Manipulação gênica do protozoário Neospora caninum como ferramenta para o estudo das interações parasito-hospedeiro

Neospora caninum is an obligate intracellular parasite classified in the phylum Apicomplexa, characterized by the presence of the apical complex composed by micronemes proteins, rhoptries and dense granules, used by parasite during the adhesion and invasion process of the host cell. This is the mean event in infection pathogenesis generated by N. caninum and other parasites from the phylum Apicomplexa, promoting influence in the parasite biology and the interface between the parasite and its host. Therefore, molecular tools have been developed in order to identify and characterize these possible virulence factors. Thus, the present study sought to establish a specific system of genetic manipulation of N. caninum, searching for the improvement of the genetics manipulation of this parasite. So, we developed genetically depleted N. caninum to Rop9 rhoptry using the pU6-Universal CRISPR-Cas9 plasmid of T. gondii modified by the insertion of Ku80. The Rop9 depleted parasite showed important during initial phase of invasion and replication of the parasite, however it was not characterized as a potential virulence fator for N. caninum. Furthermore, T. gondii proteins were expressed in N. caninum by the use of specific vectors for this parasite, showing an heterologous system for the study of Toxoplasma proteins, due to the fact that Gra15 or Gra24 of type II T. gondii and Rop16 of type I T. gondii were expressed in N. caninum tachyzoites in a stable way and keept its biological phenotype, as already presented the former parasite, that naturaly expresses these proteins. In addition, it was observed that N. caninum induced an inflammasome activation through NLRP3, ASC and Caspase-1. IL-1R/MyD88 demonstrated an indirect pathway in the control of parasite replication. Furthermore, it was observed that this activation is dependent of the potassium efflux and that different strains of N. caninum keep this activation profile. However, T. gondii strains block this activation, making necessary a prior signal in order to active the inflamosome pathway. Type I T. gondii Rop16 was identified as responsible for blocking this activation, in a dependent way to the STAT3 activation. Therefore, the development of molecular tools and their application in N. caninum may prove to be useful to identify and characterize virulent factors involved in the pathogenesis by these two protozoans.

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior

Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de Minas Gerais

Tese (Doutorado)

Neospora caninum é um parasito intracelular obrigatório pertencente ao filo Apicomplexa, caracterizado pela presença do complexo apical composto por proteínas de micronemas, roptrias e grânulos densos, utilizadas pelo parasito durante o processo de adesão e invasão da célula hospedeira, caracterizando o principal evento na patogênese da infecção por N. caninum e por outros parasitos do filo Apicomplexa, influenciando assim na biologia do parasito e na interação parasito-hospedeiro. Dessa forma, ferramentas moleculares tem sido desenvolvidas na tentativa de se identificar e caracterizar esses possíveis fatores de virulência. Portanto, o presente trabalho buscou desenvolver ferramentas moleculares especificas para N. caninum de modo a melhorar a eficiência na manipulação genética deste parasito, sendo assim desenvolvemos N. caninum depletado geneticamente para a roptria Rop9 por meio da utilização do plasmídeo CRISPR-Cas9 pU6-Universal de T. gondii modificado pela inserção de Ku80. O parasito depletado para Rop9 mostrou-se importante durante a fase inicial da invasão e replicação do parasito, entretanto não foi caracterizado como um potencial fator de virulência para N. caninum. Complementarmente, proteínas de T. gondii foram expressas em N. caninum utilizando vetores específicos para este parasito, apresentando um sistema heterólogo para estudo de proteínas presentes em Toxoplasma. Pois, Gra15 ou Gra24 de T. gondii tipo II, e Rop16 de T. gondii tipo I foram expressos em taquizoítos de N. caninum de forma estável e mantiveram o seu fenótipo biológico como já apresentado pelo parasito de origem, que expressa naturalmente estas proteínas. Adicionalmente, foi observado que N. caninum induziu a ativação do inflamassoma através da via NLRP3, ASC e Caspase-1. Sendo a via IL-1R/ MyD88 uma via indireta importante no controle da replicação do parasito. Além disso, foi demonstrado que essa ativação é dependente de efluxo de potássio, e que diferentes cepas de N. caninum mantêm esse perfil de ativação. No entanto, cepas de T. gondii bloqueiam essa ativação sendo necessário um primeiro sinal para acionar a via do inflamassoma. Foi identificado Rop16 de T. gondii da cepa tipo I como responsável por bloquear essa ativação, de modo dependente a ativação de STAT3. Portanto, as ferramentas moleculares desenvolvidas e aplicadas em N. caninum revelaram-se úteis para identificar e caracterizar fatores de virulência envolvidos na patogênese por estes dois protozoários.