Charakterisierung der Latenz des murinen Cytomegalovirus in vivo

Die primäre, produktive Cytomegalovirus (CMV)-Infektion wird im immunkompetenten Patienten effizient durch antivirale CD8+ T-Zellen kontrolliert. Das virale Genom besitzt jedoch die Fähigkeit, in einem nicht replikativen, Latenz genannten Zustand, in gewissen Zelltypen zu persistieren, ohne dass infektiöse Nachkommenviren produziert werden. Die molekularen Mechanismen, welche der Etablierung und Aufrechterhaltung der Latenz zugrundeliegen, sind noch weitestgehend unbekannt. Es gibt Hinweise darauf, dass zelluläre Verteidigungsmechanismen die Zirkularisierung und Chromatinisierung viraler Genome hervorrufen und dadurch die virale Genexpression größtenteils verhindert wird (Marks & Spector, 1984; Reeves et al., 2006).rnAllerdings liegen die Genome nicht in einem komplett inaktiven Zustand vor. Vielmehr konnte für das murine CMV (mCMV) bereits die sporadische Transkription der Gene ie1 und ie2 während der Latenz nachgewiesen werden (Kurz et al., 1999; Grzimek et al., 2001).rnIn der vorliegenden Arbeit wurde zum ersten Mal eine umfassende in vivo Latenz-Analyse zur Charakterisierung der viralen Transkription in einer Kinetik anhand der alle drei kinetischen Klassen repräsentierenden Transkripte IE1, IE3, E1, m164, M105 und M86 vorgenommen.rnNach Latenz-Etablierung, verifiziert durch Abwesenheit von infektiösem Virus, konnten alle getesteten Transkripte in der Lunge quantifiziert werden. Interessanterweise war die transkriptionelle Aktivität zu keinem Analyse-Zeitpunkt mit der klassischen IE-E-L-Kinetik der produktiven Infektion kompatibel. Stattdessen lag eine stochastische Transkript-Expression vor, deren Aktivität mit voranschreitender Zeit immer weiter abnahm.rnWährend der Latenz exprimierte Transkripte, die für antigene Peptide kodieren, können infizierte Zellen für das Immunsystem sichtbar machen, was zu einer fortwährenden Restimulation des memory T-Zell-pools führen würde. Durch zeitgleiche Analyse der Transkript-Expression, sowie der Frequenzen Epitop-spezifischer CD8+ T-Zellen während der Latenz (IE1, m164, M105), wurde eine möglicher Zusammenhang zwischen der transkriptionellen Aktivität und der Expansion des memory T-Zell-pools untersucht. Die weitere Charakterisierung von Subpopulationen der Epitop-spezifischen CD8+ T-Zellen identifizierte die SLECs (short-lived-effector cells; CD127low CD62Llow KLRG1high) als die dominante Population in Lunge und Milz während der mCMV-Latenz.rnIn einem weiteren Teil der Arbeit sollte untersucht werden, ob IE-Genexpression zur Etablierung von Latenz notwendig ist. Mit Hilfe der Rekombinanten mCMV-Δie2-DTR, die die Gensequenz des Diphtherietoxin-Rezeptors (DTR) anstelle des Gens ie2 trägt, konnten infizierte, DTR exprimierende Zellen durch eine DT-Applikation konditional depletiert werden.rnIm latent infizierbaren Zelltyp der Leber, den LSECs (liver sinusoidal endothelial cells) wurde die virale Load durch 90-stündige DT–Applikation nach mCMV-Δie2-DTR Infektion auf das Level latent infizierter LSECs reduziert. Diese Daten sprechen für die Hypothese eines von Beginn an inaktiven Genoms, das keine IE-Genexpression zur Latenz-Etablierung benötigt. Zusätzlich stellt dieser Ansatz ein neues Tier-Modell zur Latenz-Etablierung dar. Verringerte Wartezeiten bis zur vollständigen Latenz-Etablierung, im Vergleich zum bisherigen Knochenmarktransplantations-Modell, könnten anfallende Tierhaltungskosten erheblich reduzieren und das Voranschreiten der Forschung beschleunigen.

Primary, productive cytomegalovirus (CMV) infection is efficiently controlled by antiviral CD8+ T-cells in the immunocompetent host. The viral genome, however, persists in certain cell types in a silenced state, known as latency, without the production of infectious viral progeny.rnThe molecular events involved in the establishment and maintenance of latency are a mainly unsolved issue in CMV biology. It appears however, that molecular latency results from the cell´s intrinsic antiviral defense resulting in rapid circularization and chromatinization of incoming linear viral genomes as well as silencing of viral gene expression (Marks & Spector, 1984; Reeves et al., 2006).rnHowever, the viral genomes are not silenced at all their genetic loci all at once. Limited transcriptional activity, leading to transcripts expressed in latency´ (TEL), was already verified for the gene-loci of ie1 and ie2 (Kurz et al., 1999; Grzimek et al., 2001).rnIn this context a broad analysis of mCMV latency in vivo was conducted in the work presented here. This was achieved by RT-qPCR quantification of a selected set of transcripts including representatives of the three kinetic classes IE (IE1, IE3), E (E1, m164, M105) and L (M86-MCP) in a time course during latency.rnNotably, after the establishment of latency defined by absence of infectious virus, at any time analyzed TEL expression was incompatible with the directional IE-E-L path of productive cycle gene expression. Latency was found to be characterized by a progressing viral gene silencing over time that follows stochastic patterns.rnTranscripts coding for antigenic peptides might render latently infected cells visible for the immune system, leading to a sustained restimulation and thereby to an expansion, also known as memory inflation, of the memory T-cell-pool. Simultaneous analysis of mCMV gene expression and frequencies of epitope-specific CD8+ T-cells during latency made it possible to link molecular latency to memory inflation. A further characterization of epitope-specific CD8+ T-cell-subpopulations identified SLECs (short-lived-effector cells; CD127low CD62Llow KLRG1high) as the dominating cell population present in lung and spleen during mCMV-latency.rnAn additional part of the work presented here, dealt with the question if establishment of latency is preceded by IE gene expression. Mutant virus mCMV-Δie2-DTR expressing the diphtheria toxin receptor (DTR) gene in place of gene ie2, allowed conditional depletion of infected cells that express DTR on their surface via DT application.rnIt was possible to reduce the latent viral load in mCMV-Δie2-DTR infected liver sinusoidal endothelial cells (LSECs) by a 90h-treatment with DT to the level of latently infected LSECs. These data argue for the hypothesis of gene silencing from the very beginning without any need for IE-gene expression. Furthermore, this approach provides a new animal model to analyze latency, which allows shorter waiting time until latency is established and thereby permits the reduction of animal-housing costs.