Entwicklung eines immunologischen Testsystems zur Detektion des marinen Biotoxins Domoinsäure

Domoinsäure ist ein von mehreren Arten mariner Kieselalgen der Gattung Pseudonitzschia produziertes Toxin, welches während einer Algenblüte in Molluscen wie z.B. der Miesmuschel Mytilus sp. akkumuliert werden kann. Beim Verzehr solch kontaminierter Muscheln können sowohl beim Menschen als auch bei Tieren erhebliche Vergiftungserscheinungen auftreten, die von Übelkeit, Kopfschmerzen und Orientierungsstörungen bis hin zum Verlust des Kurzzeitgedächtnisses (daher auch als amnesic shellfish poisoning bekannt) reichen und in einigen Fällen tödlich enden. rnDie heute gängigen Methoden zur Detektion von Domoinsäure in Muschelgewebe wie Flüssigkeitschromatographie und Maus-Bioassay sind zeit- und kostenintensiv bzw. in Anbetracht einer Verbesserung des Tierschutzes aus ethischer Sicht nicht zu vertreten. Immunologische Testsysteme stellen eine erstrebenswerte Alternative dar, da sie sich durch eine vergleichsweise einfache Handhabung, hohe Selektivität und Reproduzierbarkeit auszeichnen.rnDas Ziel der vorliegenden Arbeit war es, ein solches immunologisches Testsystem zur Detektion von Domoinsäure zu entwickeln. Hierfür wurden zunächst Antikörper gegen Domoinsäure gewonnen, wofür das Toxin wiederum als erstes über die Carbodiimid-Methode an das Trägerprotein keyhole limpet hemocyanin (KLH) gekoppelt wurde, um eine Immunantwort auslösen zu können. Kaninchen und Mäuse wurden mit KLH-DO-Konjugaten nach vorgegebenen Immunisierungsschemata immunisiert. Nach vier Blutabnahmen zeigte das polyklonale Kaninchenantiserum eine ausreichend hohe Sensitivität zum Antigen; das nachfolgende Detektionssystem wurde mit Hilfe dieses polyklonalen Antikörpers aufgebaut. Zwar ist es gegen Ende der Arbeit auch gelungen, einen spezifischen monoklonalen Antikörper aus der Maus zu gewinnen, jedoch konnte dieser aus zeitlichen Gründen nicht mehr im Detektionssystem etabliert werden, was durchaus wünschenswert gewesen wäre. rnWeiterhin wurde Domoinsäure im Zuge der Entwicklung eines neuartigen Testsystems an die Trägerproteine Ovalbumin, Trypsininhibitor und Casein sowie an Biotin konjugiert. Die Kopplungserfolge wurden im ELISA, Western Blot bzw. Dot Blot nachgewiesen. Die Ovalbumin-gekoppelte sowie die biotinylierte Domoinsäure dienten im Folgenden als die zu messenden Größen in den Detektionsassays- die in einer zu untersuchenden Probe vorhandende, kompetitierende Domoinsäure wurde somit indirekt nachgewiesen. rnDer zulässige Höchstwert für Domoinsäure liegt bei 20 µg/g Muschelgewebe. Sowohl mit Biotin-DO als auch mit OVA-DO als den zu messenden Größen waren Domoinsäurekonzentrationen unterhalb dieses Grenzwertes nachweisbar; allerdings erwies sich der Aufbau mit Biotin-DO um das ca. 20-fache empfindlicher als jener mit OVA-DO. rnDie in dieser Arbeit präsentierten Ergebnisse könnten als Grundlage zur Etablierung eines kommerzialisierbaren immunologischen Testsystems zur Detektion von Domoinsäure und anderen Biotoxinen dienen. Nach erfolgreicher Validierung wäre ein solches Testsystem in seiner Handhabung einfacher als die gängige Flüssigkeitschromatographie und besser reproduzierbar als der Maus-Bioassay.rn

Domoic acid is a toxin produced by several species of the diatom Pseudonitzschia. During an algal bloom, it can be accumulated in molluscs such as the mussel Mytilus sp.. Consuming these contaminated mussels, both humans and animals may suffer from severe food poisoning. The symptoms vary from nausea, headache and disorientation to the loss of short term memory (hence known as amnesic shellfish poisoning). Amnesic shellfish poisoning rarely results in death.rnToday’s prevalent methods for the detection of domoic acid in mussel tissue, such as liquid chromatography and the mouse bioassay, are time-consuming and costly. They are also not justifiable for ethical reasons bearing in mind an increase in animal protection. Being highly selective, reproducible and easy in handling, immunological test systems constitute a desirable alternative.rnThe aim of this study was the development of such an immunological test system for the detection of domoic acid. For this purpose, antibodies against domoic acid were raised. To enable the toxin to release an immune response, it was coupled in a first instance to the carrier protein keyhole limpet hemocyanin (KLH), using the carbodiimide method. Rabbits and mice were immunised injecting these KLH domoic acid conjugates by default schemata. After the fourth blood test, the polyclonal rabbit immune serum showed an adequate sensitivity for the antigen; the following detection system was established by means of this polyclonal antibody. By the end of the study, a specific monoclonal antibody against domoic acid was raised successfully. Due to time constraints, it was not possible to establish this antibody in the test system, although it would have been desirable.rnFurthermore, domoic acid was linked to the carrier proteins ovalbumin, trypsin inhibitor and casein as well as to biotin in the course of the development of a novel detection system. The results of the coupling procedures were verified by ELISA and Western Blot respectively Dot Blot technique. The ovalbumin coupled as well as the biotinylated domoic acid were subsequently the factors to be measured in the detection assays, i.e. the competing domoic acid present in a sample to be analyzed was detected indirectly.rnThe allowed maximum of domoic acid is determined as 20 µg/g of mussel tissue. Toxin concentrations below this limit were detectable both using biotinylated and ovalbumin coupled domoic acid as the factors to be measured. However, the construction using biotinylated domoic acid turned out to be twenty times more sensitive than using ovalbumin coupled domoic acid.rnThe results presented in this thesis might provide a basis for the establishment of an immunological test system for the detection of domoic acid and other biotoxins that could be commercialised. After successful validation, a test system like this would be easier in handling than the current liquid chromatography and better reproducible than the mouse bioassay.rn