Immunregulatorische Mechanismen bei einer experimentellen akuten Graft-versus-Host-Disease

Die allogene hämatopoetische Stammzelltransplantation ist bereits seit mehreren Jahrzehnten zur Therapie von Leukämien und anderen malignen Erkrankungen etabliert, aber ihre Effektivität wird durch Graft-versus-Host Reaktionen weiterhin deutlich eingeschränkt. Um die zu Grunde liegenden Mechanismen besser zu verstehen und Möglichkeiten zur Modulation zu untersuchen, wurden in dieser Arbeit verschiedene Ansätze verfolgt.rnRegulatorische T-Zellen sind in der Lage allogene T-Zell-Antworten, wie sie auch bei einer GvH-Erkrankung auftreten zu supprimieren. Es konnte gezeigt werden, dass dies unabhängig von Interleukin-10 geschieht, dafür jedoch ein kontaktabhängiger Mechanismus eine wichtige Rolle spielt. Dabei wird cAMP von Treg über Gap-Junctions in allogene Dendritische Zellen übertragen und deren Aktivierung dadurch verhindert. Versuche zur Modulation dieses Mechanismus mithilfe von Phosphodiesterase-Inhibitoren haben gezeigt, dass diese nicht nur die suppressiven Fähigkeiten von Treg verbessern, sondern ebenfalls direkt auf die T-Zellen einwirken, die schließlich die GvH-Erkrankung auslösen. Diese Ergebnisse konnten in vivo bestätigt werden und zeigen somit einen möglichen Ansatz hin zu einer kombinierten zellulären und pharmakologischen Therapie von GvH-Erkrankungen. Ein großer Vorteil dabei wäre, dass bereits eine Palette an PDE-Inhibitoren in der Klinik zur Verfügung steht.rnInterleukin-10 ist ein immunsuppressives und anti-inflammatorisches Zytokin, dem bei der Regulation des Immunsystems eine wichtige Rolle zukommt. Wie in dieser und anderen Arbeiten gezeigt, ist diese Funktion von IL-10 auch bei GvH-Erkrankungen essentiell. Ein Ziel war es daher, die Zellpopulationen, die für die Produktion des Zytokins verantwortlich sind, zu identifizieren. Mittels einer IL-10 Reporter-Maus konnten B-Zellen vom Spender, wie auch vom Empfänger als IL-10 Produzenten ausgemacht werden. Darüberhinaus zeigen die so gefundenen Zellen auch einen typischen Phänotyp für sog. immunregulatorische B-Zellen. Transplantationsexperimente mit Mäusen, die einen B-Zell-spezifischen Knock-out für IL-10 tragen, konnten die Relevanz der B Zellen als IL-10 Produzenten in vivo belegen.rnDendritische Zellen sind sehr potente Antigenpräsentierende Zellen und somit in der Lage GvH-Reaktionen zu induzieren. Überraschenderweise ist das Überleben von Versuchsmäusen, denen alle DC oder auch nur die BATF3-abhängige Subpopulation der CD8α+ DC fehlt, nicht besser als das des WT, sondern sogar deutlich schlechter. Dies geht einher mit entsprechenden Veränderungen im Zytokinmilieu der peripheren lymphatischen Organe. Bei Abwesenheit der CD8α+ DC sind die Zellen der mesenterialen Lymphknoten nach dem Konditionierungsprotokoll stärkere Stimulatoren für allogene T-Zell-Proliferation, was eine Erklärung für die stärkere GvH-Erkrankung ist. Eine Erklärung für diese Befunde liefert die verringerte Anzahl an Treg, die nach einer Transplantation in Abwesenheit der CD8α+ DC zu beobachten ist.rnDie aufgezeigten immunsupressiven Mechanismen stellen gute Ansatzpunkte dar, um GvH-Erkrankungen besser zu verstehen und damit die Effektivität der allogenen hämatopoetischen Stammzelltransplantation zu verbessern.rn

Charakterisierung der Latenz des murinen Cytomegalovirus in vivo

Die primäre, produktive Cytomegalovirus (CMV)-Infektion wird im immunkompetenten Patienten effizient durch antivirale CD8+ T-Zellen kontrolliert. Das virale Genom besitzt jedoch die Fähigkeit, in einem nicht replikativen, Latenz genannten Zustand, in gewissen Zelltypen zu persistieren, ohne dass infektiöse Nachkommenviren produziert werden. Die molekularen Mechanismen, welche der Etablierung und Aufrechterhaltung der Latenz zugrundeliegen, sind noch weitestgehend unbekannt. Es gibt Hinweise darauf, dass zelluläre Verteidigungsmechanismen die Zirkularisierung und Chromatinisierung viraler Genome hervorrufen und dadurch die virale Genexpression größtenteils verhindert wird (Marks & Spector, 1984; Reeves et al., 2006).rnAllerdings liegen die Genome nicht in einem komplett inaktiven Zustand vor. Vielmehr konnte für das murine CMV (mCMV) bereits die sporadische Transkription der Gene ie1 und ie2 während der Latenz nachgewiesen werden (Kurz et al., 1999; Grzimek et al., 2001).rnIn der vorliegenden Arbeit wurde zum ersten Mal eine umfassende in vivo Latenz-Analyse zur Charakterisierung der viralen Transkription in einer Kinetik anhand der alle drei kinetischen Klassen repräsentierenden Transkripte IE1, IE3, E1, m164, M105 und M86 vorgenommen.rnNach Latenz-Etablierung, verifiziert durch Abwesenheit von infektiösem Virus, konnten alle getesteten Transkripte in der Lunge quantifiziert werden. Interessanterweise war die transkriptionelle Aktivität zu keinem Analyse-Zeitpunkt mit der klassischen IE-E-L-Kinetik der produktiven Infektion kompatibel. Stattdessen lag eine stochastische Transkript-Expression vor, deren Aktivität mit voranschreitender Zeit immer weiter abnahm.rnWährend der Latenz exprimierte Transkripte, die für antigene Peptide kodieren, können infizierte Zellen für das Immunsystem sichtbar machen, was zu einer fortwährenden Restimulation des memory T-Zell-pools führen würde. Durch zeitgleiche Analyse der Transkript-Expression, sowie der Frequenzen Epitop-spezifischer CD8+ T-Zellen während der Latenz (IE1, m164, M105), wurde eine möglicher Zusammenhang zwischen der transkriptionellen Aktivität und der Expansion des memory T-Zell-pools untersucht. Die weitere Charakterisierung von Subpopulationen der Epitop-spezifischen CD8+ T-Zellen identifizierte die SLECs (short-lived-effector cells; CD127low CD62Llow KLRG1high) als die dominante Population in Lunge und Milz während der mCMV-Latenz.rnIn einem weiteren Teil der Arbeit sollte untersucht werden, ob IE-Genexpression zur Etablierung von Latenz notwendig ist. Mit Hilfe der Rekombinanten mCMV-Δie2-DTR, die die Gensequenz des Diphtherietoxin-Rezeptors (DTR) anstelle des Gens ie2 trägt, konnten infizierte, DTR exprimierende Zellen durch eine DT-Applikation konditional depletiert werden.rnIm latent infizierbaren Zelltyp der Leber, den LSECs (liver sinusoidal endothelial cells) wurde die virale Load durch 90-stündige DT–Applikation nach mCMV-Δie2-DTR Infektion auf das Level latent infizierter LSECs reduziert. Diese Daten sprechen für die Hypothese eines von Beginn an inaktiven Genoms, das keine IE-Genexpression zur Latenz-Etablierung benötigt. Zusätzlich stellt dieser Ansatz ein neues Tier-Modell zur Latenz-Etablierung dar. Verringerte Wartezeiten bis zur vollständigen Latenz-Etablierung, im Vergleich zum bisherigen Knochenmarktransplantations-Modell, könnten anfallende Tierhaltungskosten erheblich reduzieren und das Voranschreiten der Forschung beschleunigen.

CD137-selektierte leukämiereaktive T-Zellen gesunder Spender zur adoptiven Immuntherapie stammzelltransplantierter Leukämiepatienten = CD137-selected leukaemia-reactive T Cells from healthy donors for adoptive immunotherapy in stem-cell-transplanted leukaemia-patients

Bei stammzelltransplantierten Patienten, die ein Rezidiv ihrer Leukämie erleiden, kann eine Donor-Lymphozyten-Infusion (DLI) dauerhafte vollständige Leukämieremissionen induzieren. T-Zellen in der DLI vermitteln sowohl den potentiell kurativen Graft-versus-Leukaemia (GVL) Effekt, als auch die potentiell lebensbedrohliche Graft-versus-Host Disease (GVHD). Hingegen könnte die Infusion von leukämiereaktiven T-Zellen einen selektiven GVL Effekt und einen Langzeitschutz vor Rezidiven durch eine spezifisch gegen die Leukämie gerichtete Immunantwort und Immunität vermitteln. Unsere Arbeitsgruppe hat Protokolle zur in vitro Generierung leukämiereaktiver T-Zellen entwickelt, die hohe zytotoxische Aktivität gegen akute myeloische Leukämie-Blasten (AML) bei minimaler Reaktion auf mögliche GVHD Zielstrukturen zeigen. Für die klinische Anwendung sind diese Protokolle jedoch zu aufwändig, wobei vor allem eine erhebliche Verkürzung der Kulturzeit auf wenige Wochen erforderlich ist. Diese Verkürzung der in vitro Kulturzeit könnte das Wachstum von T-Zellen vom central memory oder frühen effector memory Phänotyp fördern, für die eine bessere in vivo Effektorfunktion und längere Persistenz im Rezipienten verglichen mit T-Zellen aus Langzeitkultur gezeigt werden konnte. Der Aktivierungsmarker und Kostimulations-Rezeptor CD137 kann zur Erkennung und Isolation antigenspezifischer T-Zellen genutzt werden, ohne dass dafür das von den T-Zellen erkannte Peptidepitop bekannt sein muss. Eine CD137-vermittelte Anreicherung mit Hilfe von clinical grade Materialien könnte verwendet werden, um DLI-Produkte mit leukämiespezifischen T-Zellen herzustellen, die sich sowohl durch eine effizientere T-Zell Generierung durch in vitro Selektion und Kostimulation, als auch durch eine verbesserte Spezifität des T-Zell-Produkts auszeichnen. Lymphozyten-Leukämie Cokulturen (mixed lymphocyte leukaemia cultures) wurden mit CD8 T-Zellen gesunder Spender und HLA-identischen oder einzel-HLA-mismatch AML-Blasten angesetzt und wöchentlich restimuliert. Nach zwei Wochen wurden die T-Zellen 12 Stunden nach Restimulation über den Marker CD137 positiv isoliert und anschließend separat weiterkultiviert. Die isolierten Fraktionen und unseparierten Kontrollen wurden im ELISPOT-Assay und im Chrom-Freisetzungstest an Tag 5 nach der Restimulation getestet. Es wurden keine konsistent nachweisbaren Vorteile im Hinblick auf Wachstum und Funktion der isolierten CD137-positiv Fraktion im Vergleich zur unseparierten Kontrolle gefunden. Verschiedene Isolationsmethoden, Patient-Spender-Systeme, Methoden zur Restimulation, Temperaturbedingungen, Zytokinkombinationen und Methoden der Zytokinzugabe sowie zusätzliche Feeder-Zellen oder AML-Blasten konnten Wachstum, funktionelle Daten und die deutlichen Zellverluste während der Isolation nicht entscheidend beeinflussen. Vitalfärbungen zeigten, dass aktivierungsinduzierter Zelltod CD137-positiver Zellen zu diesen Ergebnissen beitragen könnte. Im Gegensatz zur Stimulation mit AML-Blasten wurden erfolgreiche CD137-Anreicherungen für peptidstimulierte T-Zellen publiziert. Unterschiedliche CD137-Expressionskinetiken, aktivierungsinduzierter Zelltod und regulatorische T-Zellen sind mögliche Faktoren aufgrund derer die CD137-Anreicherung in diesem spezifischen Kontext ungeeinet sein könnte. Der stimulatorische Effekt eines CD137-Signals auf AML-reaktive CD8 T-Zellen wurde mit Hilfe von CD3/CD28 und CD3/CD28/CD137 Antikörper-beschichteten magnetischen beads untersucht. Für Nierenzellkarzinom-reaktive T-Zellen war die Stimulation mit CD3/CD28/CD137 beads genauso effektiv wie mit Tumorzellen und effektiver als mit CD3/CD28 beads. Beide Arten von beads waren für eine Stimulation während der ersten Wochen der Zellkultur geeignet, sodass ein zusätzliches CD137-Signal für die länger anhaltende Expansion tumorreaktiver T-Zellen zur klinischen Anwendung nützlich sein könnte. Die bead-Expansion veränderte die IFN-Sekretion im ELISPOT nicht, aber verursachte eine mäßige Verschlechterung der Zytotoxizität im Chrom-Freisetzungstest. Im Gegensatz dazu zeigten bei AML-reaktiven T-Zellen beide Arten von beads einen nicht apoptosevermittelten, dosisabhängigen zellschädigenden Effekt, der zu einer raschen Abnahme der Zellzahl in Kulturen mit beads führte. Unerwünschte Effekte auf die T-Zell-Funktionalität durch bead-Stimulation sind in der Literatur beschrieben, dennoch gibt es aktuell keine Veröffentlichungen, die eine fundierte Erklärung für den Effekt auf AML-reaktive T-Zellen bieten könnten. Abgesehen von Literaturdaten, die darauf hindeuten, dass CD137 ein vielversprechendes Kandidatenmolekül für die Anreicherung und Expansion von AML-reaktiven T-Zellen sein könnte, zeigen die eigenen Daten sowohl zur CD137-Isolation als auch zur bead-Stimulation, dass für diese spezielle Anwendung CD137 ein ungeeigneter Aktivierungsmarker und Kostimulations-Ligand ist.

Einfluss Zelltod-inhibierender Proteine des murinen Cytomegalovirus auf die Initiation der antiviralen CD8 T-Zellantwort

Die Inhibition des programmierten Zelltods ist ein essentieller Faktor der viralen Replikationsfähigkeit. Das murine Cytomegalovirus kodiert deshalb für verschiedene Zelltod-inhibierende Gene, um dem programmierten Zelltod zu entgehen bis die Virusproduktion abgeschlossen ist. Da die Expression des viralen anti-apoptotischen Gens M36 infizierte Makrophagen vor der Apoptose schützt (Menard et al., 2003), wurde in der vorliegenden Arbeit unter Verwendung der Deletionsmutante mCMV-ΔM36 (ΔM36) der Einfluss von Apoptose auf das Priming Epitop-spezifischer CD8 T-Zellen untersucht.rnInteressanterweise waren die Frequenzen mCMV-spezifischer CD8 T-Zellen nach Infektion mit ΔM36 für alle getesteten Epitope sowohl im Haplotyp H-2d als auch im Haplotyp H-2b deutlich erhöht. Zusätzlich konnte mit Hilfe der mCMV-ORF-Library eine Verbreiterung des CD8 T-Zellepitop-Repertoire nach Infektion mit ΔM36 nachgewiesen werden, was neben der quantitativen auch eine qualitative Steigerung des CD8 T-Zell-Primings aufzeigt.rnIn der funktionellen Revertante ΔM36-FADDDN wird die anti-apoptotische Funktion durch eine dominant-negative Form des zellulären Adapterproteins FADD (FADDDN) substituiert (Cicin-Sain et al., 2008), die das Apoptose-Signaling verhindert. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass die Expression von FADDDN nicht nur den Apoptose-Phänotyp wieder revertiert, sondern auch die Verbesserung des CD8 T-Zell-Primings aufhebt. Diese Beobachtung belegt eindeutig, dass das verbesserte CD8 T-Zell-Priming auf einer verstärkten Apoptose-Induktion beruht.Bemerkenswerterweise konnte das verbesserte Priming auch nach Deletion des anti-nekroptotischen Gens M45 nachgewiesen werden. So konnte nach Infektion mit mCMV-M45-BamX (M45-BamX) (Brune et al., 2001) gezeigt werden, dass auch die Induktion der Nekroptose zu einem verbesserten CD8 T-Zell-Priming sowie zu einer Verbreiterung des CD8 T-Zellepitop-Repertoires führt.Nach Infektion von Cross-Priming-defizienten 3d-Mäusen (Tabeta et al., 2006) konnte eine Steigerung mCMV-spezifischer CD8 T-Zell-Frequenzen in Abwesenheit von M36 oder M45 nicht beobachtet werden. Dieser Befund lässt auf ein erhöhtes Cross-Priming von CD8 T-Zellen durch ΔM36 oder M45-BamX infolge einer verstärkten Induktion des programmierten Zelltods schließen.rnIn der vorliegenden Arbeit konnte erstmals gezeigt werden, dass die Inhibition des programmierten Zelltods durch die mCMV-Gene M36 und M45 das CD8 T-Zell-Priming limitiert. Somit fördern virale Zelltod-inhibierende Gene die virale Replikationsfähigkeit, indem sie die Virusproduktion per se in der individuellen Zelle steigern und zusätzlich die Immunkontrolle reduzieren, was wiederum eine verbesserte Dissemination in vivo ermöglicht.

Untersuchungen der Aktivierungs- und Effektorwege von T-Helferzellen in der Pathogenese vaskulärer inflammatorischer Prozesse

T-Zellen sind an der Induktion und Erhaltung chronischer Entzündungen maßgeblich beteiligt. Im Bereich kardiovaskulärer Erkrankungen konnte eine Beteiligung von T-Zellen an der Entstehung von Ateriosklerose, Bluthochdruck und arterieller Thrombose aufgezeigt werden. Allerdings sind sowohl die Mechanismen ihrer Aktivierung, als auch die für die Entstehung und Persistenz vaskulärer Entzündung relevanten Effektorfunktionen weitgehend unbekannt. rnIn der vorliegenden Arbeit konnte erstmals in zwei Mausmodellen gezeigt werden, dass sowohl die dem Bluthochdruck zugrundeliegende Entzündung der Arterienwände als auch die durch venöse Thrombose ausgelöste Entzündung der Venenwand zu einer selektiven Einwanderung von CD4+ und CD8+ T-Zellen mit einem Effektor-Gedächtniszell-Phänotyp führt. Mit Hilfe von Nur77-GFP-transgenen Mäusen konnte gezeigt werden, dass die in die entzündeten Gefäßwände eingewanderten T-Zellen lokal T-Zell-Rezeptor-unabhängig aktiviert werden.rnBluthochdruck und venöse Thrombose sind durch eine verstärkte Expression eines ähnlichen Musters an Zytokinen und Chemokinen in den Gefäßwänden begleitet, das in rekombinanter Form in einem Teil der Effektor-T-Gedächtniszellen die Bildung von IFN-γ auslöst. Die in dieser Arbeit vorgestellten Ergebnisse weisen erstmals eine Beteiligung von T-Zellen an der Entzündung der Venenwand im Rahmen einer venösen Thrombose nach. Des Weiteren konnten erstmals Hinweise darauf gefunden werden, dass T-Zellen Gefäßentzündungen durch eine Zytokin-induzierte IFN-γ-Bildung erhalten und verstärken.rn

The role of SENP1 in B cell development and differentiation

SUMOylation is a highly dynamic and reversible posttranslational protein modification closely related to ubiquitination. SUMOylation regulates a vast array of different cellular functions, such as cell cycle, nuclear transport, DNA damage response, proliferation and transcriptional activation. Several groups have shown in in vitro studies how important SUMOylation is for early B cell development and survival as well as for later plasma cell differentiation. This thesis focuses on the deSUMOylation protease SENP1 and its in vivo effects on B cell development and differentiation. For this a conditional SENP1 knockout mouse model was crossed to the CD19-Cre mouse strain to generate a B cell specific SENP1 knockout mouse.rnIn our conditional SENP1ff CD19-Cre mouse model we observed normal numbers of all B cell subsets in the bone marrow. However in the spleen we observed an impairment of B cell survival, based on a 50% reduction of the follicular B cell compartment, whereas the marginal zone B cell compartment was unchanged. T cell numbers were comparable to control mice. rnFurther, impairments of B cell survival in SENP1ff CD19-Cre mice were analysed after in vivo blocking of IL7R signalling. The αIL7R treatment in mature mice blocked new B cell formation in the bone marrow and increased apoptosis rates could be observed in splenic SENP1 KO B cells. Additionally, a higher turnover rate of B cells was measured by in vivo BrdU incorporation.rnSince it is known that the majority of transcription factors that are important for the maintenance of the germinal centre reaction or for induction of plasma cell development are SUMOylated, the question arose, how defective deSUMOylation will manifest itself in these processes. The majority of in vitro cultured splenic B cells, stimulated to undergo class switch recombination and plasma cell differentiation underwent activation induced cell death. However, the surviving cells increasingly differentiated into IgM expressing plasma cells. Class switch recombination to IgG1 was reduced. These observations stood in line with observation made in in vivo sheep red blood cell immunization experiments, which showed increased amounts of germinal centres and germinal centre B cells, as well as increased amounts of plasma cells differentiation in combination with decreased class switch to IgG1.rnThese results lead to the conclusion that SENP1 KO B cells increasingly undergo apoptosis, however, B cells that survive SENP1 deficiency are more prone to undergo plasma cell differentiation. Further, the precursors of these plasma cells either are not as capable of undergoing class switch recombination or they do switch to IgG1 and succumb to activation induced cell death. One possible explanation for both scenarios could be a defective DNA damage response mechanisms during class switch recombination, caused by impaired deSUMOylation. rn

Synthese und zytotoxische Eigenschaften neuartiger Doxorubicinderivate

Der Fokus dieser Arbeit lag auf der Darstellung modifizierter Doxorubicin-Moleküle, um die mit der therapeutischen Anwendung verbundenen Hindernisse wie DNA-Bindungsaffinität, Tumorselektivität, Zell- sowie Nukleusakkumulation, Arzneistoffaufnahme und -resistenz zu überwinden. Für die Bewältigung dieser Limitierungen wurde das Anthrazyklin mit einem weiteren Arzneistoffmolekül sowie verschiedenen Peptiden und Proteinen funktionalisiert. Hierbei wurde zur Modifikation das aliphatische Keton des Arzneistoffs, unter Ausbildung von hydrolysestabilen Oximen, als Hauptstrukturelement verwendet. Wie Raymond B. Weiss bereits vor mehr als 20 Jahren erkannt hat, ist die Suche nach Anthrazyklinen mit besseren pharmakologischen Eigenschaften als die des Doxorubicin ein äußerst schwieriges Unterfangen. Die in dieser Arbeit dargestellten Doxorubicinderivate haben diverse Ansätze verfolgt, um dem „perfekten“ Anthrazyklin ein Stück näher zu kommen. Auch wenn dieses Ziel mit den bisher untersuchten Arzneistoffabkömmlingen noch nicht vollständig erreicht werden konnte, haben derartige Verbindungen ein außerordentlich großes Potential das sogenannte „bessere Doxorubicin“ in naher Zukunft ausfindig zu machen.

Etablierung eines high content imaging-basierten in vitro Testsystems zur Evaluierung genotoxischer Substanzen

Zur Registrierung von Pharmazeutika ist eine umfassende Analyse ihres genotoxischen Potentials von Nöten. Aufgrund der Vielzahl genotoxischer Mechanismen und deren resultierenden Schäden wird ein gestaffeltes Testdesign durch die ICH-Richtlinie S2(R1) „Guidance on genotoxicity testing and data interpretation for pharmaceuticals intended for human use S2(R1)“ definiert, um alle genotoxischen Substanzen zu identifizieren. Die Standardtestbatterie ist in der frühen Phase der Arzneimittelentwicklung aufgrund des geringen Durchsatzes und des Mangels an verfügbarer Substanzmenge vermindert anwendbar. Darüber hinaus verfügen in vitro Genotoxizitätstests in Säugerzellen über eine relativ geringe Spezifität. Für eine vollständige Sicherheitsbeurteilung wird eine in vivo Testung auf Kanzerogenität benötigt. Allerdings sind diese Testsysteme kosten- und zeitintensiv. Aufgrund dessen zielen neue Forschungsansätze auf die Verbesserung der Prädiktivität und die Erfassung des genotoxischen Potentials bereits in der frühen Phase der Arzneimittelentwicklung ab. Die high content imaging (HCI)-Technologie offeriert einen Ansatz zur Verbesserung des Durchsatzes verglichen mit der Standardtestbatterie. Zusätzlich hat ein Zell-basiertes Modell den Vorteil Daten relativ schnell bei gleichzeitig geringem Bedarf an Substanzmenge zu generieren. Demzufolge ermöglichen HCI-basierte Testsysteme eine Prüfung in der frühen Phase der pharmazeutischen Arzneimittelentwicklung. Das Ziel dieser Studie ist die Entwicklung eines neuen, spezifischen und sensitiven HCI-basierten Testsytems für Genotoxine und Progenotoxine in vitro unter Verwendung von HepG2-Zellen gewesen. Aufgrund ihrer begrenzten metabolischen Kapazität wurde ein kombiniertes System bestehend aus HepG2-Zellen und einem metabolischen Aktivierungssystem zur Testung progenotoxischer Substanzen etabliert. Basierend auf einer vorherigen Genomexpressionsprofilierung (Boehme et al., 2011) und einer Literaturrecherche wurden die folgenden neun unterschiedlichen Proteine der DNA-Schadensantwort als putative Marker der Substanz-induzierten Genotoxizität ausgewählt: p-p53 (Ser15), p21, p-H2AX (Ser139), p-Chk1 (Ser345) p-ATM (Ser1981), p-ATR (Ser428), p-CDC2 (Thr14/Tyr15), GADD45A und p-Chk2 (Thr68). Die Expression bzw. Aktivierung dieser Proteine wurde 48 h nach Behandlung mit den (pro-) genotoxischen Substanzen (Cyclophosphamid, 7,12-Dimethylbenz[a]anthracen, Aflatoxin B1, 2-Acetylaminofluoren, Methylmethansulfonat, Actinomycin D, Etoposid) und den nicht-genotoxischen Substanzen (D-Mannitol, Phenforminhydrochlorid, Progesteron) unter Verwendung der HCI-Technologie ermittelt. Die beste Klassifizierung wurde bei Verwendung der folgenden fünf der ursprünglichen neun putativen Markerproteine erreicht: p-p53 (Ser15), p21, p-H2AX (Ser139), p-Chk1 (Ser345) und p-ATM (Ser1981). In einem zweiten Teil dieser Arbeit wurden die fünf ausgewählten Proteine mit Substanzen, welche von dem European Centre for the Validation of Alternative Methods (ECVAM) zur Beurteilung der Leistung neuer oder modifizierter in vitro Genotoxizitätstests empfohlen sind, getestet. Dieses neue Testsystem erzielte eine Sensitivität von 80 % und eine Spezifität von 86 %, was in einer Prädiktivität von 84 % resultierte. Der synergetische Effekt dieser fünf Proteine ermöglicht die Identifizierung von genotoxischen Substanzen, welche DNA-Schädigungen durch eine Vielzahl von unterschiedlichen Mechanismen induzieren, mit einem hohen Erfolg. Zusammenfassend konnte ein hochprädiktives Prüfungssystem mit metabolischer Aktivierung für ein breites Spektrum potenziell genotoxischer Substanzen generiert werden, welches sich aufgrund des hohen Durchsatzes, des geringen Zeitaufwandes und der geringen Menge benötigter Substanz zur Substanzpriorisierung und -selektion in der Phase der Leitstrukturoptimierung eignet und darüber hinaus mechanistische Hinweise auf die genotoxische Wirkung der Testsubstanz liefert.

Identifizierung und Charakterisierung von Zielantigenen alloreaktiver zytotoxischer T-Zellen mittels cDNA-Bank-Expressionsklonierung in akuten myeloischen Leukämien

Allogene hämatopoetische Stammzelltransplantationen (HSZTs) werden insbesondere zur Behandlung von Patienten mit Hochrisiko-Leukämien durchgeführt. Dabei bewirken T-Zellreaktionen gegen Minorhistokompatibilitätsantigene (mHAgs) sowohl den therapeutisch erwünschten graft-versus-leukemia (GvL)-Effekt als auch die schädigende graft-versus-host (GvH)-Erkrankung. Für die Identifizierung neuer mHAgs mittels des T-Zell-basierten cDNA-Expressionsscreenings waren leukämiereaktive T-Zellpopulationen durch Stimulation naïver CD8+-T-Lymphozyten gesunder HLA-Klasse I-identischer Buffy Coat-Spender mit Leukämiezellen von Patienten mit akuter myeloischer Leukämie (AML) generiert worden (Albrecht et al., Cancer Immunol. Immunother. 60:235, 2011). Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde mit diesen im AML-Modell des Patienten MZ529 das mHAg CYBA-72Y identifiziert. Es resultiert aus einem bekannten Einzelnukleotidpolymorphismus (rs4673: CYBA-242T/C) des Gens CYBA (kodierend für Cytochrom b-245 α-Polypeptid; syn.: p22phox), der zu einem Austausch von Tyrosin (Y) zu Histidin (H) an Aminosäureposition 72 führt. Das mHAg wurde von T-Lymphozyten sowohl in Assoziation mit HLA-B*15:01 als auch mit HLA-B*15:07 erkannt. Eine allogene T-Zellantwort gegen CYBA-72Y wurde in einem weiteren AML-Modell (MZ987) beobachtet, die ebenso wie in dem AML-Modell MZ529 polyklonal war. Insgesamt konnte bei drei von fünf getesteten HLA-B*15:01-positiven Buffy Coat-Spendern, die homozygot für CYBA-72H (H/H) waren, eine CYBA-72Y-spezifische T-Zellantwort generiert werden. Das von den T-Lymphozyten übereinstimmend in niedrigster Konzentration erkannte Peptid umfasste die Aminosäuren 69 - 77, wobei das homologe Peptid aus CYBA-72H auch in hohen Konzentrationen keine Reaktivität auslöste. Eine reziproke Immunogenität des mHAg ist bislang nicht belegt. T-Lymphozyten gegen CYBA-72Y erkannten Leukämiezellen bei acht von zwölf HLA-B*15:01-positiven Patienten (FAB-Subtypen: M1, M2, M4, M5). Da das Gen CYBA für eine Komponente des mikrobiziden Oxidasesystems von phagozytierenden Zellen kodiert, ist es überwiegend in Zellen des hämatopoetischen Systems exprimiert. Von Leukozytensubtypen, aufgereinigt aus HLA-B*15:01-positiven Buffy Coat-Spendern mit CYBA-242T-Allel, wurden Monozyten und daraus abgeleitete dendritische Zellen durch CYBA-72Y-reaktive T-Lymphozyten sehr stark, untransformierte B-Zellen in weit geringerem Maße und Granulozyten sowie T-Lymphozyten nicht erkannt. Das für CYBA-72Y kodierende Allel CYBA-242T wurde bei 56% aller getesteten gesunden Spender und Malignompatienten (n=481) nachgewiesen. Unter Berücksichtigung der Häufigkeit des präsentierenden HLA-Allels ist davon auszugehen, dass etwa 4,5% der Kaukasier das mHAg CYBA-72Y zusammen mit HLA-B*15:01 tragen. Nach bisherigen Beobachtungen führt ein immunogener CYBA-72Y-Mismatch bei allogenen HSZTs nicht notwendigerweise zu einer schweren GvH-Erkrankung. Das hier beschriebene mHAg CYBA-72Y erscheint potenziell geeignet, im Rahmen einer allogenen HSZT die präferenzielle Elimination der Empfänger-Hämatopoese unter Einschluss von myeloischen Leukämiezellen zu bewirken. Jedoch sind weiterführende Untersuchungen erforderlich, um die therapeutische Relevanz des Antigens zu belegen.

Die Rolle von Chemokinrezeptor CXCR4 und Connective Tissue Growth Factor innerhalb der Tumor-Stroma-Interaktion in der akuten myeloischen Leukämie

Die akute myeloische Leukämie (AML) ist eine heterogene Erkrankung der hämatopoetischen Vorläuferzelle, die durch unkontrollierte Vermehrung und ein reduziertes Differenzierungsverhalten gekennzeichnet ist. Aufgrund von Therapieresistenzen und häufig vorkommenden Rückfällen ist die AML mit einer schlechten Langzeitprognose verbunden. Neue Studienergebnisse zeigen, dass leukämische Zellen einer hierarchischen Ordnung unterliegen, an deren Spitze die leukämische Stammzelle (LSC) steht, welche den Tumor speist und ähnliche Charakteristika besitzt wie die hämatopoetische Stammzelle. Die LSC nutzt den Kontakt zu Zellen der hämatopoetischen Nische des Knochenmarks, um die erste Therapie zu überdauern und Resistenzen zu erwerben. Neue Therapieansätze versuchen diese Interaktion zwischen leukämischen Zellen und supportiv wirkenden Stromazellen anzugreifen. rnrnIn dieser Arbeit sollte die Bedeutung des CXC-Motiv Chemokinrezeptors Typ 4 (CXCR4) und des Connective Tissue Growth Factors (CTGF) innerhalb der AML-Stroma-Interaktion untersucht werden. CXCR4, der in vivo dafür sorgt, dass AML-Zellen in der Nische gehalten und geschützt werden, wurde durch den neuwertigen humanen CXCR4-spezifischen Antikörper BMS-936564/MDX-1338 in AML-Zelllinien und Patientenzellen in Zellkulturversuchen blockiert. Dies induzierte Apoptose sowie Differenzierung und führte in Kokulturversuchen zu einer Aufhebung des Stroma-vermittelten Schutzes gegenüber der Chemotherapie. Für diese Effekte musste teilweise ein sekundärer Antikörper verwendet werden, der die CXCR4-Moleküle miteinander kreuzvernetzt.rnDie Auswertung eines quantitativen Real time PCR (qPCR)-Arrays ergab, dass CTGF in der AML-Zelllinie Molm-14 nach Kontakt zu Stromazellen hochreguliert wird. Diese Hochregulation konnte in insgesamt drei AML-Zelllinien sowie in drei Patientenproben in qPCR- und Western Blot-Versuchen bestätigt werden. Weitere Untersuchungen zeigten, dass diese Hochregulation (i) unabhängig von der Stromazelllinie ist, (ii) den direkten Kontakt zum Stroma benötigt und (iii) auch unter hypoxischen Bedingungen, wie sie innerhalb des Knochenmarks vorherrschen, stattfindet. Der durch Zell-Zell- oder Zell-Matrix-Kontakt gesteuerte Hippo-Signalweg konnte aus folgenden Gründen als möglicher upstream-Regulationsmechanismus identifiziert werden: (i) Dessen zentraler Transkriptions-Kofaktor TAZ wurde in kokultivierten Molm-14-Zellen stabilisiert, (ii) der shRNA-gesteuerte Knockdown von TAZ führte zu einer reduzierten CTGF-Hochregulation, (iii) CTGF wurde in Abhängigkeit von der Zelldichte reguliert, (iv) Cysteine-rich angiogenic inducer 61 (Cyr61), ein weiteres Zielgen von TAZ, wurde in kokultivierten AML-Zellen ebenfalls verstärkt exprimiert. Der Knockdown von CTGF führte in vitro zu einer partiellen Aufhebung der Stroma-vermittelten Resistenz und die Blockierung von CTGF durch den Antikörper FG-3019 wirkte im AML-Mausmodell lebensverlängernd. rn rnDie Rolle von CTGF in der AML ist bisher nicht untersucht. Die vorliegenden Ergebnisse zeigen, dass CTGF ein interessantes Therapieziel in der AML darstellt. Es bedarf weiterer Untersuchungen, um die Bedeutung von CTGF in der Tumor-Stroma-Interaktion näher zu charakterisieren und nachgeschaltete Signalwege zu identifizieren.

Safety and therapeutic efficacy of adoptive p53-specific T cell antigen receptor (TCR) gene transfer

Immunotherapy with T cells genetically modified by retroviral transfer of tumor-associated antigen (TAA)-specific T cell receptors (TCR) is a promising approach in targeting cancer. Therefore, using a universal TAA to target different tumor entities by only one therapeutic approach was the main criteria for our TAA-specific TCR. Here, an optimized (opt) αβ-chain p53(264-272)-specific and an opt single chain (sc) p53(264-272)-specific TCR were designed, to reduce mispairing reactions of endogenous and introduced TCR α and TCR β-chains, which might lead to off-target autoimmune reactions, similar to Graft-versus-host disease (GvHD). rnIn this study we evaluated the safety issues, which rise by the risk of p53TCR gene transfer-associated on/off-target toxicities as well as the anti-tumor response in vivo in a syngeneic HLA-A*0201 transgenic mouse model. We could successfully demonstrate that opt sc p53-specific TCR-redirected T cells prevent TCR mispairing-mediated lethal off-target autoimmunity in contrast to the parental opt αβ-chain p53-specific TCR. Since the sc p53-specific TCR proofed to be safe, all further studies were performed using sc p53-specific TCR redirected T cells only. Infusion of p53-specific TCR-redirected T cells in Human p53 knock-in (Hupki) mice after lymphodepletion-preconditioning regimen with either sublethal body irradiation (5Gy) or chemotherapy (fludarabine and cyclophosphamide) in combination with vaccination (anti-CD40, CpG1668 and p53(257-282) peptide) did not result in a depletion of hematopoietic cells. Moreover, adoptive transfer of high numbers of p53-specific TCR-redirected T cells in combination with Interleukin 2 (IL-2) also did not lead to toxic on-target reactions. The absence of host tissue damage was confirmed by histology and flow cytometry analysis. Furthermore, p53-specific TCR-redirected T cells were able to lyse p53+A2.1+ tumor cells in vitro. However, in vivo studies revealed the potent suppressive effect of the tumor microenvironment (TME) mediated by tumor-infiltrating myeloid-derived suppressor cells (MDSC). Accordingly, we could improve an insufficient anti-tumor response in vivo after injection of the sc p53-specific TCR-redirected T cells by additional depletion of immunosuppressive cells of the myeloid lineage.rnTogether, these data suggest that the optimized sc p53(264-272)-specific TCR may represent a safe and efficient approach for TCR-based gene therapy. However, combinations of immunotherapeutic strategies are needed to enhance the efficacy of adoptive cell therapy (ACT)-mediated anti-tumor responses.

Untersuchung der DNA-Reparatur in humanen Lymphozyten

Oxidative DNA-Schäden, wie 7,8-Dihydro-8-oxoguanin (8-oxoG), werden kontinuierlich in allen Zellen durch endogene und exogene Noxen gebildet. Ohne eine effektive Reparatur können DNA-Schäden nach erfolgter Replikation als Mutationen fixiert werden und somit die Kanzerogenese initiieren.rnUntersuchungsgegenstand dieser Arbeit war die Reparatur, vorrangig von oxidativen DNA-Schäden, in humanen Lymphozyten. Dabei sollte ebenfalls überprüft werden, inwiefern eine Aktivierung dieser Immunzellen, die u.a. zu einer Initiierung der Proliferation führt, modulierend auf die DNA-Reparatur wirkt. Für diese Untersuchungen wurden primäre Lymphozyten aus Buffy Coats isoliert. Eine Aktivierung von T Lymphozyten, welche physiologisch Antigen-vermittelt über den T-Zell-Rezeptor verläuft, wurde durch eine ex vivo Stimulation mit Phytohämagglutinin (PHA) nachgeahmt. Die Induktion oxidativer DNA-Basenmodifikationen erfolgte mit Hilfe des Photosensibilisators Acridinorange in Kombination mit sichtbarem Licht. Das Schadensausmaß sowie die Reparatur wurden mittels der Alkalischen Elution unter Nutzung der Reparaturendonuklease Fpg bestimmt.rnDie Ergebnisse zeigten, dass global keine Reparatur induzierter oxidativer DNA-Schäden in primären Lymphozyten stattfindet. Eine Aktivierung der Lymphozyten mittels PHA führte hingegen zu einer deutlichen Reduktion der induzierten DNA-Schäden innerhalb einer 24-stündigen Reparaturzeit. Diese verbesserte Reparatur konnte auf eine Steigerung der Transkription und somit eine erhöhte Proteinmenge von OGG1, welches die Reparatur von 8-oxoG DNA-Glykosylase initiiert, zurückgeführt werden. Weiterführende mechanistische Untersuchungen deuten darauf hin, dass der transkriptionellen Regulation von OGG1 eine Aktivierung der JNK-Signalkaskade zugrunde liegt. Als ein verantwortlicher Transkriptionsfaktor konnte NF-YA identifiziert werden. Dessen erhöhte Bindung am OGG1-Promotor in Folge einer PHA-Stimulation konnte durch eine JNK-Hemmung reduziert werden.rnDie Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass eine Aktivierung von Lymphozyten, welche die Proliferation initiiert und dadurch mit dem Risiko für die Entstehung von Mutationen und malignen Entartungen verknüpft ist, gleichzeitig eine transkriptionelle Hochregulation von OGG1 bewirkt, die die Reparatur oxidativer DNA-Schäden sicherstellt. Die Fähigkeit zur Steigerung der DNA-Reparatur unter den gezeigten Bedingungen bietet den proliferierenden Zellen einen Schutzmechanismus zur Erhaltung ihrer genomischen Stabilität.rn

Der Einfluss des Endocannabinoidsystems auf die Alzheimer Pathologie

Die Alzheimer Krankheit ist eine der häufigsten neurodegenerativen Erkrankungen, deren Ursache, abgesehen von einem geringen Prozentsatz vererbter Formen, bisher nicht bekannt ist. Ein wichtiges Ziel der Grundlagenforschung liegt derzeit in der Modulation der APP-spaltenden Enzyme. Durch die Modulation dieser Enzyme könnten weniger schädigende Amyloid β-Peptide entstehen. Die Aktivität des ECS ist in vielen neurodegenerativen Krankheiten verändert. Protektive Eigenschaften der Cannabinoidrezeptoren wurden bei der Alzheimer Krankheit beschrieben. Deshalb sollte in dieser Arbeit der Einfluss des ECS auf die Pathogenese der Alzheimer Erkrankung untersucht werden. In Zellkultursystemen wurde der Einfluss von Cannabinoiden auf die Prozessierung des Amyloid-Vorläuferproteins analysiert. Durch Inkubation der Zellen mit CB1-Rezeptor Agonisten konnte die APP-Prozessierung zugunsten von sAPPα moduliert werden. Gleichzeitig führte die Inkubation mit Cannabinoiden zur reduzierten Amyloid β Menge im Medium der Zellen. In dieser Arbeit konnte die APP-Prozessierung durch die Aktivierung des CB1-Rezeptors zugunsten des nicht-amyloiden Wegs moduliert werden.rnIn einem Tiermodell wurde der Einfluss des CB1-Rezeptors in APP23 transgenen Mäusen untersucht. Der Knockout des CB1-Rezeptors führte in APP23 transgenen Tieren zu weitreichenden biochemischen Veränderungen. APP23/CB1-/--Tiere zeigten eine erhöhte Mortalität und ein sehr geringes Durchschnittsgewicht. Im Vergleich zu APP23/CB1+/+-Tieren führte der CB1-Rezeptor Knockout zur Reduktion der APP-Expression und dessen Prozessierungsprodukten. In den histologischen Untersuchungen wurde eine reduzierte Anzahl an amyloiden Plaques, sowie eine reduzierte Neuroinflammation ermittelt. Biochemische Untersuchungen zeigten, dass der CB1-Rezeptor einen möglichen regulatorischen Einfluss auf die Expression und Prozessierung von APP ausübt. Die Tiere mit der geringsten Plaque-Menge (APP23/CB1-/-) und einer reduzierten Prozessierung von sAPPα- und den CTFs zeigten die schlechteste Lernleistung im Morris Water-Maze. Deshalb müssen andere Faktoren (z.B. die Degradation der Myelinschicht) für die schlechte Lernleistung verantwortlich sein. Mit einem zweiten Tiermodell könnte in CB1-Knockout Mäusen durch den viral-vermittelten Gentransfer eine mögliche Toxizität von Aβ Peptiden untersucht werden. Die in dieser Arbeit ermittelten Ergebnisse zeigen, dass der CB1-Rezeptor an der Regulation der APP-Prozessierung beteiligt ist und zu proteinbiochemischen Veränderungen im Zell- und Tiermodell führt.

Etablierung eines Triple-Kultur-Modells der oberen Atemwege unter Einbeziehung immunkompetenter Zellen

Organophosphate können chronische Lungenerkrankungen und Vergiftungen hervorrufen. Bei der Vergiftung erfolgt eine Immunreaktion, welche noch nicht erforscht ist. In dieser Arbeit wurden Toxizitätsstudien an dendritischen Zellen und einem bronchialen Triple-Kultur-Modell durchgeführt. Dendritische Zellen spielen bei der ersten Immunabwehr in der Lunge eine große Rolle. Aus der Zell-Linie THP-1 und primären Monozyten wurden reife dendritische Zellen differenziert und mittels Durchflusszytometrie und Immunfluoreszenz auf spezifische Zellmarker, wie zum Beispiel CD11c, CD83 oder auch CD209, charakterisiert und etabliert. Durch die Vergiftung der Zellen mit Dimethoat und Chlorpyrifos konnte eine Erhöhung des Zelltodes, die Sekretion von proinflammatorischen Mediatoren, Veränderungen in der Morphologie der Zellen und ein Effekt auf den Proteinkinase-Signalweg festgestellt werden. Spezifische dendritische Zellmarker (CD83, CD209) wurden inhibiert und die Dendriten der Dendritischen Zellen kürzer und beschädigt. Die Schädigung von Chlorpyrifos war erheblich größer, als die bei Dimethoat.rnDie weiteren Toxizitätsstudien wurden an einem bronchialen Triple-Kultur-Modell durchgeführt. Hierzu wurden auf Transwell-Filtermembranen bronchiale Epithelzellen, Fibroblastenzellen und Dendritische Zellen verwendet. Die bronchialen Epithelzellen und Fibroblastenzellen waren hier physiologisch voneinander getrennt, konnten aber durch Poren in der Membran miteinander interagieren. Die Etablierung des Triple-Kultur-Modells erfolgte durch die Untersuchung von Entzündungsprozessen, durch Stimulation mit LPS, TNF-alpha und Interferon-gamma. In der Ko-Kultur konnten Zell-Zell-Kontakt Schädigungen und Erhöhung von proinflammatorischen Markern, wie zum Beispiel IL-1ß, IL-6 oder auch IL-8 gemessen werden. Versuche in der Triple-Kultur zeigten den positiven Effekt von Dendritischen Zellen. Bei höheren Konzentrationsbereichen von Dimethoat und Chlorpyrifos konnte ein Wandern der Zellen zu den geschädigten Zell-Zell-Kontakten nachgewiesen werden. Die Ausschüttung der proinflammatorischen Mediatoren wurde inhibiert, vor allem bei IL-10 war eine deutliche Reduktion, um mehr als 70% messbar. Ebenso konnten Veränderungen in dem Apoptose-Signalblick festgestellt werden. Vor allem anti-apoptotische Proteine wurden nach einer Vergiftung der Triple-Kultur induziert. Interventionsstudien mit Vitamin C zeigten allerdings keinen positiven Effekt.

Detrimental effects of exuberant and restrained immune responses against the central nervous system in the context of multiple sclerosis and glioblastoma multiforme

Glioblastoma multiforme (GBM) is the most common and most aggressive astrocytic tumor of the central nervous system (CNS) in adults. The standard treatment consisting of surgery, followed by a combinatorial radio- and chemotherapy, is only palliative and prolongs patient median survival to 12 to 15 months. The tumor subpopulation of stem cell-like glioma-initiating cells (GICs) shows resistance against radiation as well as chemotherapy, and has been suggested to be responsible for relapses of more aggressive tumors after therapy. The efficacy of immunotherapies, which exploit the immune system to specifically recognize and eliminate malignant cells, is limited due to strong immunosuppressive activities of the GICs and the generation of a specialized protective microenvironment. The molecular mechanisms underlying the therapy resistance of GICs are largely unknown. rnThe first aim of this study was to identify immune evasion mechanisms in GICs triggered by radiation. A model was used in which patient-derived GICs were treated in vitro with fractionated ionizing radiation (2.5 Gy in 7 consecutive passages) to select for a more radio-resistant phenotype. In the model cell line 1080, this selection process resulted in increased proliferative but diminished migratory capacities in comparison to untreated control GICs. Furthermore, radio-selected GICs downregulated various proteins involved in antigen processing and presentation, resulting in decreased expression of MHC class I molecules on the cellular surface and diminished recognition potential by cytotoxic CD8+ T cells. Thus, sub-lethal fractionated radiation can promote immune evasion and hamper the success of adjuvant immunotherapy. Among several immune-associated proteins, interferon-induced transmembrane protein 3 (IFITM3) was found to be upregulated in radio-selected GICs. While high expression of IFITM3 was associated with a worse overall survival of GBM patients (TCGA database) and increased proliferation and migration of differentiated glioma cell lines, a strong contribution of IFITM3 to proliferation in vitro as well as tumor growth and invasiveness in a xenograft model could not be observed. rnMultiple sclerosis (MS) is the most common autoimmune disease of the CNS in young adults of the Western World, which leads to progressive disability in genetically susceptible individuals, possibly triggered by environmental factors. It is assumed that self-reactive, myelin-specific T helper cell 1 (Th1) and Th17 cells, which have escaped the control mechanisms of the immune system, are critical in the pathogenesis of the human disease and its animal model experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE). It was observed that in vitro differentiated interleukin 17 (IL-17) producing Th17 cells co-expressed the Th1-phenotypic cytokine Interferon-gamma (IFN-γ) in combination with the two respective lineage-associated transcription factors RORγt and T-bet after re-isolation from the CNS of diseased mice. Pathogenic molecular mechanisms that render a CD4+ T cell encephalitogenic have scarcely been investigated up to date. rnIn the second part of the thesis, whole transcriptional changes occurring in in vitro differentiated Th17 cells in the course of EAE were analyzed. Evaluation of signaling networks revealed an overrepresentation of genes involved in communication between the innate and adaptive immune system and metabolic alterations including cholesterol biosynthesis. The transcription factors Cebpa, Fos, Klf4, Nfatc1 and Spi1, associated with thymocyte development and naïve T cells were upregulated in encephalitogenic CNS-isolated CD4+ T cells, proposing a contribution to T cell plasticity. Correlation of the murine T-cell gene expression dataset to putative MS risk genes, which were selected based on their proximity (± 500 kb; ensembl database, release 75) to the MS risk single nucleotide polymorphisms (SNPs) proposed by the most recent multiple sclerosis GWAS in 2011, revealed that 67.3% of the MS risk genes were differentially expressed in EAE. Expression patterns of Bach2, Il2ra, Irf8, Mertk, Odf3b, Plek, Rgs1, Slc30a7, and Thada were confirmed in independent experiments, suggesting a contribution to T cell pathogenicity. Functional analysis of Nfatc1 revealed that Nfatc1-deficient CD4+ T cells were restrained in their ability to induce clinical signs of EAE. Nfatc1-deficiency allowed proper T cell activation, but diminished their potential to fully differentiate into Th17 cells and to express high amounts of lineage cytokines. As the inducible Nfatc1/αA transcript is distinct from the other family members, it could represent an interesting target for therapeutic intervention in MS.rn