Avaliação de diferentes formas de preservação e desenvolvimento in situ de folículos ovarianos pré-antrais caprinos

This study evaluated the effect of indole-3-acetic acid (IAA) in the activation of goats preantral follicles (FOPA). Were used four pairs of ovaries of adult mixed breed goats. Each ovarian pair was divided into 23 fragments. One fragment was fixed for histology and other fragment was using to follicular isolation procedure. The remaining fragments were cultured in 1.0 ml of Minimum Essential Medium (MEM) or MEM supplemented with IAA at concentrations of 10, 40, 100, 500 or 1000 ng/mL. The in vitro culture was performed at 39°C in incubator with 5% CO2 for 1, 3 and 5 days. After in vitro culture was evaluated histological integrity and viability of FOPA. The addition of 100 ng/ml of IAA to MEM showed a significant increase in follicles transition in the third day of in vitro culture, characterizing follicular activation. Moreover, this concentration was obtained maintaining the histological integrity of PAF by the fifth day of in vitro culture. The viability test confirmed the results of histology. Thus, we conclude that IAA can promote the activation of goats FOPA

Expressão gênica e viabilidade de folículos ovarianos pré-antrais de Sapajus apella congelados e cultivados in vitro

O objetivo do presente estudo foi desenvolver um protocolo de congelação para a preservação de folículos pré-antrais de Sapajus apella (macaco-prego). Para este fim, fragmentos ovarianos foram expostos à diferentes soluções crioprotetoras, adicionadas ou não por antioxidantes (selênio e trolox), congelados e cultivados in vitro por 24/horas. Análises morfológicas, ultraestruturais, de viabilidade e estresse oxidativo foram desenvolvidas. A coleta do material foi realizada no Centro Nacional de primatas (CENP) e nove macacos-prego maduras e saudáveis foram usadas. Biopsias ovarianas de 1 mm³ foram coletadas por laparoscopia exploratória. Os folículos coletados foram classificados de acordo com sua fase de desenvolvimento em primordial, primário ou secundário. A viabilidade folicular foi observada através da utilização de marcadores fluorescentes (Iodeto de propídeo e Hoechst) qRT-PCR foi usado para avaliar a expressão de hormônios e fatores de crescimento. O TEAC foi usado para mensurar o estresse oxidativo no tecido. Os resultados mostraram que a solução congelação contendo trolox não afetou a morfologia folicular e expressão gênica. A criopreservação resultou em elevadas taxas de viabilidade folicular quando o trolox estava presente na solução, porém a expressão de genes codificando BMP4 e KL foi negativamente afetada. Nossos achados mostraram um efeito favorável da adição do trolox à solução de congelação. Entretanto, a viabilidade folicular e expressão gênica foram afetados após cultivo in vitro.

Folículos ovarianos pré-antrais bovinos: cultivo in vitro e xenotransplante

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq)

Potencial do cultivo in vitro e do xenotransplante na sobrevida e desenvolvimento de folículos ovarianos pré-antrais em matrizes de ruminantes domésticos em risco de morte: revisão de literatura

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq)

Conservação de material genético de espécies silvestres do bioma caatinga utilizando a manipulação oócitos inclusos em folículos ovarianos pré antrais (MOIFOPA)

The objective of the present thesis was to use the manipulation of oocytes enclosed in preantral follicles (MOEPF) as a tool for the female gametes rescue and optimization, from wild species of Caatinga biome. The thesis was divided into 4 experiments. At first experiment, it was performed the estimative and description of the agouti (Dasyprocta leporina) preantral follicles (PF) histologic and ultrastructural features, in which it was estimated 4419.8 ± 532.26 and 5397.52 ± 574.91 follicles for the right and left ovary, respectively, and the majority (86,63%) belonged to the primordial follicles category (P<0.05). Most of the population consists of morphologically normal follicles (70.78%), presenting a large and central nuclei and uniform cytoplasm. At ultrastructural evaluation it was verified the presence of a great number of round mitochondrias associated to lipid droplets. In the second experiment, it was performed the estimative and description of yellow-toothed cavies (Galea spixii) PF characteristics, also, the evaluation of the effect of solid surface vitrification (SSV) on the in situ PF morphology. The total of 416.0 ± 342.8 PF was estimated for the ovary pair and the presence of a large quantity of primary follicles (P<0.05) was evidenced. Most of the PF was morphologically normal (94.6%), in which the oocyte nuclei presented condensed granules of heterochromatin. Round or elongated shaped mitochondria constituted the most abundant organelles. In regard of the SSV, the protocol using the dimethylsulfoxide (DMSO) 3M possibility the preservation of 69.5% of morphologically normal PF, which was evidenced by the light and transmission electronic microscopy. At third experiment, the evaluation of the SSV procedure on the morphology and viability in situ PF form collared peccaries (Pecari tajacu) was performed. No differences were observed among treatments, in which the use of DMSO, ethylene glycol (EG) and dimethylformamide (DMF) as cryoprotectants, regardless its concentration, promoted the morphology preservation of much than 70% of PF. Concerning the PF viability, the DMSO and EG promoted the best preservation. The fourth experiment aimed to evaluate the effect of α MEM+ or TCM199 associated or not to 50 ng of FSHr on the morphology, activation and growth of collared peccaries PF, in vitro cultured (IVC) during 1 or 7 days and the effect on the extracellular matrix (ECM). After 7 days of IVC only the use of TCM199/FSH maintained the proportion of intact PF, similar to day 1(63.2%), however, no differences were observed among treatments (P>0.05). Also, an improvement of the proportion of intact growing PF was verified (P>0.05). By the Ag-NOR analysis it was observed that only the treatment using TCM199/FSH promoted the maintenance of cell proliferation similar to day 1 (P>0.05). The picrosirius red stain revealed that ECM remained intact in all treatments (P>0.05). Thus, as the general conclusion, the use of MOEPF in the refereed species allowed the knowledge of aspects related to its reproductive morphology and physiology, enabling the germplasm conservation, with the possibility of germplasm bank formation, as the elucidation of mechanisms related to the PF survive and in vitro development.

Mechanical isolation of capuchin monkey (Cebus apella) preantral ovarian follicles

O presente trabalho objetivou adaptar um procedimento mecânico para o isolamento de folículos pré-antrais a partir de ovários de Cebus apella. Para isso, foi testado o efeito do intervalo de cortes seriados do tissue chopper sobre o número de folículos pré-antrais isolados a partir de ovários (n=6) de três fêmeas de C. apella, duas pré-púberes e uma adulta. Os ovários foram divididos em quatro partes iguais e fragmentados com auxílio de um tissue chopper, ajustado para a realização de secções seriadas a intervalos de 250, 500, 750 e 1000µm, respectivamente. Os folículos isolados foram contados em câmara de Neubauer e classificados em primordiais, primários e secundários. O número (média ± EP) de folículos pré-antrais isolados de 1/4 de ovário variou de 68.330+17.590, no intervalo de corte de 1.000µm, a 300.830+111.460, no intervalo de corte de 500µm, o de melhores resultados. O diâmetro médio dos folículos pré-antrais isolados variou de 11,6µm a 27, 8µm.

Expressão gênica e viabilidade de folículos pré-antrais inclusos em fragmentos de córtex ovarianos cultivados in vitro de macaco-prego (Sapajus apella)

O objetivo desse trabalho foi analisar a ativação e o crescimento de folículos préantrais de Sapajus apella, submetidos a um sistema de cultivo in vitro em curto-prazo. Nesse sentido, dois experimentos foram realizados neste trabalho. Experimento I: exposição à fresco e à crioprotetores de biopsias de fragmentos do córtex ovariano. Ambos os fragmentos ovarianos foram submetidos à extração total de RNA e síntese de cDNA. Após a amplificação do cDNA por PCR em tempo-real (RT-PCR), os software GeNorm, bestkeeper e Normfinder foram usados para avaliar a estabilidade dos genes GAPDH (glyceraldehyde-2-phosphate dehydrogenase), HPRT1 (hypoxanthine phosphoribosyltransferase 1) e TBP (TATA-binding protein). Experimento II: o tecido do córtex ovariano de quatro fêmeas foi oletado e dividido em nove pedaços de 1 mm³. Um fragmento ovariano (grupo controle) foi imediatamente dividido em dois pedaços, os quais foram destinados para análise da viabilidade ou por RT-PCR. Os 8 fragmentos restantes foram individualmente cultivados in vitro em um meio constituído de TCM suplementado com 100 ng/mL EGF (T1), com adição de 10 μM de BME (T2), 100 ng/mL de BMP4 (T3), 25 IU de PMSG (T4), 10 μM de BME e 100 ng/mL de BMP4 (T5), 10 μM de BME, 25 IU de PMSG (T6), 100 ng/mL de BMP4, 25 IU de PMSG (T7) ou 10 μM de BME, 100 ng/mL de BMP4, 25 IU de PMSG (T8). Os resultados demonstraram que no tecido do córtex ovariano de S. apella, os genes HPRT1 e TBP foram os mais apropriados como genes de referência, podendo ser usados como parâmetro para normalizar dados em estudos futuros. Ao contrário, o GAPDH se apresentou como menos estável dos genes de referencia testados. Após o cultivo in vitro, todos os tratamentos alcançaram percentuais similares da viabilidade de folículos pré-antrais. O tecido ovariano cultivado na presença de GF+BME/BMP4/PMSG resultou no aumento da taxa de ativação e crescimento folicular, assim como no aumento da expressão de AMH, BMP15 e GDF9, genes conhecidos como indicadores específicos de desenvolvimento folicular. Dessa forma, o HPRT1 e TBP são os genes de referência mais estáveis, na exposição à crioprotetores, a fresco e no o cultivo de tecidos de córtex ovariano de S. apella. Os folículos pré-antrais são capazes de desenvolverem-se in vitro quando cultivados em meio suplementado com PMSG, BME e BMP4. A viabilidade folicular, entretanto, permaneceu independentemente do meio de cultivo in vitro e o uso de fatores de crescimento, como marcadores de desenvolvimento folicular, foi crucial para identificar o melhor meio de cultivo in vitro.

Isolamento e caracterização ultraestrutural de folículos pré-antrais de vacas da raça Nelore (Bos taurus indicus)

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)

Efeito da concentração de ácido 3-indol-acético na ativação e crescimento in vitro de folículos pré-antrais ovinos

Avaliou-se o desenvolvimento de folículos pré-antrais ovinos após o cultivo in vitro do córtex ovariano em várias concentrações de ácido 3-indol acético (IAA). O córtex ovariano foi dividido em fragmentos de aproximadamente 3×3mm. Um fragmento foi imediatamente fixado em Bouin (controle - dia 0) e os demais destinados ao cultivo por dois ou seis dias em meio essencial mínimo (MEM+) acrescido de 10, 40, 100, 500 ou 1000ng/ml de IAA. Após o cultivo in vitro, não houve variação entre folículos dos tratamentos e folículos-controle, exceto nos suplementados com 40ng/ml de IAA. Nestes observaram-se redução de folículos primordiais e aumento de folículos em desenvolvimento (P<0,05). em relação aos folículos do grupo-controle, houve redução de pré-antrais normais no cultivo de seis dias (P<0,05). Após dois dias de cultivo, a redução foi observada somente nos folículos suplementados com 500 ou 1000ng/ml de IAA. Folículos pré-antrais ovinos podem ser ativados in vitro com sucesso após o cultivo em MEM+ suplementado com 40ng/ml de IAA.

Efeitos de diferentes sistemas de cultivo in vitro sobre o crescimento de folículos pré-antrais isolados de ovários de fetos bovinos

The objective of this study is to use different in vitro culture systems of preantral follicles from Nelore breed bovine fetuses in the last gestation quarter. The evaluation of treatments considered the time of growth of isolated follicles. Preantral follicles were mechanically isolated and submitted to the individual culture, for 9 days, in media no supplemented or supplemented with fetal calf serum (FCS), bovine serum albumin (BSA) or synthetic defined supplement substitute of serum KnockoutSR (KNO). We have also evaluated the effects of collagen gel or fetal calf fibroblast monolayer as substratum for in vitro cultures. The increase on the follicular diameter was followed in the first day (0 h), at the 72 h, 144 h and 216 h. Considering cultures of isolated follicles, the results have shown that the association between media supplemented with FCS and collagen gel was significantly more efficient on the increase of the follicular diameter than other treatments. It is not still established a system of appropriate cultivation that sustains the differentiation and multiplication of the granular cells and that maintains the contact of the same ones with the oocyte to provide molecules and factors that supply the metabolic demand. We also understand that our results also represent another promising step on the search for the ultimate system of in vitro culture of preantral follicles from bovines.

Expressão do fator de crescimento fibroblástico 10 (FGF-10) em folículos pré-antrais e antrais jovens durante o desenvolvimento ovariano em fetos bovinos

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)

Influência da ação da hCG sobre a expressão gênica de epirregulina, ampirregulina e hialurona sintetase-2 em folículos ovarianos de éguas estimuladas ou não com extrato de pituitária equina

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)

Concentração dos hormônios esteroides no fluido folicular de folículos ovarianos maduros e imaturos de pacientes com síndrome dos ovários policísticos submetidas à fertilização in vitro

OBJETIVO: avaliar a concentração dos hormônios esteroides no fluido folicular (FF) de folículos pequenos (10-14 mm) e grandes (> 18 mm) de mulheres com síndrome dos ovários policísticos (SOP) submetidas à hiperestimulação ovariana controlada (HOC) e ciclos de fertilização in vitro (FIV). MÉTODOS: estudo caso-controle foi conduzido em 13 mulheres inférteis com SOP (17 ciclos) e 31 mulheres inférteis por fator masculino - Grupo Controle (31 ciclos). Os FF foram aspirados individualmente e dividos em 4 grupos: G1 (FF pequeno do Grupo Controle), G2 (FF pequeno do grupo SOP), G3 (FF grande do Grupo Controle) e G4 (FF grande do grupo SOP). A metodologia utilizada para as dosagens de estradiol, progesterona e β-hCG foi a quimioluminescência, e de testosterona e androstenediona o radioimunoensaio. Para a análise das dosagens hormonais no FF entre os grupos SOP e Controle utilizou-se o teste t não-pareado, e para a comparação entre os quatro grupos, o ANOVA. Para a taxa de gravidez, foi utilizado o teste exato de Fisher. RESULTADOS: os folículos pequenos dos dois grupos tiveram valores menores de progesterona (8.435±3.305 ng/mL) comparados aos grandes (10.280±3.475 ng/mL), com valor de p<0,01. Os níveis de progesterona de todos os folículos do grupo SOP (8.095±4.151 ng/mL) foram inferiores ao Controle (9.824±3.128 ng/mL), com valor de p=0,03. Os níveis de testosterona diferiram entre G1 (326,6±124,4 ng/dL) e G3 (205,8±98,91 ng/dL), com valor de p<0,001, e entre G3 (205,8±98,91 ng/dL) e G4 (351,10±122,1 ng/dL), com valor de p<0,001. Os folículos pequenos (508,9±266 ng/dL) apresentaram valores superiores de testosterona comparados aos grandes (245,10±123 ng/dL), com valor de p<0,0001. As taxas de gravidez não diferiram entre os grupos SOP (5/13, 38,5%) e Controle (9/31, 40,9%), com valor de p=072. CONCLUSÕES: mulheres com SOP apresentam altas concentrações de testosterona no FF, independentemente do estágio de desenvolvimento folicular, e níveis de progesterona diminuídos, sugerindo que fatores parácrinos podem inibir sua secreção pelas células foliculares. As taxas de gravidez mostraram que o tratamento de HOC e FIV é uma boa opção para mulheres com infertilidade secundária à SOP.

Variabilidade da contagem automática tridimensional de folículos ovarianos durante o ciclo menstrual

Objetivos Avaliar a variabilidade da contagem automática tridimensional dos folículos ovarianos que mediram 2 a 6 mm e 2 a 10 mm durante o ciclo menstrual. Verificar se este exame pode ser aplicado fora da fase folicular precoce do ciclo. Método Prospectivo observacional. Foram incluídas todas as pacientes inférteis submetidas à monitorização da ovulação de 20 de abril de 2013 a 30 de outubro de 2014, com18 a 35 anos; IMC de 18 a 25 kg/m2, eumenorréicas; semhistória de cirurgia ovariana e sem alterações nas dosagens do TSH, prolactina, insulina e glicemia. Foram excluídas aquelas que apresentaram cistos ovarianos e as que faltaram algum dia da monitorização. A contagem ultrassonográfica dos folículos foi feita pelo modo 3D com Sono AVC na fase folicular precoce, folicular media, periovulatória e lútea do ciclo. Resultados Quarenta e cinco mulheres foram incluídas. Houve diferença entre as médias das contagens dos folículos com 2 a 6 mm (p = 0,001) e 2 a 10 mm (p = 0,003) pelo teste de Friedman que avaliou conjuntamente as quatro fases do ciclo. Quando se aplicou o teste t-Student pareado, houve aumento significativo na contagem dos folículos de 2 a 6 mm quando se comparou a contagem desses folículos na fase folicular média e periovulatória com a contagem da fase lútea. Não houve diferença significante entre a contagem destes folículos pequenos nas fases folicular precoce, média e periovulatória. Conclusões A variação da contagem automática tridimensional dos folículos de 2 a 6 mm, nas fases folicular precoce, folicular média e periovulatória, não mostrou significância estatística. Houve uma variação significativa da contagem automática 3D dos folículos ovarianos de 2 a 10 mmdurante o ciclo. A variabilidade significativa da contagem dos folículos de 2 a 10 mm durante o ciclo não permite que este exame seja realizado fora da fase folicular precoce.

Uso clínico do hormônio antimülleriano em ginecologia

O hormônio antimülleriano (AMH) é uma glicoproteína produzida pelas células granulosas de folículos ovarianos primários, pré-antrais e pequenos folículos antrais e ultimamente sua aplicabilidade clínica tem sido demonstrada através de diversos estudos. A predição da resposta à estimulação ovariana para fertilização in vitro corresponde a sua mais frequente utilização na prática clínica, sendo rotineiramente realizada em muitos serviços para identificar subgrupos de mulheres suscetíveis a má resposta ou a Síndrome da Hiperestimulação Ovariana. Existem perspectivas de que o AMH possa ser aplicável na individualização do risco de injúria gonadal iatrogênica em mulheres portadoras de neoplasia que serão submetidas a quimioterapia. Também é provável que as dosagens de AMH sejam incluídas nos protocolos de investigação de amenorreias e oligomenorreias, uma vez que seus níveis encontram-se elevados em pacientes portadoras da Síndrome dos Ovários Policísticos, reduzidos em casos de falência ovariana prematura e normais em outras condições como a hiperprolactinemia e o hipogonadismo hipogonadotrófico. É possível que futuramente o AMH venha a ser utilizado na predição da idade de menopausa e do prognóstico reprodutivo da mulher, fornecendo bases sólidas ao aconselhamento conceptivo e contraceptivo.