Entwicklung eines immunologischen Testsystems zur Detektion des marinen Biotoxins Domoinsäure

Domoinsäure ist ein von mehreren Arten mariner Kieselalgen der Gattung Pseudonitzschia produziertes Toxin, welches während einer Algenblüte in Molluscen wie z.B. der Miesmuschel Mytilus sp. akkumuliert werden kann. Beim Verzehr solch kontaminierter Muscheln können sowohl beim Menschen als auch bei Tieren erhebliche Vergiftungserscheinungen auftreten, die von Übelkeit, Kopfschmerzen und Orientierungsstörungen bis hin zum Verlust des Kurzzeitgedächtnisses (daher auch als amnesic shellfish poisoning bekannt) reichen und in einigen Fällen tödlich enden. rnDie heute gängigen Methoden zur Detektion von Domoinsäure in Muschelgewebe wie Flüssigkeitschromatographie und Maus-Bioassay sind zeit- und kostenintensiv bzw. in Anbetracht einer Verbesserung des Tierschutzes aus ethischer Sicht nicht zu vertreten. Immunologische Testsysteme stellen eine erstrebenswerte Alternative dar, da sie sich durch eine vergleichsweise einfache Handhabung, hohe Selektivität und Reproduzierbarkeit auszeichnen.rnDas Ziel der vorliegenden Arbeit war es, ein solches immunologisches Testsystem zur Detektion von Domoinsäure zu entwickeln. Hierfür wurden zunächst Antikörper gegen Domoinsäure gewonnen, wofür das Toxin wiederum als erstes über die Carbodiimid-Methode an das Trägerprotein keyhole limpet hemocyanin (KLH) gekoppelt wurde, um eine Immunantwort auslösen zu können. Kaninchen und Mäuse wurden mit KLH-DO-Konjugaten nach vorgegebenen Immunisierungsschemata immunisiert. Nach vier Blutabnahmen zeigte das polyklonale Kaninchenantiserum eine ausreichend hohe Sensitivität zum Antigen; das nachfolgende Detektionssystem wurde mit Hilfe dieses polyklonalen Antikörpers aufgebaut. Zwar ist es gegen Ende der Arbeit auch gelungen, einen spezifischen monoklonalen Antikörper aus der Maus zu gewinnen, jedoch konnte dieser aus zeitlichen Gründen nicht mehr im Detektionssystem etabliert werden, was durchaus wünschenswert gewesen wäre. rnWeiterhin wurde Domoinsäure im Zuge der Entwicklung eines neuartigen Testsystems an die Trägerproteine Ovalbumin, Trypsininhibitor und Casein sowie an Biotin konjugiert. Die Kopplungserfolge wurden im ELISA, Western Blot bzw. Dot Blot nachgewiesen. Die Ovalbumin-gekoppelte sowie die biotinylierte Domoinsäure dienten im Folgenden als die zu messenden Größen in den Detektionsassays- die in einer zu untersuchenden Probe vorhandende, kompetitierende Domoinsäure wurde somit indirekt nachgewiesen. rnDer zulässige Höchstwert für Domoinsäure liegt bei 20 µg/g Muschelgewebe. Sowohl mit Biotin-DO als auch mit OVA-DO als den zu messenden Größen waren Domoinsäurekonzentrationen unterhalb dieses Grenzwertes nachweisbar; allerdings erwies sich der Aufbau mit Biotin-DO um das ca. 20-fache empfindlicher als jener mit OVA-DO. rnDie in dieser Arbeit präsentierten Ergebnisse könnten als Grundlage zur Etablierung eines kommerzialisierbaren immunologischen Testsystems zur Detektion von Domoinsäure und anderen Biotoxinen dienen. Nach erfolgreicher Validierung wäre ein solches Testsystem in seiner Handhabung einfacher als die gängige Flüssigkeitschromatographie und besser reproduzierbar als der Maus-Bioassay.rn

Wirkungsbezogene Detektion von toxischen Substanzen in Fisch und Umwelt

The detection of unknown and the quantification of known toxic substances is a challenge for the modern chemical and biological analysis. Effect-related in vitro methods, e.g. AH-receptor or estrogene-receptor mediated, offer some advantages compared to the classical chemical analysis. It could be shown that two cell lines exhibit different sensitivities to 2,3,7,8-tetrachlorodibenzodioxin (TCDD), although the cells contain the identical dioxin-receptor. The application and limitations of these methods in envi-ronmental analysis are discussed.

Entwicklung einer online Kopplungsmethode von GC mit ECD- und ICPMS-Detektion zur Bestimmung biogener leichtflüchtiger bromierter und iodierter Kohlenwasserstoffe in Meerwasser und der Atmosphäre

In dieser Arbeit wurde ein zweidimensionales Kopplungssystem zur Bestimmung von leichtflüchtigen bromierten und iodierten Kohlenwasserstoffen (LHKW) in Wasser- und Luftproben entwickelt. Hierzu wurde ein Gaschromatograph mit einem Elektroneneinfangdetektor (ECD) on-line an ein elementselektives induktiv gekoppeltes Plasma-Massenspektrometer (ICPMS) gekoppelt. Dieses extrem nachweisstarke Analysensystem ermöglicht eine simultane Identifizierung unbekannter und koeluierender Peaks sowie eine vereinfachte Quantifizierung mittels ICPMS. Beim Vergleich des GC-ECD-ICPMS-Kopplungssystem mit den herkömmlichen Detektionsmethoden wie dem Massenspektrometer mit Elektronenstoss-Ionisation und dem Atomemissionsdetektor mit mikrowelleninduziertem Plasma schnitt das neu entwickelte Kopplungssystem ausgezeichnet ab. Für die Isolierung der LHKW aus Meerwasserproben wurde die Purge und Trap Technik verwendet, Luftproben wurden durch Besaugung auf Adsorptionsmaterial angereichert. Im Rahmen des BMBF-Teilprojektes ReHaTrop/AFOHAL wurden im August 2001 und im April/Mai 2002 an der Deutschen Nordseeküste Probenahmen durchgeführt. Die Konzentrationen der Wasserproben lagen im Bereich von 0,1-158 ng L-1, die der Luftproben im Bereich von 0,01-470 pptv. Die Messungen bestätigen die wichtige Rolle von Makroalgen im Zusammenhang mit der Produktion von halogenierten Kohlenwasserstoffen. Die Konzentration der iodierten und bromierten Kohlenwasserstoffe war immer höher in Proben, die direkten Kontakt mit Makroalgen hatten. Inkubationsexperimente zeigen für verschiedene braune und grüne Makroalgen individuelle „Fingerprints“ der biogenen LHKW-Produktion. Bei den Messungen an der Nordseeküste wurden Abhängigkeiten zwischen den LHKW und meteorologischen Parametern gefunden.

Entwicklung neuer Biomarker zur Detektion von Umweltbelastung

Es wurde bis heute meist mit relativ aufwendigen Methoden nach dem Vorkommen von Strangbrüchen in der DNA gesucht. Die hier verwendete Fast-Micromethod steht jetzt neben mehreren bereits etablierten Methoden zur qualitativen und quantitativen Erfassung von DNA-Strangbrüchen zur Verfügung. Die Methode wurde zur schnellen und empfindlichen Messung von DNA-Schäden und deren Reparatur unter Verwendung von PicoGreen, einem spezifisch an DNA-Einzelstränge bindenden Fluoreszenzfarbstoff, durchgeführt. Die Methode wurde in der vorliegenden Arbeit für verschiedene Zellarten wie HeLa-Zellen und Schwamm-Zellen mit Schwermetallionen verwendet. Sie wurde ebenfalls bei verschiedenen Strangbruch-induzierenden Stoffen wie NQO und physikalischen Faktoren wie UV-Bestrahlung und Gammastrahlung erfolgreich eingesetzt. Die Strangbrüche wurden bei HeLa-Zellen mit 10 µM NQO nach 90 Minuten Inkubation und ebenso bei Gammastrahlung mit 16 Gy gemessen. An Schwammzellen wurden Effekte von Schwermetallionen und UV, auch einschließlich nachgeschalteter Reparaturaktivität, gemessen. Dabei war die Reparatur jedoch nicht ganz vollständig. Durch die Fast-Micromethod wurde DNA-Schädigung durch UV-Bestrahlung und Gentoxizität von Schwermetall-Ionen an HeLa-Zellen nachgewiesen. Die Schwammzellen wurden mit verschiedenen Schwermetall-Ionen in verschiedenen Konzentrationen getestet und mit UV bei verschiedenen Dosen bestrahlt. Teilweise wurde nach dem Einfluss die DNA-Reparatur erfasst. Schwammzellen wurden in den drei häufig verwendeten Medien CMFSW, CMFSW+EDTA und Seewasser aufgenommen. Im Seewasser waren die Zellen nach 60 Minuten Inkubationszeit aggregiert (Primmorphe). Im CMFSW+EDTA Medium lagen dagegen nur Einzellen vor, da die Zellen im EDTA-Medium dissoziiert wurden und auch nicht mehr proliferierten.

Detektion neuroaktiver Substanzen durch Modifikation des Aktivitätsmusters neokortikaler Netzwerke auf Multielektrodenarrays – Charakterisierung und Optimierung eines neuronalen Biosensors

In dieser Arbeit wurden kortikale neuronale Netzwerke auf Multielektrodenarrays auf ihre Tauglichkeit als zellbasiertes Biosensorsystem untersucht. Der Schwerpunkt der pharmakologischen Untersuchungen an den ausgereiften kortikalen Netzwerken lag auf dem Einsatz von Substanzen, welche auf den GABAA-Rezeptor einwirken. Die Modifikation des spontan generierten Aktivitätsmusters ließ dabei Rückschlüsse auf die Wirksamkeit und den Wirkungsmechanismus der Testsubstanzen zu. Ferner war in den meisten Fällen eine Diskriminierung der auf den gleichen Rezeptor einwirkenden Substanzen möglich. Die Analyse der Spikerate und verschiedener auf Bursts beruhender Messparameter machte deutlich, dass die Burstrate bei den extrazellulären Ableitungen auf Netzwerkebene den sensitivsten und verlässlichsten Parameter zum Nachweis der Substanzeffekte darstellte. Durch die Verwendung kortikaler Netzwerke unter optimierten Kulturbedingungen und einer auf das System abgestimmten Analysesoftware konnte die Reproduzierbarkeit und Sensitivität im Vergleich zu anderen Studien deutlich verbessert werden. Um die extrazelluläre Signalableitung von einer möglichst geringen Zellanzahl und damit einem überschaubaren zellulären Netzwerk auf Multielektrodenarrays zu ermöglichen, wurden die Oberflächeneigenschaften der Substrate so modifiziert, dass die Lokalisation der Zellsomata und das Auswachsen der Neurite einer geometrischen Kontrolle unterlag. Die kontrollierte Substratbeschichtung des Adhäsionspromotors Poly-D-Lysin in einem triangulären Muster konnte dabei durch die Methode des Mikrokontaktstempelns realisiert werden. Durch das kontrollierte Zellwachstum konnte die extrazelluläre Ableitung von Netzwerken einer geringen Zelldichte über einen Zeitraum von mehreren Wochen ermöglicht werden. Die Untersuchung struktureller und morphogenetischer Eigenschaften, sowie elektrophysiologische Untersuchungen der strukturierten Netzwerke bewiesen, dass die kontrollierte Substratbeschichtung sich nicht negativ auf das Wachstum, die Synaptogenese und die Funktionalität auswirkte.

Charakterisierung spezieller pflanzlicher Gamma-Tubulin-Sequenzbereiche und Detektion potentieller Interaktionspartner mittels Yeast-two-Hybrid-System

Mitotische und postmitotische Vorgänge pflanzlicher Zellen basieren auf der Funktion von Mikrotubuli. Es liegen nur wenige gesicherte Erkenntnisse zur Organisation dieser Multifunktionalität vor. Eine zentrale Bedeutung wird bei der Nukleation der Mikrotubuli an MTOCs durch γ-Tubulin zugeschrieben. Deren Zusammenlagerung an MTOCs ist jedoch noch nicht richtig verstanden. Domänen, die an der Proteinoberfläche exponiert werden, könnten in Interaktionen involviert sein. Hier werden im Besonderen der γ-A und γ-B-Peptivmotiv diskutiert. Es wurde das γ-A- und γ-B-Peptidmotiv des γ-Tubulins hinsichtlich einer Konservierung innerhalb des Pflanzenreiches untersucht. Die beiden Bereiche sind bei den grünen Landpflanzen stark konserviert. Sie divergieren stark zu den einzelligen Grünalgen Chlamydomonas reinhardtii und Chlorella spec. Es wurden daher in der bestehenden phylogentischen Lücke weitere Organismen hinsichtlich des γ-A und γ-B Peptidmotivs untersucht. Auswahlkriterien der Organismen waren Ein-/Mehrzelligkeit, Besitz/Abwesenheit von Centriolen und Besitz/Abwesenheit von Geißeln. Des weiteren wurde mit verschiedenen γ-Tubulin-Konstrukten um das γ-A- und γ-B-Peptidmotiv, gewonnen aus Nicotiana tabacum (BY2) mittels Y2H-System nach Interaktionspartnern gesucht. Bei den Sequenzuntersuchungen des γ-A- und γ-B-Peptidmotivs konnte festgestellt werden, dass die Konservierung innerhalb der Streptophytenlinie erfolgt. Interessant erweist sich die Tatsache, dass dieses Motiv bei den Jochalgen, welche ebenfalls den Streptophyten angehören, nur im γ-A-Peptidmotiv auftritt. Es besteht die Möglichkeit, dass die beiden potentiellen Interaktionspartner verschiedene Proteine als Interaktions-partner besitzen. Durch eine Anwendung eines auf dem GAL4-Protein basierenden Y2H-Systems mit vier unterschiedlichen Konstrukten des γ-Tubulin-A/B-Peptidbereichs als Köder-konstrukt und einer cDNA-Bibliothek als Beutekonstrukt, wurden diverse Sequenzen identifiziert. Identifiziert wurden das Poly(A)-Bindeprotein, Glycerin-aldehyd-3-phosphatdehydrogenase, die S-adenosyl-L-methionine-Synthetase, diverse Proteasom-Untereinheiten, eine sekretorische Peroxidase, eine Ascorbat-Peroxidase, die NtPOX1-Peroxidase und verschiedene Peroxidasen aus Nicotiana tabacum, Sequenzen des Chloroplastengenoms, ein Myosin-ähnliches Protein und eine Sequenz auf dem 5. Chromosom des Medicago truncatula-Klons mth2-16f8 und diverse humane Sequenzen der Proteine DKFZp68 und DKFZp77. Die Ergebnisse weisen auf eine komplexe Funktionsweise der unterschiedlichen Komponenten des pflanzlichen Cytoskeletts und des γ-Tubulins hin. Zur Aufklärung müsste dies in Zukunft mittels anderer genetischer, biochemischer oder funktioneller Methoden untersucht werden. Hypothesen über Interaktionen der Cytoskelettkomponenten können wahrscheinlich nicht allein durch die Anwendung des Y2H-Systems aufgeklärt werden.

Supernova-Detektion mit dem IceCube-Neutrinoteleskop

IceCube, ein Neutrinoteleskop, welches zur Zeit am Südpol aufgebaut und voraussichtlich 2011 fertiggestellt sein wird, kann galaktische Kernkollaps-Supernovae mit hoher Signifikanz und unübertroffener statistischer Genauigkeit der Neutrinolichtkurve detektieren. Derartige Supernovae werden begleitet von einem massiven Ausbruch niederenergetischer Neutrinos aller Flavour. Beim Durchfliegen des Detektormediums Eis entstehen Positronen und Elektronen, welche wiederum lokale Tscherenkowlichtschauer produzieren, die in ihrer Summe das gesamte Eis erleuchten. Ein Nachweis ist somit, trotz der Optimierung IceCubes auf hochenergetische Teilchenspuren, über eine kollektive Rauschratenerhöhung aller optischen Module möglich. Die vorwiegende Reaktion ist der inverse Betazerfall der Antielektronneutrinos, welcher über 90,% des gesamten Signals ausmacht.rnrnDiese Arbeit beschreibt die Implementierung und Funktionsweise der Supernova-Datennahme-Software sowie der Echtzeitanalyse, mit welcher die oben genannte Nachweismethode seit August 2007 realisiert ist. Die Messdaten der ersten zwei Jahre wurden ausgewertet und belegen ein extrem stabiles Verhalten des Detektors insgesamt sowie fast aller Lichtsensoren, die eine gemittelte Ausfallquote von lediglich 0,3,% aufweisen. Eine Simulation der Detektorantwort nach zwei unterschiedlichen Supernova-Modellen ergibt eine Sichtweite IceCubes, die im besten Falle bis zur 51,kpc entfernten Großen Magellanschen Wolke reicht. Leider ist der Detektor nicht in der Lage, die Deleptonisierungsspitze aufzulösen, denn Oszillationen der Neutrinoflavour innerhalb des Sterns modifizieren die Neutrinospektren ungünstig. Jedoch können modellunabhängig anhand des frühesten Signalanstiegs die inverse Massenhierarchie sowie $sin^2 2theta_{13} > 10^{-3}$ etabliert werden, falls die Entfernung zur Supernova $leq$,6,kpc beträgt. Gleiches kann durch Auswertung eines möglichen Einflusses der Erdmaterie auf die Neutrinooszillation mit Hilfe der Messung eines zweiten Neutrinodetektors erreicht werden.

Detektion und Synthese eines liganden-gesteuerten Ionenkanals im mikrofluidischen Analysesystem

Membranproteine spielen eine wichtige Rolle bei physiologischen Prozessen wie Signalweiterleitung oder Immunreaktion. Deshalb stehen sie im Fokus der pharmakologischen Wirkstoffentwicklung und es besteht großes Interesse, Membranproteinbasierte Biosensoren zu entwickeln, die sich z.B. als Screening-Plattformen eignen. Allerdings stellt die Handhabung von Membranproteinen wegen ihrer amphiphilen Struktur eine große Herausforderung dar. Membranproteine werden meist in Zellkultur oder in bakteriellen Expressionssystemen synthetisiert. Diese Verfahren liefern aber oft nur eine geringe Ausbeute und erlauben wenig Kontrolle über die Expressionsbedingungen. Als alternativer Ansatz bietet sich stattdessen die in vitro Synthese von Proteinen an, die in einer zellfreien Umgebung stattfindet. Ziel der vorliegenden Arbeit war die Etablierung eines miniaturisierten Analysesystems, das Aktivitätsmessungen an in vitro synthetisierten Ionenkanälen erlaubt. Dafür wurde ein Labon- Chip entwickelt, der elektrochemische und optische Nachweismethoden in parallelen Anätzen ermöglicht. Als amphiphile Umgebung für die Inkorporation von Membranproteinen wurden vier verschieden biomimetische Membranaufbauten hinsichtlich ihrer Dichtigkeit und ihrer Reproduzierbarkeit untersucht. Als Methode fanden insbesondere die Impedanzspektroskpie und die Oberflächenplasmonen-Resonanzspektroskopie Anwendung. Die peptide cushioned Bilyer Lipid Membranes (pcBLM) eignete sich dabei am besten für Untersuchungen an Membranproteinen. Zur Detektion der Ionenkanalaktivität wurde eine neue Messmethode etabliert, die auf der Messung der Impedanz bei fester Frequenz basiert und u.a. eine Aussage über die Änderung des Membranwiderstandes bei Aktivierung erlaubt. Am Beispiel des nicotinischen Acetylcholinrezeptors (nAchR) konnte gezeigt werden, dass sich die Aktivität von Ionenkanälen mit dem entwickelten Chip-System nachweisen ließ. Die Spezifität der Methode konnte durch verschiedene Kontrollen wie die Zugabe eines nicht-aktivierenden Liganden oder Inhibition des Rezeptors nachgewiesen werden. Weiterhin konnte die in vitro Synthese des Ionenkanals a7 nAchR durch Radioaktivmarkierung nachgewiesen werden. Die Inkorporation des Rezeptors in die biomimetischen Membranen wurde mit Immunodetektion und elektrochemischen Methoden untersucht. Es zeigte sich, dass die funktionelle Inkorporation des a7 nAchR davon abhing, welcher biomimetische Membranaufbau verwendet wurde.

Serumfreie Collagen-Monolayer- und Sandwich-Kulturen primärer Hepatozyten als ein wertvolles Modell zur Detektion von Toxizität und Arzneimittelwechselwirkungen in vitro

In dieser Arbeit wurden Zellkulturen primärer Hepatozyten von Ratte und Mensch hinsichtlich ihrer Eignung untersucht Speziesunterschiede der toxischen Wirkung und des Metabolismus von Substanzen darzustellen und inwieweit die in vitro-Ergebnisse in vivo vergleichbar bzw. übertragbar sind. Des Weiteren wurde ein Zellkulturmodell entwickelt, das eine Kultivierung von primären Hepatozyten aus Ratte, Mensch und Maus über einen Zeitraum von mindestens einer bis zwei Wochen erlaubt.rnrnDie Zellkulturen primärer Hepatozyten von Ratte und Mensch zeigten deutliche Unterschiede in der substanzinduzierten Veränderung der Genexpression nach Behandlung mit den, vor allem für den Menschen, lebertoxischen Substanzen Diclofenac und Troglitazon. Diese Unterschiede traten hauptsächlich in der Induktion fremdstoffmetabolisierender Enzyme sowie deren transkriptionsregulierenden Kernrezeptoren in den humanen Hepatozyten auf. Ebenso war eine verstärkte Stressantwort zu beobachten.rnDeutliche Speziesunterschiede konnten ebenso in der Wirkung der Arzneimittelentwicklungssubstanz EMD 392949 auf die Aktivität bzw. Genexpression von Cytochrom P450 Enzymen sowie deren Regulatoren nachgewiesen werden. Des Weiteren konnte hier eine sehr gute Übereinstimmung der Ergebnisse aus den Zellkulturen primärer Ratten- bzw. Humanhepatozyten mit jenen aus in vivo-Experimenten mit Ratten bzw. Affen (Macaca fascicularis) beobachtet werden, was die Aussagekraft der Primärkulturen verdeutlichte.rnDie große Übereinstimmung zwischen Enzymaktivität und Genexpression in der Induktion fremdstoffmetabolisierender Enzyme konnte durch die Behandlung mit einer Reihe speziesspezifischer Induktoren in Zellkulturen primärer Ratten- bzw. Humanhepatozyten bestätigt werden; vor allem nach dem von der amerikanischen Arzneimittelzulassungsbehörde (FDA, Food and Drug Administartion) vorgeschlagenen Bewertungsschema zur Untersuchung der CYP-Induktion.rnrnDie Lebensdauer sowie der Differenzierungsgrad von primären Hepatozyten in Kultur sind stark abhängig von den Zellkulturbedingungen. Durch diese Arbeit konnte gezeigt werden, dass spezifische Eigenschaften von Rattenleberzellen durch Kultivierung in einem Sandwich aus zwei hydratisierten Collagengelschichten und unter serumfreien Bedingungen für einen Zeitraum von mindestens zwei Wochen aufrechterhalten werden können. Dieses Kulturmodel konnte auf Primärhepatozyten von Mensch und Maus übertragen werden und erweitert die möglichen Anwendungen hin zu einer Behandlung über einen längeren Zeitraum und der Untersuchung von subchronischen Effekten.rn

Vergleich der Elastographie-gesteuerten Biopsie mit der Systembiopsie bei der Detektion von Prostatakarzinomen

Hintergrund: Die Systembiopsie gilt als Goldstandard zum Nachweis eines Prostatakarzinoms, obwohl ein relevanter Anteil an Prostatakarzinomen nicht diagnostiziert wird. Wir wollten mit unserer Arbeit die Frage beantworten, ob mittels elastographisch gezielter Biopsien die Prostatakarzinom-Detektion im Vergleich zur Goldstandard-Systembiopsie verbessert werden kann. Material und Methode: 152 Patienten wurden in einer prospektiven Studie einer 12-fachen Prostata-Systembiopsie unterzogen. In Linksseitenlagerung wurde dabei aus jedem der vordefinierten 6 Prostatasegmente je 1 laterale und 1 mediale Stanze entnommen. Elastographisch suspekte Areale wurden zusätzlich gezielt biopsiert. Als statistisch signifikant wurde p<0,05 angenommen. Ergebnisse: Bei 62 der 152 Patienten (40,8%) wurde ein Prostatakarzinom diagnostiziert. Die Detektionsrate der Systembiopsie betrug 39,5% (60/152), die Detektionsrate der Elastographie 29,6% (45/152). Somit war die Systembiopsie der elastographisch gezielten Biopsie signifikant überlegen (p=0,039).Jedoch war die Wahrscheinlichkeit mit einer Prostatastanze ein Karzinomherd zu entdecken, für die elastographischen Biopsien 3,7-fach höher als für die Systembiopsien. Die Sensitivität der Elastographie betrug 72,6% und die Spezifität 66,6%. Der positive Vorhersagewert für die Elastographie war 60%, der negative Vorhersagewert 78%. Die Kombination von Systembiopsie und elastographisch gezielten Biopsien bot die höchste Detektionsrate. In der rechten Prostatahälfte (48%) verzeichneten wir doppelt so viele elastographisch falsch-positive Befunde wie in der linken Prostatahälfte (25%). Desweiteren fanden sich am häufigsten falsch-positive Befunde im Prostata-Apex (46%) und am seltensten in der Prostata-Basis (29%). Schlussfolgerung: In unserer Studie war die elastographisch gezielte Biopsie der Systembiopsie signifikant unterlegen (p=0,039). Die Kombination von Systembiopsie mit elastographisch gezielten Biopsien bot die höchste Detektionsrate und kann daher empfohlen werden. Die Auffälligkeiten in der Segment-bezogenen Auswertung und ein möglicher Einfluss der Patienten-Lagerung müssen durch weitere Studien überprüft werden.rn

Detektion von Nickel- und Cobaltspezies in einzelnen lebenden Zellen mit hoher lateraler Auflösung

Übergangsmetallen wie Nickel und Cobalt kommt meist eine große Bedeutung als Cofaktor in Enzymen oder Metallkomplexen im Metabolismus von Lebewesen zu. Da eine sehr geringe Konzentration dieser Übergangsmetalle in einer Zelle für deren Funktionalität ausreicht, ist eine konstante Konzentration der Spurenelemente in einer Zelle angestrebt. Durch meist anthropogene Einflüsse sind Pflanzen und Menschen zunehmend hohen Konzentrationen von Übergangsmetallen ausgesetzt, die in Abhängigkeit von ihrer Spezies, der Konzentration und der Lokalisation unterschiedliche Toxizitäten aufweisen können. Die Speziation von Metallen wurde bisher mittels gängiger Analyseverfahren, wie der ICP-MS und ähnlicher Verfahren, anhand von bulk-Material durchgeführt. Durch die Entwicklung von optischen Sensoren für Metallionen war es möglich, diese Metalle auch in lebenden Zellen mittels Fluoreszenzmikroskopie zu lokalisieren. Ke und Kollegen (2006, 2007) nutzten einen solchen optischen Sensor - Newport Green DCF, um die Aufnahme von Nickel in humane A543 Lungenbronchialepithelzellen nach Inkubation mit dem wasserlöslichen NiCl2 (0,5 mM und 1 mM) sowie den wasserunlöslichen Verbindungen Ni3S2 (0,5 µg/cm2 und 1 µg/cm2) und NiS (2,5 µg/cm2) nachzuweisen und zu lokalisieren und konnten damit eine Akkumulation von Nickel im Zytoplasma und im Zellkern aufzeigen. Dabei war bei wasserlöslichen und wasserunlöslichen Nickelverbindungen Nickel nach 24 h im Zytoplasma und erst nach 48 h im Zellkern zu beobachten.rnrnDa Nickel und Cobalt keine detektierbare Eigenfluoreszenz unter den gegebenen Bedingungen zeigten, wurde für den optischen Nachweis von Nickel und Cobalt mit dem konfokalen Laser-Raster Mikroskop (CLSM) nach der Zugabe der verschiedenen wasserlöslichen und wasserunlöslichen Metallverbindungen NiCl2, NiSO4, Ni3S2 und CoCl2 in einzelnen lebenden humanen Gingiva-Fibroblasten, sowie in Pflanzenzellen in dieser Arbeit ebenfalls der optische Sensor Newport Green DCF genutzt. Korrespondierend zu den Ergebnissen früherer Arbeiten von Ke et al. (2006, 2007), in denen die Nickelaufnahme bei Konzentrationen von >0,5 mM NiCl2 bzw. >0,5 µg/cm2 Ni3S2 gezeigt wurde, wurde Nickel in Fibroblasten in Abhängigkeit von der Spezies mit steigender Metallkonzentration von 100 µM bis 500 µM nach 16 h im Zytoplasma und zunehmend nach 24 h bis 48 h im Zellkern detektiert. Bei der wasserunlöslichen Verbindung Ni3S2 war der Nachweis von Nickel im Zellkern bereits nach 16 h bis 24 h erfolgreich. Zusätzlich wurden weitere Strukturen wie das Endoplasmatische Retikulum, die Mitochondrien und die Nukleoli durch eine starke Fluoreszenz des optischen Sensors bei Colokalisationsexperimenten mit Organell-spezifischen Fluoreszenzfarbstoffen als target für die Nickelbindung vermutet. Die Lokalisation von Cobalt in den Fibroblasten entsprach weitgehend der Lokalisation von Nickel. Im Zellkern war die Cobaltlokalisation jedoch auf die Nukleoli beschränkt. Weiterführende Versuche an humanen Gingiva-Fibroblasten zeigten, dass die Aufnahme der Metalle in die Fibroblasten pH-Wert abhängig war. Niedrige pH-Werte im sauren pH-Bereich verringerten die Aufnahme der Metalle in die Zellen, wobei ein pH-Wert im basischen Bereich keinen bedeutenden Unterschied zum neutralen pH-Bereich aufwies. Im Vergleich zu den Fibroblasten war in Pflanzenzellen zu jedem Zeitpunkt, auch bei geringen Konzentrationen der Metallverbindungen sowie des optischen Sensors, Nickel und Cobalt in den Zellkernen detektierbar. Durch die Eigenschaft der Pflanzenzellen eine Vakuole zu besitzen, war Nickel und Cobalt hauptsächlich in den Vakuolen lokalisiert. Weitere Strukturen wie das Endoplasmatische Retikulum, die Mitochondrien oder auch die Zellwand kamen bei Pflanzenzellen als target in Frage.rnrnDie Fluoreszenz und Lokalisation der Metalle in den Fibroblasten waren unabhängig von der Spezies sehr ähnlich, sodass in den Zellen die Spezies anhand der fluoreszenzmikroskopischen Aufnahmen kaum unterschieden werden konnten. Lambda-Scans in verschiedenen regions of interest (ROI) wurden durchgeführt, um durch die Fluoreszenzspektren Hinweise auf eine charakteristische Beeinflussung der Bindungspartner von Nickel und Cobalt oder dieser Metalle selbst in den Zellen auf den optischen Sensor zu bekommen und diese dadurch identifizieren zu können. Das Ziel der parallelen Detektion bzw. Lokalisation und gleichzeitigen Speziation bestimmter Nickel- und Cobaltpezies in einzelnen lebenden Zellen konnte in dieser Arbeit durch den optischen Sensor Newport Green DCF nicht erreicht werden.

Diastereomeric Drug Glucuronides: Enzymatic Glucuronidation and Analysis by Capillary Electrophoresis and Liquid Chromatography-Mass Spectrometry

Foreign compounds, such as drugs are metabolised in the body in numerous reactions. Metabolic reactions are divided into phase I (functionalisation) and phase II (conjugation) reactions. Uridine diphosphoglucuronosyltransferase enzymes (UGTs) are important catalysts of phase II metabolic system. They catalyse the transfer of glucuronic acid to small lipophilic molecules and convert them to hydrophilic and polar glucuronides that are readily excreted from the body. Liver is the main site of drug metabolism. Many drugs are racemic mixtures of two enantiomers. Glucuronidation of a racemic compound yields a pair of diastereomeric glucuronides. Stereoisomers are interesting substrates in glucuronidation studies since some UGTs display stereoselectivity. Diastereomeric glucuronides of O-desmethyltramadol (M1) and entacapone were selected as model compounds in this work. The investigations of the thesis deal with enzymatic glucuronidation and the development of analytical methods for drug metabolites, particularly diastereomeric glucuronides. The glucuronides were analysed from complex biological matrices, such as urine or from in vitro incubation matrices. Various pretreatment techniques were needed to purify, concentrate and isolate the analytes of interest. Analyses were carried out by liquid chromatography (LC) with ultraviolet (UV) or mass spectrometric (MS) detection or with capillary electromigration techniques. Commercial glucuronide standards were not available for the studies. Enzyme-assisted synthesis with rat liver microsomes was therefore used to produce M1 glucuronides as reference compounds. The glucuronides were isolated by LC/UV and ultra performance liquid chromatography (UPLC)/MS, while tandem mass spectrometry (MS/MS) and nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy were employed in structural characterisation. The glucuronides were identified as phenolic O-glucuronides of M1. To identify the active UGT enzymes in (±)-M1 glucuronidation recombinant human UGTs and human tissue microsomes were incubated with (±)-M1. The study revealed that several UGTs can catalyse (±)-M1 glucuronidation. Glucuronidation in human liver microsomes like in rat liver microsomes is stereoselective. The results of the studies showed that UGT2B7, most probably, is the main UGT responsible for (±)-M1 glucuronidation in human liver. Large variation in stereoselectivity of UGTs toward (±)-M1 enantiomers was observed. Formation of M1 glucuronides was monitored with a fast and selective UPLC/MS method. Capillary electromigration techniques are known for their high resolution power. A method that relied on capillary electrophoresis (CE) with UV detection was developed for the separation of tramadol and its free and glucuronidated metabolites. The suitability of the method to identify tramadol metabolites in an authentic urine samples was tested. Unaltered tramadol and four of its main metabolites were detected in the electropherogram. A micellar electrokinetic chromatography (MEKC) /UV method was developed for the separation of the glucuronides of entacapone in human urine. The validated method was tested in the analysis of urine samples of patients. The glucuronides of entacapone could be quantified after oral entacapone dosing.