增图谱看，Frankia菌间存在有丰富的遗传多样性；在选定适当引物情况下，能依据共同带型将Frankia菌化归为同一分类接种群。

云南旱冬瓜共生固氮放线菌Frankia基因多样性研究

本文研究了地理位置、海拔、坡向、树龄和林型与旱冬瓜共生Frankia的关系，同时研究了用旱冬瓜根瘤接种其它放线菌根植物后，Frankia的16S rRNA基因的变化。结果发现：1.云南旱冬瓜共生Frankia存在丰富的基因多样性，云南14个市县旱冬瓜的共生Frankia存在7种基因类型，其香农维纳指数为2.6395nit。 2.云南旱冬瓜共生Frankia的基因多样性与纬度有一定的关系，而与经度关系不密切。3.在不同基因型的Frankia中，有的对海拔适应范围较广，有的较窄。4.地理位置和海拔属于大环境，它们形成了云南旱冬瓜共生Frankia的主要基因类型，而海拔、坡向、树龄属于小环境，它们形成云南省旱冬瓜共生Frankia亚基因类型。5. Frankia的基因多样性是生态适应和生态进化共同作用结果。6.滇中和滇西是云南旱冬瓜共生Frankia的两个分布中心和多样化中心，它们向南扩展后Frankia基因多样性降低。7.Frankia基因多样性呈现出地理马赛克现象，而不是地理镶嵌。8.在云南，旱冬瓜中共生的Frankia是共生于其它放线菌根植物的种子储备库。本文提出应该对丰富的Frankia基因多样性进行保护，建立云南旱冬瓜与共生Frankia的数据库；提出进一步研究快速检测旱冬瓜-Frankia和不同基因型Frankia的分子探针研究的构想。

植物根瘤内Frankia生物多样性的研究

建立了一种简捷、快速植物根瘤内痕量FrankiaDNA的提取方法，经过东北的沙棘、色赤杨、毛赤杨和云南的冬赤杨根瘤的瘤内痕量FrankiaDNA及体外培养的Frankia菌株DNA提纯，并用于酶切和PCR，获满意结果.首次应用RAPD（RandomAmplifiedPolymorphicDNA）与ARDRA（AmplifiedRibosomalDNARestrictionAnalysis）方法，直接扩增中国云南、东北地区赤杨属三种植物和沙棘属一种植物根瘤内的FrankiaDNA，所获指纹图谱揭示了其丰富的生物多样性.研究结果显示，与同属不同种植物（Alnus.tinctoriaSarg和Alnus.hirsuta）结瘤的Frankia，可有相同指纹图谱;同种植物（Alnus.nepalensisDon或Hippophae.rhamnoides）瘤内的Frankia指纹图谱可明显不同.瘤内Frankia有丰富的生物多样性，并且这种Frankia多样性可能与样品采集地点、地势、海拔高度等有关.

rep-PCR对赤杨根瘤内局Frankia菌基因多样性研究

本文应用重复基因外回纹序列rep-PCR方法直接扩增长日山三种不同赤杨和云南不同地区早冬瓜根瘤内的Frankia菌基因，所获得的REP指纹图谱揭示Frankia菌具有丰富的基因多样性。研究结果表明Frankia菌多样性随地域，海拔，坡问不同而变：多样性指数与自然选抒）玉力大小成正相关：自然选择压力是产生和保持Frankia菌基因多样性的重要因子。同时发现Frankia菌基因型与地域有紧密关系：所观察的云南各地区中，感染高黎贡山旱冬瓜的Frankia菌基因多样性最为丰富。推测与高黎贡山旱冬瓜共生的Frankia可能作为种储备库，为其它地区的寄主植物提供了祖先菌株。在对长白山三种赤杨（东北赤杨，西伯利亚赤杨和色赤杨）根瘤内几百游殆菌基因多样性考察过程中发现，Frankia菌基因类型与寄主赤杨种型关系密切。同时海拔对感染东北赤杨的Frankia菌基因多样性也有一定影响。感染西伯利亚赤杨和色赤杨的Frankia菌享有相同的基因型，可能有较近的亲缘关系。

云南横断山与吉林长白山赤杨根瘤内Frankia菌遗传多样性

本文应用nifD-nifK IGS及16S-23S rDNAIGSPCR-RFLP方法，系统研究了分布于云南横断山的旱冬瓜以及吉林长白山的西伯利亚赤杨、色赤杨和东北赤杨根瘤内Frankia菌的遗传多样性。该研究可加深对Frankia菌起源与进化的认识，并为保护和利用这一固氮共生资源提供科学依据。从113株赤杨的根瘤样品中共检测到48种基因型的Frankia菌株。首次确切报道了自然条件下不同基因型Frankia菌可与同一宿主植株同时共生，并且这种混乱性在横断山区普遍存在。通过对Frankia菌群体遗传结构的分析，查明云南省横断山旱冬瓜Frankia菌群体内遗传变异水平由高到低的顺序是苍山群体、高黎贡山群体、鸡足山群体、来凤山群体和无量山群体。酶切带型9为云南横断山旱冬瓜Frankia菌群体中最古老的类型；大部分（75.63％）遗传变异发生在Frankia菌的各群体内，同一气候区的Frankia菌群体有较近的亲缘关系。旱冬瓜Fran辰a菌遗传多样性特点与横断山气候特征及冰川运动历史密切相关。宿主赤杨的进化地位不同，其共生Frankia菌的群体遗传多样性水平也不同。古老的旱冬瓜共生Fran舫“菌群体内遗传分化最大，分化最晚的东北赤杨共生Frankia菌群体内遗传变异最小；属同一生活型的西伯利亚赤杨和色赤杨共生Fronkia菌间存在着较近亲缘关系；早冬瓜Fran舫。菌群体可能为其它赤杨共生Fran舫“菌提供祖先，因此认为赤杨与其共生Frankia菌间存在着协同进化。

沙棘-FranKia共生固氮体系研究

环境因子包括盐度。pH值、化合氮和磷供给显著影响了Frankia菌株Hr_(32)对水培沙棘小苗的侵染结瘤。沙棘能在0.8%盐度下生长但受抑，0.2%盐度下开始有根瘤发生，0.1%盐度下结瘤较好。Hrs2纯培养下耐盐力不强，0.5%盐度下已不能生长，导致了高盐浓度下不能结瘤。pH = 7.0 - 8.0为沙棘结瘤最佳范围。pH 值高至9.0或低至4.2，沙棘不能结瘤。低磷供给限制了根瘤发生，当供给10PPm或更高的磷时，沙棘成功结瘤，低于6PPm化合氮供给促进结瘤。当供给16PPm化合氨时，结瘤完全抑制。结瘤使沙棘获得近二倍 的增长效果。水培条件下人工根瘤活性低于自然生境根瘤。结瘤使沙棘的落叶延迟。

共生固氮放线菌Frankia的细胞化学分类I、Frankia菌全细胞可溶性蛋白图谱分析II、Frankia菌同功酶图谱分析

本文利用单向SDS-PAGE方法对十八株Frankia菌的全细胞可溶性蛋白进行了图谱分析。Frankia菌蛋白图谱不受菌令的影响。不同交叉接种组的Frankia菌具有不同的蛋白图谱，同一交叉接种组内的菌株也有所羞。十八株菌分为三大类七个亚类，第I类包括赤场、杨梅香蕨木和美洲茶内生菌；第II类包括木麻黄内生菌，第III类包括胡颓子和沙棘内生菌。利用同功酶图谱的差异性对Frankia菌进行分类识别是一种非常有效的方法，不同的Frankia菌株具有不同的同功酶（过氧化物酶和酯酶）图谱。根据图谱之间的相似性，可以将二十株Frankia菌分成三组；即赤杨组，木麻黄组和胡颓子组，这与其它分类结果基本符合，只是细枝木麻黄菌株CcO1的过氧化物酶图谱与其它菌株完全不同。从同种根瘤中分离的内生菌具有不同的同功酶图谱，进一步证实了遗传结构不完全相同的菌株可以同时共生于同种根瘤内，同时根据二种同功酶的电泳分布率，说明了Frankia菌株遗传信息的广泛分布性。

弗兰克氏菌(Frankia)共生固氮基因研究

选取三株属于不同亲合类群的Frankia代表菌株即 At4（分自色赤杨）、Cc01（分自细枝木麻黄）和 Hr16（分自沙棘），提取了其总DNA，以G－谱宿主粘粒载体, pLAFR1建立了其基因文库，转化了数和重组质粒酶切检查均证明达到理论要求。为克隆 Frankia的共生固氮基因，采用了二种克隆策略，首先是基于固氮酶结构基因 (nifHDK) 在固氮微生物中的普遍保守性，以其为探针筛选文库；其次是基于 Frankia 在侵染和结瘤过程中与根瘤菌的相似性，考察二者结瘤基因的结构相似性和功能互补性。BamHI酶解的 Frankia 总 DNA 与pSA30（肺炎克氏杆菌nifHDK)的杂交表明nifHDK同源片段的大小在不同亲合类群菌株中是不同的：在At4基因组中分布在 3kb、1.9kb和0.8kb 三条杂交带上，在Hr16中分布在 2.1kb 和 1.7kb 二条带上，而在木麻黄类群（包括木麻黄属和异木麻黄属）6个种的内生菌中，均集中分布在一条只有 5.5kb 的 BamHI片段上，这表明此片段可作为木麻黄类群菌株的一个特征性分类指标。用 pBR322 为载体，克隆了Cc01中的5.5kb的nif同源片段(pCc1GX)，与pSA30中的nifH、nifD和nifK基因的杂交表明pCc1GX确实含有了全部的固氮酶结构基因的同源区。以pCc1GX为探针，通过菌落原位杂交，从文库中分离到几个 nif克隆，即：pAt1GX（来自 At4文库），插入片段为 24kbEcoRI片段，含有 1.9kb 的nif同源片段和 0.8kb nif同源片段的大部分；pHr18GX （来自 Hr16 文库），插入片段为二条13kb的EcoRI片段，其中分别含有 2.1 kb 和 1.7 kb 的nif同源片段，以及pHr11-③GX，插入片段的 17kb EcoRI片段。pHr18GX 和pHr11③GX 中插入片段总长约 43kb，根据一般与共生固氮有关的基因成簇存在的特点，这些片段可能含有了很大一部分的 Frankia共生固氮基因。关于Frankia基因组中nifH和nifDK的连锁与分离问题尚无定论，二种情况皆有实证；本工作发现pAt1GX中 1.9kb BamHI nif 同源片段和pHr12GX、pHr17GX、pHr18GX中 2.1kb BamHI nif同源片段与 pPC1201 和 pP1202皆呈阳笥杂交，在木麻黄类群菌株中则 pSA30的同源片段集中在 5.5kb 的 BamHI 片段上，这些结果说明在At4、Hr16和6株木麻黄类群菌中，nifH和nifDk均是连锁的。以豌豆根瘤菌结瘤基因（nodDABC）为探针杂交 BamHI和EcoRI酶解的 Frankia 总DNA，均未发现阳性杂交信号。通过三亲本杂交，将At4文库分组（每组480克隆）并导入nodD缺陷的豌豆根瘤菌结瘤缺陷（nodD－）受体，结果得到一些互补瘤，这些瘤较正常瘤为小，呈白色，显瘤时间较正对照稍迟。分析根瘤内生菌的重组质粒分布和大小后，得到一条“公共”质粒(pAt2GX)，含有约 23kb的EcoRI插入片段，但当将其重新导入一个新的结瘤缺陷受体时，它却不能再度互补受体的致瘤能力。

Frankia及其与放线菌结瘤植物共生体系氮代谢的研究

选择四株不同来源的Frankia菌；Ccol（分离自细枝木麻黄），Mg~+（分离自香杨梅），At_4（分离自色赤杨），Hr_(18)（分离自沙棘），对它们NH_4~+代谢的部位，以N_2或NH_4~+为氮源培养时氮代谢的差别，NH_4~+最初代谢所用的酶及其特性等进行了研究。

ARDRA对植物根瘤内共生放线菌Frankia多样性的研究

应用原核生物 16SrDNA特异性引物rD1和fD1,通过ARDRA (amplifiedribosomalDNArestrictionanalysis)法直接扩增自中国云南、东北地区赤杨属 3种植物和沙棘属 1种植物根瘤内FrankiaDNA ,得到一长约 15 0 0bp的扩增产物 .选用两种内切酶HaeⅢ、AfaⅠ联合对扩增产物进行酶切 ,得到稳定的酶切图谱 .将所测48个感染赤杨的Frankia样本区分为 3个不同的组 ,所测 43个感染沙棘的Frankia样本区分为 3个不同的组 .显示根瘤内Frankia存在丰富的遗传多样性 .

Frankia基因组DNA提取及其PCR带型

本文采用溶菌酶法、CTAB法、微波（MW）法及CTAB＋MW法等4种方法提取Frankia菌CpIl基因组DNA。结果表明四种方式均可满足试验要求，其中以CTAB法及微波法最为有效。在比较提取方法与PCR带型间的关系中，发现提取上的差异不影响PCR带型的变化。

Frankia菌的遗传多样性的RAPD研究

选用20个随机引物，对分自2个分类接种群的8株Frandia纯培养的总DNA进行随机扩增，其中引物OPW15和OPW16能扩增得到较为稳定的RAPD图谱．扩增产物分子量大都分布在0．5～4Kb之间．从稳定的RAPD扩增图谱看，Frankia菌间存在有丰富的遗传多样性；在选定适当引物情况下，能依据共同带将Frankia菌化归为同一分类接种群．

Frankia菌在非豆科放线结瘤植物根际内的存活与分布

提取Ｆｒａｎｋｉａ菌１６ＳｒＲＮＡ，制备具专一性的寡核苷酸探针，通过同源杂交，在人工接种的木麻黄根际内检测出痕量Ｆｒａｎｋｉｓ菌结果表明，Ｆｒａｎｋｉａ可在环境因子的作用下被动迁移不论接种点的位置如何，经６个月的时间稳定后，其分布状态基本相同，主要集中于土层下８～３０ｃｍ处