Die Rolle von Chemokinrezeptor CXCR4 und Connective Tissue Growth Factor innerhalb der Tumor-Stroma-Interaktion in der akuten myeloischen Leukämie

Die akute myeloische Leukämie (AML) ist eine heterogene Erkrankung der hämatopoetischen Vorläuferzelle, die durch unkontrollierte Vermehrung und ein reduziertes Differenzierungsverhalten gekennzeichnet ist. Aufgrund von Therapieresistenzen und häufig vorkommenden Rückfällen ist die AML mit einer schlechten Langzeitprognose verbunden. Neue Studienergebnisse zeigen, dass leukämische Zellen einer hierarchischen Ordnung unterliegen, an deren Spitze die leukämische Stammzelle (LSC) steht, welche den Tumor speist und ähnliche Charakteristika besitzt wie die hämatopoetische Stammzelle. Die LSC nutzt den Kontakt zu Zellen der hämatopoetischen Nische des Knochenmarks, um die erste Therapie zu überdauern und Resistenzen zu erwerben. Neue Therapieansätze versuchen diese Interaktion zwischen leukämischen Zellen und supportiv wirkenden Stromazellen anzugreifen. rnrnIn dieser Arbeit sollte die Bedeutung des CXC-Motiv Chemokinrezeptors Typ 4 (CXCR4) und des Connective Tissue Growth Factors (CTGF) innerhalb der AML-Stroma-Interaktion untersucht werden. CXCR4, der in vivo dafür sorgt, dass AML-Zellen in der Nische gehalten und geschützt werden, wurde durch den neuwertigen humanen CXCR4-spezifischen Antikörper BMS-936564/MDX-1338 in AML-Zelllinien und Patientenzellen in Zellkulturversuchen blockiert. Dies induzierte Apoptose sowie Differenzierung und führte in Kokulturversuchen zu einer Aufhebung des Stroma-vermittelten Schutzes gegenüber der Chemotherapie. Für diese Effekte musste teilweise ein sekundärer Antikörper verwendet werden, der die CXCR4-Moleküle miteinander kreuzvernetzt.rnDie Auswertung eines quantitativen Real time PCR (qPCR)-Arrays ergab, dass CTGF in der AML-Zelllinie Molm-14 nach Kontakt zu Stromazellen hochreguliert wird. Diese Hochregulation konnte in insgesamt drei AML-Zelllinien sowie in drei Patientenproben in qPCR- und Western Blot-Versuchen bestätigt werden. Weitere Untersuchungen zeigten, dass diese Hochregulation (i) unabhängig von der Stromazelllinie ist, (ii) den direkten Kontakt zum Stroma benötigt und (iii) auch unter hypoxischen Bedingungen, wie sie innerhalb des Knochenmarks vorherrschen, stattfindet. Der durch Zell-Zell- oder Zell-Matrix-Kontakt gesteuerte Hippo-Signalweg konnte aus folgenden Gründen als möglicher upstream-Regulationsmechanismus identifiziert werden: (i) Dessen zentraler Transkriptions-Kofaktor TAZ wurde in kokultivierten Molm-14-Zellen stabilisiert, (ii) der shRNA-gesteuerte Knockdown von TAZ führte zu einer reduzierten CTGF-Hochregulation, (iii) CTGF wurde in Abhängigkeit von der Zelldichte reguliert, (iv) Cysteine-rich angiogenic inducer 61 (Cyr61), ein weiteres Zielgen von TAZ, wurde in kokultivierten AML-Zellen ebenfalls verstärkt exprimiert. Der Knockdown von CTGF führte in vitro zu einer partiellen Aufhebung der Stroma-vermittelten Resistenz und die Blockierung von CTGF durch den Antikörper FG-3019 wirkte im AML-Mausmodell lebensverlängernd. rn rnDie Rolle von CTGF in der AML ist bisher nicht untersucht. Die vorliegenden Ergebnisse zeigen, dass CTGF ein interessantes Therapieziel in der AML darstellt. Es bedarf weiterer Untersuchungen, um die Bedeutung von CTGF in der Tumor-Stroma-Interaktion näher zu charakterisieren und nachgeschaltete Signalwege zu identifizieren.

Acute myeloid leukemia is a heterogeneous disease of the hematopoietic progenitor cell characterized by uncontrolled proliferation and a differentiation block. Resistance to therapy and relapses are common events and cause a poor long-term prognosis. New studies show that the leukemic tumor is built up in a hierarchical way with a leukemic stem cell (LSC) at the top. This LSC has characteristics reminiscent of the hematopoietic stem cell and interacts with cells of the hematopoietic niche in the bone marrow in a similar manner. Thus, the LSC can survive the first therapy and acquire resistance mechanisms. New therapy approaches try to target this interaction between leukemic cells and protective stromal cells.rnrnThe objective of this thesis was to investigate the impact of CXC-motif chemokine receptor type 4 (CXCR4) and connective tissue growth factor (CTGF) in the AML-stroma interaction. CXCR4 causes retention and protection of AML cells in the niche. The new human CXCR4-specific antibody BMS-936564/MDX-1338 was used to inhibit CXCR4 in AML cell lines and primary AML samples. This induced apoptosis and differentiation and could abrogate the stroma-mediated resistance in coculture experiments. To achieve these effects the additional use of a secondary, cross-linking antibody was necessary in some AML models. rnThe evaluation of a quantitative real time PCR (qPCR) array demonstrated the upregulation of CTGF in the AML cell line Molm-14 after contact to stromal cells. This upregulation was confirmed in a total of 3 AML cell lines as well as 3 primary samples in qPCR and western blot experiments. Further investigations showed that this upregulation is (i) independent of the tested stromal cell lines, (ii) needs the direct contact to the stromal cells and (iii) also takes place under hypoxic conditions, as they prevail in the bone marrow. The hippo pathway, which is induced by cell-cell or cell-matrix contact, could be identified as a possible upstream regulatory mechanism for the following reasons: (i) its central co-transcription factor TAZ is stabilized in cocultured Molm-14 cells, (ii) shRNA mediated knockdown of TAZ suppressed CTGF upregulation, (iii) CTGF upregulation was related to cell density, (iv) cysteine-rich angiogenic inducer 61 (Cyr61), another target gene of the hippo pathway, was also higher expressed in cocultured AML cell lines. Knockdown of CTGF induced a partial reversal of the stroma-mediated rescue in AML cell lines in vitro and application of the anti-CTGF antibody FG-3019 could prolong survival in an AML mouse model. rnrnSo far, the impact of CTGF in AML has not been investigated. The findings presented in this thesis show that CTGF seems to be an interesting target for novel therapeutic strategies. Further studies are needed to characterize the function of CTGF in the tumor-stroma interaction more precisely.