Untersuchungen zur Regulation der Trehalaseaktivität bei der Wanderheuschrecke Locusta migratoria

Flugfähige Insekten sind äußerst leistungsfähige Tiere. Ihre Flugmuskulatur ist das Gewebe mit der höchsten ATP-Umsatzrate im Tierreich. Der hohe Energieumsatz ist möglich durch einen vollständig aeroben Stoffwechsel der Flugmuskulatur, der durch die effiziente Sauerstoffversorgung über das Tracheensystem gewährleistet wird. Andererseits haben Insekten einen offenen Blutkreislauf, d.h. ihre Gewebe werden nicht über Kapillaren mit Substraten versorgt, sondern von der Hämolymphe umspült, die daher eine hohe Konzentration an energieliefernden Substraten haben muss. Als schnell verfügbares Substrat nutzen Wanderheuschrecken bei Beginn eines Fluges als Hauptsubstrat Trehalose, die in hoher Konzentration als Hämolymphzucker vorliegt (20 bis 40mal höhere Konzentration als Glucose). Trehalose ist, anders als Glucose, ein nicht-reduzierender Zucker und daher nicht toxisch. Allerdings muss das Disaccharid Trehalose zu Glucose hydrolysiert werden, bevor sie im Zellstoffwechsel verwertet werden kann. Diese Funktion erfüllt die Trehalase (EC 3.2.1.28), ein Enzym, das membrangebunden ist und nach Zellfraktionierung in der Mikrosomenfraktion erscheint. Es ist schon lange offensichtlich, dass die Aktivität der Trehalase regulierbar sein muss und zwar reversibel (eine Eigenschaft, die für Hydrolasen ungewöhnlich ist), der Mechanismus ist allerdings bislang nicht klar, da alle üblichen Typen von Aktivitätsregulation nicht verwirklicht zu sein scheinen. Die meisten Autoren vermuten, dass die Regulation über den Transport des Substrats erfolgt. Ein Trehalosetransporter konnte allerdings bisher in der Flugmuskulatur von Locusta nicht nachgewiesen werden. In dieser Arbeit stelle ich Experimente vor, die dafür sprechen, dass Trehalase als Ektoenzym aktiv ist (overte Form), während eine inaktive Form (latente Form) in Vesikeln im Cytoplasma vorliegt und per Exocytose reversibel in die Plasmamembran transloziert werden kann. Für die Testung dieser Arbeitshypothese nutzte ich Trehazolin, einen sehr spezifischen Inhibitor der Trehalase, der äußerst fest und dauerhaft im aktiven Zentrum des Enzyms bindet. Dazu war es nötig, die Flugmuskulatur zu fraktionieren, um die Effekte von Trehazolin auf die verschiedenen Formen der Trehalase (gebunden, löslich, overt, latent) zu analysieren. Mit der Arbeitshypothese vereinbar sind die folgenden Befunde: (1) In die Hämolymphe injiziertes Trehazolin hemmt bevorzugt die overte Trehalase und erst bei höheren Dosen und nach längerer Zeit die latente Form. (2) Trehazolin wirkt in hoher Dosis (50µg pro Tier) auch nach Verfütterung, allerdings stark abgeschwächt, da nach 24 Stunden ein signifikanter Effekt nur auf die overte, aber nicht auf die latente Form sichtbar war. (3) In einem Langzeitversuch über 30 Tage führte die einmalige Injektion von 20µg Trehazolin zu einer schnellen Hemmung der overten Trehalase, der eine verzögerte Hemmung der latenten Aktivität folgte. Der Zeitverlauf von Hemmung und Erholung spricht für eine Vorläufer-Produkt-Beziehung zwischen latenter und overter Form. (4) Flugaktivität der Tiere führt zu einer starken Verminderung der latenten Aktivität, falls Trehazolin in der Hämolymphe der Tiere vorhanden war. (5) Neuropeptide könnten die Translokation fördern. Insulin hat einen entsprechenden Effekt, der aber unabhängig ist von der Flugaktivität. (6) Der PI3-Kinasehemmstoff Wortmannin stabilisiert die latente Form der Trehalase. Auch andere Organe als die Flugmuskulatur besitzen Trehalase, aber mit deutlich geringerer Aktivität. In der Sprungmuskulatur könnte auch eine latente Form vorhanden sein, für Darm und Gehirn ist das nicht wahrscheinlich.

Insect flight muscle shows the highest rate of ATP turnover among animal tissues. The high ATP turnover is supported by a fully aerobic energy metabolism of flight muscle which is based on efficacious oxygen delivery via the tracheal system. On the other hand the circulatory system of insects is open, i.e. tissues are not capillarized but bathed in the haemolymph which requires higher concentrations of substrates. At the start of a flight Locusta oxidize mainly the disaccharide Trehalose which is present at high concentration in the hemolymph (20 to 40 times the content of glucose). Unlike glucose, trehalose is non-reducing and hence non-toxic, but it needs to be hydrolysed into glucose before it can be catabolized in cellular metabolism. This is the function of flight muscle trehalase (EC 3.2.1.28), a membrane- bound enzyme that is found in the microsomal fraction upon tissue fractionation. It has long been realized that trehalase activity must be reversibly regulated (a property that is not normally found in hydrolases), but the basis of this regulation has remained obscure as none of the known mechanisms of activity control seems to operate in flight muscle trehalase. A majority of authors speculate that trehalase activity is indirectly controlled via control of trehalose transport though a transporter for trehalose could not been identified in locust flight muscle. Here I present experiments suggesting that trehalase could operate as an ectoenzyme (active = overt form) whereas the inactive form (= latent form) might be confined to vesicles that could be reversibly translocated to the plasma membrane. In order to test this hypothesis I have used the potent and tight binding competitive Trehalase inhibitor trehazolin. Flight muscle tissue was fractionated to analyse the effects of trehazolin on the various forms of trehalase (soluble, membrane-bound, overt and latent). The following observations are compatible with the working hypothesis. (1) Trehazolin injected into the haemolymph of locusts inhibits in a time- and dose-dependent manner initially the overt and the latent form. (2) Feeding high doses of trehazolin has less effect than injecting as it inhibited only the overt but not the latent trehalose. (3) In a long-term experiment (30 days) injecting a sublethal dose of trehazolin (20µg) caused rapid inhibition of the latent trehalose and delayed inhibition of the latent form. The time course of inhibition and recovery suggests a precursor-product relation between latent and overt trehalase in flight muscle. (4) Flight caused rapid inhibition of latent trehalase in flight muscles in locusts injected with trehazolin. Injecting bovine insulin had a similar effect (independent of flight activity) Trehalase is present also in organs other than flight muscle although with significantly lower activity. A latent form might be present in hind leg muscle.