Capacidade de adesão, invasão e produção de enterotoxinas de Staphylococcus aureus isolados de leite de vacas com mastite subclínica e leite humano de um banco de leite

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)

Molecular detection of enteropathogenic Escherichia coli in asymptomatic captive psittacines

Psittaciformes are one of the most endangered groups of birds, and several Brazilian species are classified between vulnerable and critically endangered. It is thus necessary to identify agents that cause infections in captive wild animals and to assess the risks posed thereof and to design interventions to minimize the possibility of disease outbreaks, leading to the conservation of endangered species. The purpose of this study was to identify enteropathogenic Escherichia coli (EPEC) cloacal isolates from asymptomatic psittacines in captivity and evaluate the distribution of the EPEC pathotype. Cloacal swabs were obtained from 46 asymptomatic birds, and resulting isolates were tested by polymerase chain reaction (PCR) for the presence of the attaching and effacing gene (eae) and bundle-forming pilus structural gene (bfpA) of EPEC. Samples from several species were tested, and three samples were found to be positive for the eae and bfpA genes and characterized as typical EPEC. This is the first report of this pathotype in asymptomatic psittacines. Although certain E. coli strains are more pathogenic than others, various factors should be considered when determining the potential of E. coli isolates to cause disease in captive psittacines. Birds that are positive for the EPEC (typical) strain could be zoonotic sources of infection, and may have acquired these strains through contact with humans or domestic animals. These findings may also be valuable for the long-term management of endangered species ex situ as one EPEC sample was isolated from a Red-tailed Amazon (Amazona brasiliensis).

Isolamento de vibrios potencialmente patogênicos em moluscos bivalves

Neste estudo, 26 amostras de ostras (Crassostrea gigas) comercializadas na cidade de São Paulo e em alguns pontos do litoral de São Paulo, e 36 amostras de mexilhões (Perna perna) colhidas mensalmente em 3 pontos do litoral de Ubatuba - SP, foram submetidas à pesquisa de vibrios potencialmente patogênicos. As amostras desses moluscos eram submetidas a enriquecimento em água peptonada alcalina sem cloreto de sódio e com 1 por cento de cloreto de sódio, e GSTB. O isolamento foi realizado em ágar TCBS. Colônias sacarose positivas e negativas, sugestivas de espécies de Vibrio foram identificadas presuntivamente em meio de ágar ferro de Kligler, sendo confirmadas através de provas bioqufmicas complementares. Uma parte das amostras de vibrios potencialmente patogênicos isoladas foi submetida ao teste de Dean e teste de alça ligada em íleo de coelhos. Os vibrios potencialmente patogênicos encontrados em amostras de ostras foram V. alginolyticus (81 por cento ), V.parahaemolyticus (77 por cento ), V. cholerae não 0:1 (31 por cento ), V. fluvialis (27 por cento ), V. furnissii (19 por cento ), V. mimicus (12 por cento ) e V. vulnificus (12 por cento ) e em amostras de mexilhões foram V. alginolyticus(97 por cento ), V. parahaemolyticus(75 por cento ), V. fluvialis (47 por cento ), V. vulnificus (11 por cento ), V. cholerae não 0:1 (6 por cento ), V. furnissii (6 por cento ) e V. mimicus (6 por cento ). Observou-se acúmulo de fluido em alça ligada de íleo de coelho entre 0,25 e 0,49 ml/cm em 6,9 por cento das amostras, entre 0,5 e 0,99 ml/cm em 15,6 por cento e maior ou igual a 1 ml/cm em 15,1 por cento , e/ou intestino de camundongos lactentes (Teste de Dean) em 26,6 por cento das amostras testadas, confirmando o elevado potencial desses microrganismos em causar gastrenterite. Verificou-se ausência de variação sazonal e também, de correlação entre os vibrios potencialmente patogênicos isolados e os indicadores de contaminação fecal, confirmando que a presença desses microrganismos ocorre de forma autóctone e que, as condições climáticas foram favoráveis à sobrevivência dessas espécies em todas as épocas do ano. Considerando-se os resultados obtidos no presente estudo e o fato de que ostras e mexilhões são habitualmente ingeridos crus ou insuficientemente cozidos, pode-se concluir que sua ingestão constitui-se em um determinado grau de risco para a saúde do consumidor.

Vacina contra a cárie dentária: perspetivas e preocupações: uma opção possível?

Dissertação para obtenção do grau de Mestre no Instituto Superior de Ciências da Saúde Egas Moniz

Capacidade de adesão e formação de biofilme de Candida ssp. isoladas da cavidade oral de pacientes transplantados renais na presença do extrato de Eugenia uniflora

Candidiasis is a major oral manifestation in kidney transplant patients. Candida spp. possess essential virulence factors which contribute for the infectious process, including the ability to adhere to epithelial cells and biofilm formation. The extract obtained from the leaves of Eugenia uniflora [acetone: water (7:3, v/v)] has demonstrated antifungal activity against Candida spp. This study evaluated the influence of the extract of E. uniflora in adhesion to human buccal epithelial cells (HBEC) and biofilm formation of 42 strains of Candida spp. isolated from the oral cavity of kidney transplant patients. Candida spp. strains belonging to a culture collection were reactivated and phenotypically re-identified by classical and molecular methods (genotyping ABC and RAPD), when necessary, to complete the identification to the species level. For the virulence tests evaluated in vitro, yeasts were grown in the presence and absence of 1000 g/mL of the extract. A ratio of 10: 1 (Candida spp. cells x HBECs) was incubated for 1 hour at 37 ° C, 200 rpm, fixed with 10% formalin and the number of Candida cells adhered to 150 HBEC determined by optical microscope. Biofilms were formed on polystyrene microplates in the presence or absence of the extract. The quantification was performed with crystal violet staining at 570 nm. All isolates were viable and exhibited phenotypic characteristics suggestive of each species identified. Two strains presumptively identified as Candida dubliniensis belonged to this species as determined with genotyping ABC, while strains identified as belonging to the Candida parapsilosis species complex were differentiated by RAPD genotyping. Candida albicans was found to be the most adherent species to the buccal epithelia, while C. tropicalis showed remarkable biofilm formation.We could detect that the extract of E. uniflora was able to reduce adhesion to HBEC for both Candida albicans and non-Candida albicans Candida species. On the other hand, only 16 Candida spp. strains (36 %) showed reduced biofilm formation. However, two highly biofilm producer strains of C. tropicalis had an expressive reduction in biofilm formation. This study reinforces the idea that besides growth inhibition, E. uniflora may interfere with the expression of some virulence factors of Candida spp., and may be possibly applied in the future as a novel antifungal agent.

Manipulação gênica do protozoário Neospora caninum como ferramenta para o estudo das interações parasito-hospedeiro

Neospora caninum is an obligate intracellular parasite classified in the phylum Apicomplexa, characterized by the presence of the apical complex composed by micronemes proteins, rhoptries and dense granules, used by parasite during the adhesion and invasion process of the host cell. This is the mean event in infection pathogenesis generated by N. caninum and other parasites from the phylum Apicomplexa, promoting influence in the parasite biology and the interface between the parasite and its host. Therefore, molecular tools have been developed in order to identify and characterize these possible virulence factors. Thus, the present study sought to establish a specific system of genetic manipulation of N. caninum, searching for the improvement of the genetics manipulation of this parasite. So, we developed genetically depleted N. caninum to Rop9 rhoptry using the pU6-Universal CRISPR-Cas9 plasmid of T. gondii modified by the insertion of Ku80. The Rop9 depleted parasite showed important during initial phase of invasion and replication of the parasite, however it was not characterized as a potential virulence fator for N. caninum. Furthermore, T. gondii proteins were expressed in N. caninum by the use of specific vectors for this parasite, showing an heterologous system for the study of Toxoplasma proteins, due to the fact that Gra15 or Gra24 of type II T. gondii and Rop16 of type I T. gondii were expressed in N. caninum tachyzoites in a stable way and keept its biological phenotype, as already presented the former parasite, that naturaly expresses these proteins. In addition, it was observed that N. caninum induced an inflammasome activation through NLRP3, ASC and Caspase-1. IL-1R/MyD88 demonstrated an indirect pathway in the control of parasite replication. Furthermore, it was observed that this activation is dependent of the potassium efflux and that different strains of N. caninum keep this activation profile. However, T. gondii strains block this activation, making necessary a prior signal in order to active the inflamosome pathway. Type I T. gondii Rop16 was identified as responsible for blocking this activation, in a dependent way to the STAT3 activation. Therefore, the development of molecular tools and their application in N. caninum may prove to be useful to identify and characterize virulent factors involved in the pathogenesis by these two protozoans.

O papel da Porphyromonas gingivalis nas doenças da cavidade oral e sua relação com doenças sistémicas

Dissertação para obtenção do grau de Mestre no Instituto Superior de Ciências da Saúde Egas Moniz

Escherichia coli : host interactions in the pathogenesis of canine pyometra

Tese de Doutoramento em Ciências Veterinárias na Especialidade de Ciências Biológicas e Biomédicas

Características genotípicas de Staphylococcus coagulase-negativos e taxas de cura da mastite ovina.

A mastite em ovelhas de dupla aptidão é reconhecida por afetar a qualidade do leite. Staphylococcus coagulase-negativos (SCN) são os principais micro-organismos responsáveis pela doença, e o tratamento ao final da lactação, pode contribuir para a cura e prevenção de casos subclínicos na lactação consecutiva. Entretanto, fatores de virulência e mecanismos de resistência apresentados por SCN podem reduzir as taxas de cura. Os objetivos deste trabalho foram identificar no leite de ovelhas tratadas e não tratadas à secagem com antimicrobianos, as espécies de SCN antes e após o tratamento e identificar nesses micro-organismos a presença dos genes mecA, icaA, icaC, icaD, bap, bhp, sea, seb, sec, sed e tsst-1, determinar o perfil clonal das principais espécies identificadas e relacionar os casos de cura após o tratamento com a presença/ausência dos respectivos genes. Sessenta ovelhas foram divididas em três grupos experimentais: G1, controle, metades mamárias que não receberam antimicrobiano; G2, metades mamárias em que foram administrados 10 mL de cloxacilina-benzatina 100 mg via intramamária / estrutura convencional; G3, metades mamárias em que foram administrados 86 mL de cloxacilina-benzatina 50 mg via intramamária / estrutura nanoencapsulada. As amostras de leite foram coletadas à secagem e aos 15 e 30 dias pós-parto da lactação seguinte. As análises para identificação das espécies de SCN foram realizadas por meio de testes bioquímicos e Internal Transcribe Spacer (ITS-PCR), e a pesquisa dos genes responsáveis pelos fatores de virulência e pela resistência à oxacilina foram realizados por meio da técnica de reação em cadeia de polimerase (PCR). Dentre as espécies identificadas S. warneri prevaleceram nos três grupos experimentais. Nenhuma amostra foi positiva para o gene mecA. O único gene relacionado com a produção de enterotoxinas encontrado foi o sec. Dentre os genes relacionados com a produção de biofilme, icaD foi o único identificado nos três grupos experimentais. Staphylococcus warneri, S. simulans e S. epidermidis apresentaram clones na mesma metade mamária no pré e pós-parto das ovelhas. A cloxacilina benzatina nanoparticulada 50mg / 86 mL foi eficiente para reduzir a mastite subclínica no pós-parto de ovelhas (P= 0,0192). Staphylococcus warneri, S. simulans, S. epidermidis e S. xylosus foram as espécies de maior ocorrência. Os genes icaA, icaC, icaD e bap foram encontrados no momento da desmama e no pós-parto, os genes sec e icaD estão associados à ausência de cura da mastite subclínica no pós-parto. Ovelhas em que foram isolados SCN portadores de genes responsáveis pela formação de biofilme não apresentaram resultados satisfatórios quando submetidas a esquemas de controle e ao tratamento da mastite subclínica. Os genes sec e icaD, estão associadas à ausência de cura microbiológica da mastite subclínica no pós-parto. Staphylococcus epidermidis e S. xylosus portador do gene bap estão associados à reinfecção.

Avaliação da atividade antimicrobiana in vitro do extrato bruto de cipó de alho Mansoa alliacea em isolados bacterianos de peixes.

O estado do Amapá está localizado no norte do Brasil, possuindo rica biodiversidade, onde diferentes aspectos apresentam tênue conhecimento ou ainda são desconhecidos. Entre estes se destaca o conhecimento quanto a etiologia das infecções no homem, tendo como veículo o peixe, que representa relevante aspecto de saúde pública, especialmente quando consumido cru ou após tratamento térmico inadequado. Microrganismos podem permanecer viáveis nos peixes estocados a baixas temperaturas, condição física que os permite sobreviver, multiplicar e produzir fatores de virulência, capazes ainda de ocasionar infecções oportunistas. Assim, Staphylococcus aureus, Salmonella spp., Escherichia coli e Aeromonas spp. podem ser usados como marcadores de sanidade em alimentos. Existe ainda a preocupação quanto ao uso de fitoterápicos destinados ao tratamento de doenças em peixes, devido à probabilidade da existência de toxicidade ao animal. Dessa forma, são necessárias pesquisas que possam contribuir com o desenvolvimento de produtos naturais com atividade antibacteriana. A região amazônica é a maior fonte da biodiversidade vegetal do planeta, o que a tornar um grande potencial para os estudos sobre fitoterápicos de interesse na aquicultura, além do vasto conhecimento das populações tradicionais sobre o uso de plantas medicinais. Cipó-de-alho Mansoa alliacea (Bignoniaceae) é um arbusto com característica de trepadeira de origem amazônica, que atinge até 3 metros de altura. Seu caule e suas folhas possuem cheiro mais forte que o alho, podendo ser substituído no tempero dos alimentos e também como planta medicinal. A presente investigação tem como objetivo isolar microrganismos presentes em peixes oriundos de pisciculturas e feiras livres localizadas de Macapá-AP e avaliar através da atividade antimicrobiana in vitro do extrato bruto de M. alliacea em isolados bacterianos, através da determinação da sua Concentração Inibitória Mínima (CIM) e Concentração Bactericida Mínima (CBM). Os microrganismos foram isolados a partir de 10 amostras de peixes dentre as quais cinco adquiridas em pisciculturas e cinco em feiras livres de Macapá. As análises foram realizadas no Laboratório Especial de Microbiologia Aplicada (LEMA) e Laboratório Central de Saúde Pública do Amapá (LACEN-AP). Todas as amostras adquiridas nas feiras livres de Macapá apresentaram S. aureus, Salmonella spp. e E.coli em números superiores àqueles de tolerância segundo a legislação, enquanto as cinco amostras de peixes provenientes de pisciculturas encontravam-se dentro dos padrões microbiológicos sanitários. Não foi observada presença de Aeromonas spp. nas amostras avaliadas. Após os ensaios de CIM e CBM das amostras bacterianas ao extrato de M. alliacea, foi realizada a quantificação, isolamento e identificação dos microrganismos, observando-se atividade bacteriostática em S. aureus, Salmonella spp. e E. coli e atividade bactericida para E. coli. Foi possível observar que a utilização de extrato bruto hidro alcoólico nos ensaios de CIM e CBM demonstrou atividade antimicrobiana frente aos isolados. Novos estudos sobre a atividade antimicrobiana deverão ser conduzidos sobre a utilização de frações de compostos químicos de M. alliacea além da avaliação do extrato de M. alliacea para minimizar a contaminação microbiana e/ou conservação de peixes, para fins alimentícios.

Caracterização fenotípica de bactérias patogênicas isoladas de peixes e água de piscicultura de Macapá, Estado do Amapá.

O município de Macapá encontra-se no sudeste do Estado do Amapá e possui em sua maioria, as pisciculturas utilizando o sistema de cultivo semi-intensivo ou intensivo com áreas de 0,5 a 3,0 hectares de lâmina de água. A maioria das pisciculturas cultiva principalmente tambaqui (Colossoma macropomum) e híbrido tambatinga (C. macropomum x Piaractus brachypomum), enquanto poucos cultivam pirarucu (Arapaima gigas) e híbrido tambacu (C. macropomum x Piaractus mesopotamicus). Porém, 21% da produção é destinada a subsistência e 32% para fins comerciais, mas 45% é destinada a ambas as finalidades. A comercialização é feita diretamente aos consumidores ou aos feirantes locais. Um dos veículos importantes que contribuem para as infecções no homem causadas por microrganismos patogênicos podem ser os peixes, especialmente quando são consumidos crus ou após tratamento térmico inadequado. Esses microrganismos estão presentes também em peixe estocados em baixas temperaturas, condição física que permite a esses sobreviver, multiplicar e produzir fatores de virulência, sendo ainda capazes de causar doenças oportunistas. Microrganismos patogênicos tais como Staphylococcus aureus, Salmonella spp., Escherichia coli e Aeromonas spp., bem como outros, podem acarretar infecções gastrointestinais, quando não são observadas boas práticas de manipulação e conservação desse alimento, causando risco de agravos na Saúde Pública. Este trabalho teve como objetivo isolar, caracterizar e verificar fenotipicamente a frequência de indicadores bacterianos para a qualidade da água e peixes oriundos de pisciculturas de Macapá, estado do Amapá, visando fornecer informações de interesse da Saúde Pública. Em 15 pisciculturas foram analisados um total de 45 tambaquis e tambatinga para qualidade microbiológica, e 45 amostras de água para qualidade microbiológica, física e química. As análises foram realizadas no laboratório de Microbiologia de Alimentos e Água do Laboratório Central de Saúde Pública do Amapá (LACEN-AP), e no Laboratório Especial de Microbiologia Aplicada (LEMA) da UNIFAP. Os resultados revelaram que os peixes e água das 15 pisciculturas avaliadas encontram-se dentro dos padrões legais vigentes quando analisadas a qualidade microbiológicas, físico e química da água dos tanques, assim como os peixes cultivados apresentaram resultados dentro dos limites satisfatórios quanto à adequada segurança alimentar. Portanto, há garantia do equilíbrio em quantidade e em qualidade desses peixes consumidos para o alcance de uma nutrição adequada, diminuindo desta maneira os riscos de doenças transmitidas por água e alimentos promovendo assim, a minimização dos riscos à Saúde Pública.

Determinação da virulência e da resistência antimicrobiana em Staphylococcus spp. isolados de pacientes do Serviço de Dermatologia do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Botucatu, SP

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)

Genes associados à virulência e multirresistência de antimicrobianos em linhagens Trueperella Pyogenes isoladas de mastite e outras afecções em animais domésticos

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)

Genes associados à virulência e multirresistência de antimicrobianos em linhagens Trueperella Pyogenes isoladas de mastite e outras afecções em animais domésticos

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)

Aplicação do escore MELD em pacientes submetidos a transplante de fígado: análise retrospectiva da sobrevida e dos fatores preditivos a curto e longo prazo

BACKGROUND: The model for end-stage liver disease (MELD) was developed to predict short-term mortality in patients with cirrhosis. There are few reports studying the correlation between MELD and long-term posttransplantation survival. AIM: To assess the value of pretransplant MELD in the prediction of posttransplant survival. METHODS: The adult patients (age >18 years) who underwent liver transplantation were examined in a retrospective longitudinal cohort of patients, through the prospective data base. We excluded acute liver failure, retransplantation and reduced or split-livers. The liver donors were evaluated according to: age, sex, weight, creatinine, bilirubin, sodium, aspartate aminotransferase, personal antecedents, brain death cause, steatosis, expanded criteria donor number and index donor risk. The recipients' data were: sex, age, weight, chronic hepatic disease, Child-Turcotte-Pugh points, pretransplant and initial MELD score, pretransplant creatinine clearance, sodium, cold and warm ischemia times, hospital length of stay, blood requirements, and alanine aminotransferase (ALT >1,000 UI/L = liver dysfunction). The Kaplan-Meier method with the log-rank test was used for the univariable analyses of posttransplant patient survival. For the multivariable analyses the Cox proportional hazard regression method with the stepwise procedure was used with stratifying sodium and MELD as variables. ROC curve was used to define area under the curve for MELD and Child-Turcotte-Pugh. RESULTS: A total of 232 patients with 10 years follow up were available. The MELD cutoff was 20 and Child-Turcotte-Pugh cutoff was 11.5. For MELD score > 20, the risk factors for death were: red cell requirements, liver dysfunction and donor's sodium. For the patients with hyponatremia the risk factors were: negative delta-MELD score, red cell requirements, liver dysfunction and donor's sodium. The regression univariated analyses came up with the following risk factors for death: score MELD > 25, blood requirements, recipient creatinine clearance pretransplant and age donor >50. After stepwise analyses, only red cell requirement was predictive. Patients with MELD score < 25 had a 68.86%, 50,44% and 41,50% chance for 1, 5 and 10-year survival and > 25 were 39.13%, 29.81% and 22.36% respectively. Patients without hyponatremia were 65.16%, 50.28% and 41,98% and with hyponatremia 44.44%, 34.28% and 28.57% respectively. Patients with IDR > 1.7 showed 53.7%, 27.71% and 13.85% and index donor risk <1.7 was 63.62%, 51.4% and 44.08%, respectively. Age donor > 50 years showed 38.4%, 26.21% and 13.1% and age donor <50 years showed 65.58%, 26.21% and 13.1%. Association with delta-MELD score did not show any significant difference. Expanded criteria donors were associated with primary non-function and severe liver dysfunction. Predictive factors for death were blood requirements, hyponatremia, liver dysfunction and donor's sodium. CONCLUSION: In conclusion MELD over 25, recipient's hyponatremia, blood requirements, donor's sodium were associated with poor survival.