Prevalência, Virulência e sensibilidade às terapias antimicrobianas das cepas de enterecoccus faecalis e enterococcus faecium isoladas de infecções endodônticas

Pós-graduação em Biopatologia Bucal - ICT

Mitochondrial and peroxisomal population in post-pharyngeal glands of leaf-cutting ants after lipid supplementation

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)

Lactobacillus acidophilus ATCC 4356 inhibits biofilm formation by C. albicans and attenuates the experimental candidiasis in Galleria mellonella

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)

Sign of the kiss in dermatitis caused by vesicant beetles (potós or Paederus sp.)

The cosmopolitan beetles of the Paederus genus (potos) cause a severe dermatitis when the insect is crushed against the skin of exposed areas (the cervical region is the most affected). Toxins (pederin and others) from the hemolymph of the insect cause plaques and/or bizarre, linear lesions with erythema, edema, blisters, pustules, crusts and exulcerations. There may be a burning sensation and severe conjunctivitis. Lesions disappear after 10 days and may leave hyperchromic macules. Treatment is made with topical corticosteroids and intensive washing.

Location, morphology and function of nephrocytes in termites

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq)

Competitive interactions between C. albicans, C. glabrata and C. krusei during biofilm formation and development of experimental Candidiasis

In this study, we evaluated the interactions between Candida albicans, Candida krusei and Candida glabrata in mixed infections. Initially, these interactions were studied in biofilms formed in vitro. CFU/mL values of C. albicans were lower in mixed biofilms when compared to the single biofilms, verifying 77% and 89% of C. albicans reduction when this species was associated with C. glabrata and C. krusei, respectively. After that, we expanded this study for in vivo host models of experimental candidiasis. G. mellonella larvae were inoculated with monotypic and heterotypic Candida suspensions for analysis of survival rate and quantification of fungal cells in the haemolymph. In the groups with single infections, 100% of the larvae died within 18 h after infection with C. albicans. However, interaction groups achieved 100% mortality after 72 h of infection by C. albicans-C. glabrata and 96 h of infection by C. albicans-C. krusei. C. albicans CFU/mL values from larvae hemolymph were lower in the interacting groups compared with the monoespecies group after 12 h of infection. In addition, immunosuppressed mice were also inoculated with monotypic and heterotypic microbial suspensions to induce oral candidiasis. C. albicans CFU/mL values recovered from oral cavity of mice were higher in the group with single infection by C. albicans than the groups with mixed infections by C. albicans-C. glabrata and C. albicans-C. krusei. Moreover, the group with single infection by C. albicans had a higher degree of hyphae and epithelial changes in the tongue dorsum than the groups with mixed infections. We concluded that single infections by C. albicans were more harmful for animal models than mixed infections with non-albicans species, suggesting that C. albicans establish competitive interactions with C. krusei and C. glabrata during biofilm formation and development of experimental candidiasis.

Effect of salinity on the metabolism and osmoregulation of selected ontogenetic stages of an Amazon population of Macrobrachium amazonicum shrimp (Decapoda, Palaemonidae)

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)

Metodologia da criação de Galleria mellonella para uso como modelo de infecção e efeitos de Lactobacillus rhamnosus inativado pelo calor in vivo e in vitro, desafiados por Staphylococcus aureus e Escherichia coli

Pós-graduação em Biopatologia Bucal - ICT

Ultrastructural changes in the ovary cells of engorged Rhipicephalus sanguineus female ticks treated with esters of ricinoleic acid from castor oil (Ricinus communis)

Rhipicephalus sanguineus is a widely distributed tick species that has adapted to the urban environment, and the dog is its main host. This species is also known as a vector and reservoir of diseases caused by bacteria, protozoa, and viruses. Currently, acaricides of synthetic chemical origin have been widely and indiscriminately used, leading to the development of resistance to these products by ticks and causing damage to the environment. Thus, these issues have made it necessary to seek other forms of controlling these ectoparasites. R. sanguineus was artificially infested in host New Zealand White rabbits, which were divided into four treatment groups: control (CG1 and CG2) and treatment (TG1 and TG2) groups. TG1 and TG2 hosts were provided with feed supplemented with esters of ricinoleic acid from castor oil at a concentration of 5 g/kg of feed for 7 and 15 days. Afterward, the ovaries of the female ticks were removed for analysis by transmission electron microscopy. The results showed ultrastructural changes in the somatic and germ cells of ovaries from TG1 and TG2 females, particularly with respect to chorion deposition, a protective membrane of the oocyte, as well as in the transport process of vitellogenic materials via the hemolymph and pedicel cells. Moreover, the mitochondria were less electron-dense and had cristae that were more disorganized than the mitochondria from CG1 and CG2 individuals. Thus, this study demonstrated the action of esters on the ovaries of R. sanguineus, signaling the prospect of a way to control this ectoparasite without affecting nontarget organisms or the environment. Microsc. Res. Tech., 2012. (c) 2011 Wiley Periodicals, Inc.

Potential costs of bacterial infection on storage protein gene expression and reproduction in queenless Apis mellifera worker bees on distinct dietary regimes

Insects are able to combat infection by initiating an efficient immune response that involves synthesizing antimicrobial peptides and a range of other defense molecules. These responses may be costly to the organism, resulting in it exploiting endogenous resources to maintain homeostasis or support defense to the detriment of other physiological needs. We used queenless worker bees on distinct dietary regimes that may alter hemolymph protein storage and ovary activation to investigate the physiological costs of infection with Serratia marcescens. The expression of the genes encoding the storage proteins vitellogenin and hexamerin 70a, the vitellogenin receptor, and vasa (which has a putative role in reproduction), was impaired in the infected bees. This impairment was mainly evident in the bees fed beebread, which caused significantly higher expression of these genes than did royal jelly or syrup, and this was confirmed at the vitellogenin and hexamerin 70a protein levels. Beebread was also the only diet that promoted ovary activation in the queenless bees, but this activation was significantly impaired by the infection. The expression of the genes encoding the storage proteins apolipophorins-I and -III and the lipophorin receptor was not altered by infection regardless the diet provided to the bees. Similarly, the storage of apolipophorin-I in the hemolymph was only slightly impaired by the infection, independently of the supplied diet. Taken together these results indicate that, infection demands a physiological cost from the transcription of specific protein storage-related genes and from the reproductive capacity. (C) 2012 Elsevier Ltd. All rights reserved.

EROD activity and genotoxicity in the seabob shrimp Xiphopenaeus kroyeri exposed to benzo[a]pyrene (BaP) concentrations

Seabob shrimp Xiphopenaeus kroyeri is a marine species that lives in shallow waters of coastal environments, often impacted by polycyclic aromatic hydrocarbons (PAH) pollution. In the present study, seabob shrimp were exposed for 96 h to benzo[a]pyrene (BaP) at the nominal concentrations of 100, 200, 400 and 800 microg.L-1. Animals of the control groups were exposed either to clean water or to the BaP-carrier (DMSO). At the end of the exposures, muscle tissues were sampled for BaP uptake assessment and hepatopancreas and hemolymph for EROD enzyme activity and hemocytes DNA damage, respectively. EROD activity and DNA damage increased significantly as a function of BaP exposure concentrations. Significant correlations between BaP uptake and both EROD activity and DNA damage suggest that they can be used as suitable tools for integrated levels of study on the biomarkers of PAH exposure.

Distribution of Rickettsia rickettsii in ovary cells of Rhipicephalus sanguineus (Latreille1806) (Acari: Ixodidae)

Abstract Background Considering the fact that the dog tick, Rhipicephalus sanguineus, has a great potential to become the vector of Brazilian Spotted Fever (BSF) for humans, the present study aimed to describe the distribution of the bacterium Rickettsia rickettsii, the etiological agent of BSF, in different regions of the ovaries of R. sanguineus using histological techniques. The ovaries were obtained from positive females confirmed by the hemolymph test and fed in the nymph stage on guinea pigs inoculated with R. rickettsii. Results The results showed a general distribution of R. rickettsii in the ovary cells, being found in oocytes in all stages of development (I, II, III, IV and V) most commonly in the periphery of the oocyte and also in the cytoplasm of pedicel cells. Conclusions The histological analysis of the ovaries of R. sanguineus infected females confirmed the presence of the bacterium, indicating that the infection can interfere negatively in the process of reproduction of the ticks, once alterations were detected both in the shape and cell structure of the oocytes which contained bacteria.

Charakterisierung und Stabilität von Arthropoden-Hämocyanin

Hämocyanine sind große, multimere Sauerstofftransport- proteine, die frei gelöst in der Hämolymphe von Arthropoden und Mollusken vorkommen.Zur Charakterisierung verschiedener Arthropoden-hämocyanine wurden deren molare Massen bestimmt. Die mit einer Vielwinkel-Laser-Lichtstreuapparatur ermittelten Molekulargewichte zeigten eine grosse Schwankungsbreite. Dies konnte auf Ungenauigkeiten der zur Berechnung der Molekulargewichte verwendeten spezifischen Extinktions- koeffizienten und Brechungsindex-Inkremente zurückgeführt werden.Mit der Methode der Massenspektrometrie (MALDI-TOF) bestimmte Molekulargewichte einzelner Untereinheiten des Hämocyanins der Vogelspinne Eurypelma californicum zeigten eine sehr gute Übereinstimmung mit aus der Sequenz errechneten Werten.Für das 24-mere Spinnenhämocyanin von Eurypelma californicum wurde die Stabilität gegenüber GdnHCl und der Temperatur auf den verschiedenen strukturellen Ebenen des Proteins untersucht.Viele Stabilitätsuntersuchungen werden an kleinen Proteinen durchgeführt, deren Entfaltung kooperativerfolgt. Bei größeren Proteinen mit unterschiedlichen strukturellen Bereichen (Domänen) ist der Entfaltungs-prozess weitaus komplexer. Ziel war es, durch die Denaturierung des Spinnen-Hämocyanins Erkenntnisse über die Stabilität und Entfaltung der verschiedenen strukturellen Ebenen eines so großen Proteinkomplexes zu gewinnen.Ein wichtiges Charakteristikum für die Interpretation der Entfaltungsexperimente ist die starke Löschung der Tryptophanfluoreszenz im oxygenierten Spinnen-Hämocyanin. Die Löschung kann vollständig durch Förster-Transfer erklärt werden kann. Sie bleibt auf die einzelnen Untereinheiten beschränkt und stellt somit ein reines O₂-Beladungssignal dar.Unter Einwirkung von GdnHCl dissoziiert das native, 24-mere Spinnen-Hämocyanin ohne die Entstehung langlebiger Inter- mediate. Die Untereinheiten werden durch das Oligomer stabilisiert. Die Entfaltung eines Monomers, der Unter- einheit e, folgt einer Hierarchie der verschiedenen strukturellen Ebenen des Moleküls. Die Entfaltung beginnt zunächst von außen mit der Auflockerung der Tertiärstruktur. Der Kern von Domäne II mit dem aktiven Zentrum weist hingegen eine besondere Stabilität auf.Die ausgeprägte Hitzestabilität des Eurypelma-Hämocyanins hängt vom Oligomerisierungsgrad, dem verwendeten Puffer und dessen Ausgangs-pH-Wert ab und spiegelt offensichtlich die extremen Lebensbedingungen im Habitat wider.

Strukturelle, enzymkinetische und thermodynamische Untersuchungen am KLH, dem Hämocyanin der Schlüssellochschnecke Megathura crenulata

Hämocyanine sind große, kupferhaltige Sauerstoff-Transportproteine, die bei zahlreichen Schnecken extrazellulär in der Hämolymphe vorkommen. Das Keyhole Limpet-Hämocyanin (KLH) der Schlüssellochschnecke Megathura crenulata dient aufgrund seiner immunstimu-latorischen Eigenschaften seit vielen Jahren als Modellprotein in der Immunologie. In der Klinik wird es als Hapten- und Vakzincarrier sowie als Medikament gegen oberflächliche Harnblasenkarnzinome eingesetzt. Die Quartärstruktur des KLH besteht aus einem Hohl-zylinder mit einer Molekülmasse von 8 MDa und einem Durchmesser von 35 nm. Dieses sogenannte Didekamer setzt sich aus 20 Untereinheiten mit jeweils 400 kDa zusammen. Jede Untereinheit lässt sich weiter in acht funktionelle Einheiten a bis h (engl. Functional Units = FU) mit ~ 50 kDa unterteilen. Die FUs a bis f bilden die Wandregion des Moleküls, während der Kragen aus den FUs g und h geformt wird. Die Struktur der Wandregion sowie der FU-g konnte bisher bereits durch Röntgenstrukturanalysen aufgeklärt werden. Bezüglich der Struktur der FU-h, die sich durch eine spezielle C-terminale Verlängerung von ~ 100 Amino-säuren auszeichnet, sind allerdings noch keine Informationen verfügbar. Um die Architektur des Kragens zu verstehen, wurden im Rahmen dieser Arbeit zunächst Strategien entwickelt, diese spezielle FU in großer Menge und Reinheit zu isolieren. Anschließend konnten Bedingungen gefunden werden, die zur Ausbildung 0,2 mm großer, hexagonaler Kristalle führten. Diese ergaben am Synchrotron eine Auflösung von 4 Å. Durch Auswertung der Röntgenstrukturdaten konnte für die C-terminale Zusatzdomäne der FU-h eine Cupredoxin-ähnliche Typ I-Kupferfaltung ermittelt werden. Der Nachweis eines zusätzlichen Kupfer-atoms innerhalb dieser Domäne bedarf allerdings einer höheren Auflösung der Kristall-struktur. Hämocyanine lassen sich aufgrund ihrer evolutionären Verwandtschaft zu Phenol-oxidasen mit Hilfe verschiedener in vitro-Aktivatoren zur Catecholoxidase und teilweise auch zur Tyrosinase aktivieren. Beim KLH konnte in dieser Arbeit eine eindeutige Diphenolase- und sogar eine schwache Monophenolase-Aktivität der FUs-a und -f nach SDS-Aktivierung nachgewiesen werden. Zudem konnte eine geringfügige intrinsische Diphenolase-Aktivität dieser FUs belegt werden. Die enzymatischen Reaktionen waren sowohl von der gewählten Puffersubstanz, als auch der Anwesenheit bivalenter Kationen abhängig. Tris wirkt vermutlich als allosterischer Effektor und steigerte den Substrat-Umsatz, während Mg2+-Ionen zu einer starken Inhibition der katalytischen Aktivität führten. Die Klärung einer möglichen physiologischen Funktion der Phenoloxidase-Aktivität des KLH sowie potenziellen in vivo-Aktivatoren steht noch aus. Studien zur thermischen Stabilität des KLH resultierten in einer irreversiblen Denaturierung des Proteins. Die Schmelzpunkte deuteten auf eine hohe Tempe-raturstabilität des KLH, vor allem in Anwesenheit bivalenter Kationen. Eine Hämocyanin-typische Abhängigkeit der Hitzeresistenz vom Oligomerisierungsgrad ließ sich nicht feststellen, da sowohl bei der FU-h als auch den KLH-Didekameren eine vergleichbar hohe thermische Stabilität, bei einer nach wie vor vorhandenen Oxygenierung beobachtet wurde.

Untersuchungen zur Regulation der Trehalaseaktivität bei der Wanderheuschrecke Locusta migratoria

Flugfähige Insekten sind äußerst leistungsfähige Tiere. Ihre Flugmuskulatur ist das Gewebe mit der höchsten ATP-Umsatzrate im Tierreich. Der hohe Energieumsatz ist möglich durch einen vollständig aeroben Stoffwechsel der Flugmuskulatur, der durch die effiziente Sauerstoffversorgung über das Tracheensystem gewährleistet wird. Andererseits haben Insekten einen offenen Blutkreislauf, d.h. ihre Gewebe werden nicht über Kapillaren mit Substraten versorgt, sondern von der Hämolymphe umspült, die daher eine hohe Konzentration an energieliefernden Substraten haben muss. Als schnell verfügbares Substrat nutzen Wanderheuschrecken bei Beginn eines Fluges als Hauptsubstrat Trehalose, die in hoher Konzentration als Hämolymphzucker vorliegt (20 bis 40mal höhere Konzentration als Glucose). Trehalose ist, anders als Glucose, ein nicht-reduzierender Zucker und daher nicht toxisch. Allerdings muss das Disaccharid Trehalose zu Glucose hydrolysiert werden, bevor sie im Zellstoffwechsel verwertet werden kann. Diese Funktion erfüllt die Trehalase (EC 3.2.1.28), ein Enzym, das membrangebunden ist und nach Zellfraktionierung in der Mikrosomenfraktion erscheint. Es ist schon lange offensichtlich, dass die Aktivität der Trehalase regulierbar sein muss und zwar reversibel (eine Eigenschaft, die für Hydrolasen ungewöhnlich ist), der Mechanismus ist allerdings bislang nicht klar, da alle üblichen Typen von Aktivitätsregulation nicht verwirklicht zu sein scheinen. Die meisten Autoren vermuten, dass die Regulation über den Transport des Substrats erfolgt. Ein Trehalosetransporter konnte allerdings bisher in der Flugmuskulatur von Locusta nicht nachgewiesen werden. In dieser Arbeit stelle ich Experimente vor, die dafür sprechen, dass Trehalase als Ektoenzym aktiv ist (overte Form), während eine inaktive Form (latente Form) in Vesikeln im Cytoplasma vorliegt und per Exocytose reversibel in die Plasmamembran transloziert werden kann. Für die Testung dieser Arbeitshypothese nutzte ich Trehazolin, einen sehr spezifischen Inhibitor der Trehalase, der äußerst fest und dauerhaft im aktiven Zentrum des Enzyms bindet. Dazu war es nötig, die Flugmuskulatur zu fraktionieren, um die Effekte von Trehazolin auf die verschiedenen Formen der Trehalase (gebunden, löslich, overt, latent) zu analysieren. Mit der Arbeitshypothese vereinbar sind die folgenden Befunde: (1) In die Hämolymphe injiziertes Trehazolin hemmt bevorzugt die overte Trehalase und erst bei höheren Dosen und nach längerer Zeit die latente Form. (2) Trehazolin wirkt in hoher Dosis (50µg pro Tier) auch nach Verfütterung, allerdings stark abgeschwächt, da nach 24 Stunden ein signifikanter Effekt nur auf die overte, aber nicht auf die latente Form sichtbar war. (3) In einem Langzeitversuch über 30 Tage führte die einmalige Injektion von 20µg Trehazolin zu einer schnellen Hemmung der overten Trehalase, der eine verzögerte Hemmung der latenten Aktivität folgte. Der Zeitverlauf von Hemmung und Erholung spricht für eine Vorläufer-Produkt-Beziehung zwischen latenter und overter Form. (4) Flugaktivität der Tiere führt zu einer starken Verminderung der latenten Aktivität, falls Trehazolin in der Hämolymphe der Tiere vorhanden war. (5) Neuropeptide könnten die Translokation fördern. Insulin hat einen entsprechenden Effekt, der aber unabhängig ist von der Flugaktivität. (6) Der PI3-Kinasehemmstoff Wortmannin stabilisiert die latente Form der Trehalase. Auch andere Organe als die Flugmuskulatur besitzen Trehalase, aber mit deutlich geringerer Aktivität. In der Sprungmuskulatur könnte auch eine latente Form vorhanden sein, für Darm und Gehirn ist das nicht wahrscheinlich.