弗兰克氏菌(Frankia)共生固氮基因研究

选取三株属于不同亲合类群的Frankia代表菌株即 At4（分自色赤杨）、Cc01（分自细枝木麻黄）和 Hr16（分自沙棘），提取了其总DNA，以G－谱宿主粘粒载体, pLAFR1建立了其基因文库，转化了数和重组质粒酶切检查均证明达到理论要求。为克隆 Frankia的共生固氮基因，采用了二种克隆策略，首先是基于固氮酶结构基因 (nifHDK) 在固氮微生物中的普遍保守性，以其为探针筛选文库；其次是基于 Frankia 在侵染和结瘤过程中与根瘤菌的相似性，考察二者结瘤基因的结构相似性和功能互补性。BamHI酶解的 Frankia 总 DNA 与pSA30（肺炎克氏杆菌nifHDK)的杂交表明nifHDK同源片段的大小在不同亲合类群菌株中是不同的：在At4基因组中分布在 3kb、1.9kb和0.8kb 三条杂交带上，在Hr16中分布在 2.1kb 和 1.7kb 二条带上，而在木麻黄类群（包括木麻黄属和异木麻黄属）6个种的内生菌中，均集中分布在一条只有 5.5kb 的 BamHI片段上，这表明此片段可作为木麻黄类群菌株的一个特征性分类指标。用 pBR322 为载体，克隆了Cc01中的5.5kb的nif同源片段(pCc1GX)，与pSA30中的nifH、nifD和nifK基因的杂交表明pCc1GX确实含有了全部的固氮酶结构基因的同源区。以pCc1GX为探针，通过菌落原位杂交，从文库中分离到几个 nif克隆，即：pAt1GX（来自 At4文库），插入片段为 24kbEcoRI片段，含有 1.9kb 的nif同源片段和 0.8kb nif同源片段的大部分；pHr18GX （来自 Hr16 文库），插入片段为二条13kb的EcoRI片段，其中分别含有 2.1 kb 和 1.7 kb 的nif同源片段，以及pHr11-③GX，插入片段的 17kb EcoRI片段。pHr18GX 和pHr11③GX 中插入片段总长约 43kb，根据一般与共生固氮有关的基因成簇存在的特点，这些片段可能含有了很大一部分的 Frankia共生固氮基因。关于Frankia基因组中nifH和nifDK的连锁与分离问题尚无定论，二种情况皆有实证；本工作发现pAt1GX中 1.9kb BamHI nif 同源片段和pHr12GX、pHr17GX、pHr18GX中 2.1kb BamHI nif同源片段与 pPC1201 和 pP1202皆呈阳笥杂交，在木麻黄类群菌株中则 pSA30的同源片段集中在 5.5kb 的 BamHI 片段上，这些结果说明在At4、Hr16和6株木麻黄类群菌中，nifH和nifDk均是连锁的。以豌豆根瘤菌结瘤基因（nodDABC）为探针杂交 BamHI和EcoRI酶解的 Frankia 总DNA，均未发现阳性杂交信号。通过三亲本杂交，将At4文库分组（每组480克隆）并导入nodD缺陷的豌豆根瘤菌结瘤缺陷（nodD－）受体，结果得到一些互补瘤，这些瘤较正常瘤为小，呈白色，显瘤时间较正对照稍迟。分析根瘤内生菌的重组质粒分布和大小后，得到一条“公共”质粒(pAt2GX)，含有约 23kb的EcoRI插入片段，但当将其重新导入一个新的结瘤缺陷受体时，它却不能再度互补受体的致瘤能力。