Creatine deficiency syndomes : a new model of partial GAMT deficiency affecting brain cell development

Les syndromes de déficiences cérébrales en créatine (CCDS) sont dus à des mutations dans les gènes GATM et G AMT (codant pour les enzymes AGAT et G AMT de la voie de synthèse de créatine) ainsi que SLC6A8 (transporteur de créatine), et génèrent une absence ou une très forte baisse de créatine (Cr) dans le cerveau, mesurée par spectroscopic de résonance magnétique. Les patients CCDS développent des handicaps neurologiques sévères. Les patients AGAT et GAMT peuvent être traités avec des doses importantes de Cr, mais gardent dans la plupart des cas des séquelles neurologiques irréversibles. Aucun traitement efficace n'existe à ce jour pour la déficience en SLC6A8. Bien que de nombreux modèles aient été développés pour comprendre la Cr cérébrale en conditions physiologiques, les pathomécanismes des CCDS ne sont pas encore compris. Des souris transgéniques pour les gènes Gatm, Gamt et Slc6a8 ont été générées, mais elles ne miment que partiellement la pathologie humaine. Parmi les CCDS, la déficience en GAMT est la plus sévère, en raison de l'accumulation cérébrale de l'intermédiaire guanidinoacétate (GAA). Alors que la toxicité cérébrale du GAA a été étudiée par exposition directe au GAA d'animaux adultes sains, les mécanismes de la toxicité du GAA en condition de déficience en GAMT dans le cerveau en développement sont encore inconnus. Le but de ce projet était donc de développer un modèle de déficience en GAMT dans des cultures 3D primaires de cellules nerveuses de rat en agrégats par knock-down du gène GAMT, en utilisant un virus adéno-associé (AAV) induisant le mécanisme d'interférence à l'ARN (RNAi). Le virus scAAV2, à la multiplicité d'infection de 1000, s'est révélé le plus efficace pour transduire tous les types de cellules nerveuses des cultures (neurones, astrocytes, oligodendrocytes), et générer un knock-down maximal de la protéine GAMT de 85% (jour in vitro 18). Cette déficience partielle en GAMT s'est révélée insuffisante pour générer une déficience en Cr, mais a causé l'accumulation attendue de GAA, à des doses comparables aux niveaux observés dans le LCR des patients GAMT. Le GAA a induit une croissance axonale anarchique accompagnée d'une baisse de l'apoptose naturelle, suivis par une induction tardive de mort cellulaire non-apoptotique. Le co-traitement par la Cr a prévenu tous les effets toxiques du GAA. Ce travail montre que l'accumulation de GAA en absence de déficience en Cr est suffisante pour affecter le développement du tissu nerveux, et suggère que des formes de déficiences en GAMT supplémentaires, ne présentant pas de déficiences en Cr, pourraient être découvertes par mesure du GAA, en particulier à travers les programmes récemment proposés de dépistage néonatal de la déficience en GAMT. -- Cerebral creatine deficiency syndromes (CCDS) are caused by mutations in the genes GATM and GAMT (respectively coding for the two enzymes of the creatine synthetic pathway, AGAT and GAMT) as well as SLC6A8 (creatine transporter), and lead to the absence or very strong decrease of creatine (Cr) in the brain when measured by magnetic resonance spectroscopy. Affected patients show severe neurological impairments. While AGAT and GAMT deficient patients can be treated with high dosages of Cr, most remain with irreversible brain sequelae. No treatment has been successful so far for SLC6A8 deficiency. While many models have helped understanding the cerebral Cr pathways in physiological conditions, the pathomechanisms underlying CCDS are yet to be elucidated. Transgenic mice carrying mutations in the Gatm, Gamt and Slc6a8 genes have been developed, but only partially mimic the human pathology. Among CCDS, GAMT deficiency is the most severe, due to the CNS accumulation of the guanidinoacetate (GAA) intermediate. While brain toxicity of GAA has been explored through direct GAA exposure of adult healthy animals, the mechanisms underlying GAA toxicity in GAMT deficiency conditions on the developing CNS are yet unknown. The aim of this project was thus to develop and characterize a GAMT deficiency model in developing brain cells by gene knockdown, by adeno-associated virus (AAV)-driven RNA interference (RNAi) in rat 3D organotypic primary brain cell cultures in aggregates. scAAV2 with a multiplicity of infection of 1000 was shown as the most efficient serotype, was able to transduce all brain cell types (neurons, astrocytes, oligodendrocytes) and to induce a maximal GAMT protein knockdown of 85% (day in vitro 18). Metabolite analysis showed that partial GAMT knockdown was insufficient to induce Cr deficiency but generated the awaited GAA accumulation at concentrations comparable to the levels observed in cerebrospinal fluid of GAMT-deficient patients. Accumulated GAA induced axonal hypersprouting paralleled with inhibition of natural apoptosis, followed by a later induction in non-apoptotic cell death. Cr supplementation led to the prevention of all GAA-induced toxic effects. This work shows that GAA accumulation without Cr deficiency is sufficient to affect CNS development, and suggests that additional partial GAMT deficiencies, which may not show the classical brain Cr deficiency, may be discovered through GAA measurement including by recently proposed neonatal screening programs for GAMT deficiency.

Rôles des kinases IKK et IKK-related dans les maladies inflammatoires chroniques : implications dans l’athérosclérose et la réponse hypoxique

L’inflammation est un procédé complexe qui vise l’élimination de l’agent causal de dommages tissulaires en vue de faciliter la réparation du tissu affecté. La persistance de l’agent causal ou l’incapacité à résoudre l’inflammation mène à un dérèglement homéostatique chronique qui peut avoir une incidence sur la morbidité et la mortalité. L’athérosclérose est une condition inflammatoire chronique des vaisseaux sanguins dont l’origine est multifactorielle. L’hypertension et l’état infectieux représentent respectivement des facteurs de risque classiques et émergents du développement de cette maladie. Les fondements initiaux de l’inflammation font intervenir l’immunité innée, la première ligne de défense dont disposent les cellules pour répondre à un signal de danger. Le but de cette thèse est d’examiner le rôle pro-inflammatoire d’une famille de kinases essentielles à l’immunité innée, soit celle des kinases de IkappaB (IKK) et des kinases IKK-related. Les kinases IKKalpha et IKKbeta forment le complexe IKK avec la molécule adaptatrice NEMO/IKKgamma. Ce complexe est chargé d’effectuer la phosphorylation de l’inhibiteur de NF-kappaB, IkappaBalpha, ce qui mène à sa dégradation et à la libération du facteur de transcription NF-kappaB. Nous montrons que le peptide vasoactif angiotensine II (AngII) induit l’activité phosphotransférase d’IKKbeta dans les VSMC par immunoprécipitation de NEMO puis essai kinase in vitro. Grâce à une approche ARN interférence (ARNi) dirigée contre IKK, nous montrons que cette kinase est responsable de la phosphorylation de p65/RelA. Nous montrons que le mécanisme d’induction de NF-kappaB par l’AngII est atypique, puisqu’il ne module pas IkappaBalpha, et montrons à l’aide d’inhibiteurs pharmacologiques que l’activation de p65 est indépendante des voies MEK-ERK-RSK, PI3K et de la transactivation du récepteur de l’EGF. Les kinases IKK-related Tank-binding kinase 1 (TBK1) et IKK-i sont quant à elles principalement activées suite à une infection bactérienne ou virale. Ces kinases phosphorylent directement le facteur de transcription interferon regulatory factor (IRF)-3. Nous montrons que le cytomégalovirus humain, un pathogène associé à l’athérosclérose, a la capacité d’induire l’activation de TBK1 dans les VSMC. L’usage d’ARNi dirigé contre TBK1 et IKKi montre que les 2 kinases sont impliquées dans l’activation d’IRF-3. De plus, nous montrons à l’aide d’une lignée de VSMC exprimant une version dominante négative d’IRF-3 que ce dernier est essentiel à la synthèse des chimiokines RANTES et IP-10, tel qu’analysé par RT-PCR. Par ailleurs, il a récemment été montré que les kinases IKK-related étaient étroitement liées à la transformation oncogénique, et que TBK1 était pro-angiogénique. Or, l’angiogenèse est le plus souvent modulée par la réponse hypoxique qui est d’ailleurs commune à la majorité des processus inflammatoires. Le facteur de transcription hypoxia inducible factor (HIF)-1 module l’angiogenèse, l’inflammation et la survie cellulaire. Nous montrons à l’aide de cellules Tbk1 et Ikbke -/- et d’une approche lentivirale que TBK1 est spécifiquement impliquée dans l’induction traductionnelle de HIF-1alpha en condition de stress hypoxique. L’expression de TBK1 est induite sous ces conditions, et cette kinase module la phosphorylation de ERK, RSK, Akt et TSC1. Les résultats originaux présentés dans cette thèse montrent donc que les kinases IKK et IKK-related exercent leurs actions pro-inflammatoires par des mécanismes distincts.

Étude dans la cellule bêta pancréatique de voies inhibitrices de la sécrétion d'insuline liées au métabolisme des lipides

Le diabète de type 2 (DT2) est une maladie métabolique complexe causée par des facteurs génétiques mais aussi environnementaux, tels la sédentarité et le surpoids. La dysfonction de la cellule β pancréatique est maintenant reconnue comme l’élément déterminant dans le développement du DT2. Notre laboratoire s’intéresse à la sécrétion d’insuline par la cellule β en réponse aux nutriments calorigéniques et aux mécanismes qui la contrôle. Alors que la connaissance des mécanismes responsables de l’induction de la sécrétion d’insuline en réponse aux glucose et acides gras est assez avancée, les procédés d’inhibition de la sécrétion dans des contextes normaux ou pathologiques sont moins bien compris. L’objectif de la présente thèse était d’identifier quelques-uns de ces mécanismes de régulation négative de la sécrétion d’insuline dans la cellule β pancréatique, et ce en situation normale ou pathologique en lien avec le DT2. La première hypothèse testée était que l’enzyme mitochondriale hydroxyacyl-CoA déshydrogénase spécifique pour les molécules à chaîne courte (short-chain hydroxyacyl-CoA dehydrogenase, SCHAD) régule la sécrétion d’insuline induite par le glucose (SIIG) par la modulation des concentrations d’acides gras ou leur dérivés tels les acyl-CoA ou acyl-carnitine dans la cellule β. Pour ce faire, nous avons utilisé la technologie des ARN interférants (ARNi) afin de diminuer l’expression de SCHAD dans la lignée cellulaire β pancréatique INS832/13. Nous avons par la suite vérifié chez la souris DIO (diet-induced obesity) si une exposition prolongée à une diète riche en gras activerait certaines voies métaboliques et signalétiques assurant une régulation négative de la sécrétion d’insuline et contribuerait au développement du DT2. Pour ce faire, nous avons mesuré la SIIG, le métabolisme intracellulaire des lipides, la fonction mitochondriale et l’activation de certaines voies signalétiques dans les îlots de Langerhans isolés des souris normales (ND, normal diet) ou nourries à la dière riche en gras (DIO) Nos résultats suggèrent que l’enzyme SCHAD est importante dans l’atténuation de la sécrétion d’insuline induite par le glucose et les acides aminés. En effet, l’oxydation des acides gras par la protéine SCHAD préviendrait l’accumulation d’acyl-CoA ou de leurs dérivés carnitine à chaîne courtes potentialisatrices de la sécrétion d’insuline. De plus, SCHAD régule le métabolisme du glutamate par l’inhibition allostérique de l’enzyme glutamate déshydrogénase (GDH), prévenant ainsi une hyperinsulinémie causée par une sur-activité de GDH. L’étude de la dysfonction de la cellule β dans le modèle de souris DIO a démontré qu’il existe une grande hétérogénéité dans l’obésité et l’hyperglycémie développées suite à la diète riche en gras. L’orginialité de notre étude réside dans la stratification des souris DIO en deux groupes : les faibles et forts répondants à la diète (low diet responders (LDR) et high diet responder (HDR)) sur la base de leur gain de poids corporel. Nous avons mis en lumières divers mécanismes liés au métabolisme des acides gras impliqués dans la diminution de la SIIG. Une diminution du flux à travers le cycle TG/FFA accompagnée d’une augmentation de l’oxydation des acides gras et d’une accumulation intracellulaire de cholestérol contribuent à la diminution de la SIIG chez les souris DIO-HDR. De plus, l’altération de la signalisation par les voies AMPK (AMP-activated protein kinase) et PKC epsilon (protéine kinase C epsilon) pourrait expliquer certaines de ces modifications du métabolisme des îlots DIO et causer le défaut de sécrétion d’insuline. En résumé, nous avons mis en lumière des mécanismes importants pour la régulation négative de la sécrétion d’insuline dans la cellule β pancréatique saine ou en situation pathologique. Ces mécanismes pourraient permettre d’une part de limiter l’amplitude ou la durée de la sécrétion d’insuline suite à un repas chez la cellule saine, et d’autre part de préserver la fonction de la cellule β en retardant l’épuisement de celle-ci en situation pathologique. Certaines de ces voies peuvent expliquer l’altération de la sécrétion d’insuline dans le cadre du DT2 lié à l’obésité. À la lumière de nos recherches, le développement de thérapies ayant pour cible les mécanismes de régulation négative de la sécrétion d’insuline pourrait être bénéfique pour le traitement de patients diabétiques.

Découverte de nouvelles interactions entre le virus de l'Hépatite C et l'hôte par une approche combinée de Spectrométrie de Masse et de Génomique Fonctionnelle

La réplication et l’assemblage du virus de l’hépatite C (VHC) sont régulés finement dans le temps et l’espace par les interactions protéiques entre le virus avec l’hôte. La compréhension de la biologie du virus ainsi que sa pathogénicité passe par les connaissances relatives aux interactions virus/hôte. Afin d’identifier ces interactions, nous avons exploité une approche d’immunoprécipitation (IP) couplée à une détection par spectrométrie de masse (MS), pour ensuite évaluer le rôle des protéines identifiées dans le cycle viral par une technique de silençage génique. Les protéines virales Core, NS2, NS3/4A, NS4B, NS5A et NS5B ont été exprimées individuellement dans les cellules humaines 293T et immunoprécipitées afin d’isoler des complexes protéiques qui ont été soumis à l’analyse MS. Ainsi, 98 protéines de l’hôte ont été identifiées avec un enrichissement significatif et illustrant une spécificité d’interaction. L’enrichissement de protéines connues dans la littérature a démontré la force de l’approche, ainsi que la validation de 6 nouvelles interactions virus/hôte. Enfin, le rôle de ces interactants sur la réplication virale a été évalué dans un criblage génomique par ARN interférant (ARNi). Deux systèmes rapporteurs de la réplication virale ont été utilisés : le système de réplicon sous-génomique (Huh7-Con1-Fluc) et le système infectieux (J6/JFH-1/p7Rluc2a), ainsi qu’un essai de toxicité cellulaire (Alamar Blue). Parmi les protéines de l’hôte interagissant avec le VHC, 28 protéines ont démontré un effet significatif sans effet de toxicité cellulaire, suggérant fortement un rôle dans la réplication du VHC. Globalement, l’étude a mené à l’identification de nouvelles interactions virus/hôte et l’identification de nouvelles cibles thérapeutiques potentielles.

On the function of the Dictyostelium Argonaute A protein (AgnA) in epigenetic gene regulation

With molecular biology methods and bioinformatics, the Argonaute proteins in Dictyostelium discoideum were characterized, and the function of the AgnA protein in RNAi and DNA methylation was investigated, as well as cellular features. Also interaction partners of the PAZ-Piwi domain of AgnA (PAZ-PiwiAgnA) were discovered. The Dictyostelium genome encodes five Argonaute proteins, termed AgnA/B/C/D/E. The expression level of Argonaute proteins was AgnB/D/E > AgnA > AgnC. All these proteins contain the characteristic conserved of PAZ and Piwi domains. Fluorescence microscopy revealed that the overexpressed C-terminal GFP-fusion of PAZ-PiwiAgnA (PPWa-GFP) localized to the cytoplasm. Overexpression of PPWa-GFP leaded to an increased gene silencing efficiency mediated by RNAi but not by antisense RNA. This indicated that PAZ-PiwiAgnA is involved in the RNAi pathway, but not in the antisense pathway. An analysis of protein-protein interactions by a yeast-two-hybrid screen on a cDNA library from vegetatively grown Dictyostelium revealed that several proteins, such as EF2, EF1-I, IfdA, SahA, SamS, RANBP1, UAE1, CapA, and GpdA could interact with PAZ-PiwiAgnA. There was no interaction between PAZ-PiwiAgnA and HP1, HelF and DnmA detected by direct yeast-two-hybrid analysis. The fluorescence microscopy images showed that the overexpressed GFP-SahA or IfdA fusion proteins localized to both cytoplasm and nuclei, while the overexpressed GFP-SamS localized to the cytoplasm. The expression of SamS in AgnA knock down mutants was strongly down regulated on cDNA and mRNA level in, while the expression of SahA was only slightly down regulated. AgnA knock down mutants displayed defects in growth and phagocytosis, which suggested that AgnA affects also cell biological features. The inhibition of DNA methylation on DIRS-1 and Skipper retroelements, as well as the endogenous mvpB and telA gene, observed for the same strains, revealed that AgnA is involved in the DNA methylation pathway. Northern blot analysis showed that Skipper and DIRS-1 were rarely expressed in Ax2, but the expression of Skipper was upregulated in AgnA knock down mutants, while the expression of DIRS-1 was not changed. A knock out of the agnA gene failed even though the homologous recombination of the disruption construct occurred at the correct site, which indicated that there was a duplication of the agnA gene in the genome. The same phenomenon was also observed in ifdA knock out experiments.

Immune transcript variations among Aedes aegypti populations with distinct susceptibility to dengue virus serotype 2

The innate immune response of insects is one of the factors that may dictate their susceptibility to viral infection. Two immune signaling pathways, Toll and JAK-STAT, and the RNA interference (RNAi) pathway are involved in Aedes aegypti responses against dengue virus (DENV), however natural differences in these antiviral defenses among mosquito populations have not been studied. Here, two field Ae. aegypti populations from distinct ecological environments, one from Recife and the other from Petrolina (Brazil), and a laboratory strain were studied for their ability to replicate a primary isolate of dengue virus serotype 2 (DENV-2). Virus infectivity and replication were determined in insect tissues collected after viral exposure through reverse-transcription real time PCR (RT-PCR). The expression of a transcript representing these defense mechanisms (Toll, JAK-STAT and RNAi) in the midgut and fat body was studied with RTPCR to evaluate variations in innate immune mechanisms possibly employed against DENV. Analyses of infection rates indicated that the field populations were more susceptible to DENV-2 infection than the lab strain. There were distinct expression patterns among mosquito populations, in both control and infected insects. Moreover, lower expression of immune molecules in DENV-2-infected insects compared to controls was observed in the two field populations. These results suggest that natural variations in vector competence against DENV may be partly due to differences in mosquito defense mechanisms, and that the down-regulation of immune transcripts after viral infection depends on the insect strain. (C) 2012 Elsevier B.V. All rights reserved.

Analysis of energetically biased transcripts of viruses and transposable elements

RNA interference (RNAi) is a natural endogenous process by which double-stranded RNA molecules trigger potent and specific gene silencing in eukaryotic cells and is characterized by target RNA cleavage. In mammals, small interfering RNAs (siRNAs) are the trigger molecules of choice and constitute a new class of RNA-based antiviral agents. In an efficient RNAi response, the antisense strand of siRNAs must enter the RNA-induced silencing complex (RISC) in a process mediated by thermodynamic features. In this report, we hypothesize that silent mutations capable of inverting thermodynamic properties can promote resistance to siRNAs. Extensive computational analyses were used to assess whether continuous selective pressure that promotes such mutations could lead to the emergence of viral strains completely resistant to RNAi (i.e., prone to transfer only the sense strands to RISC). Based on our findings, we propose that, although synonymous mutations may produce functional resistance, this strategy cannot be systematically adopted by viruses since the longest RNAi-refractory sequence is only 10 nt long. This finding also suggests that all mRNAs display fluctuating thermodynamic landscapes and that, in terms of thermodynamic features, RNAi is a very efficient antiviral system since there will always be sites susceptible to siRNAs.

Germline-Specific MATH-BTB Substrate Adaptor MAB1 Regulates Spindle Length and Nuclei Identity in Maize

Germline and early embryo development constitute ideal model systems to study the establishment of polarity, cell identity, and asymmetric cell divisions (ACDs) in plants. We describe here the function of the MATH-BTB domain protein MAB1 that is exclusively expressed in the germ lineages and the zygote of maize (Zea mays). mab1 (RNA interference [RNAi]) mutant plants display chromosome segregation defects and short spindles during meiosis that cause insufficient separation and migration of nuclei. After the meiosis-to-mitosis transition, two attached nuclei of similar identity are formed in mab1 (RNAi) mutants leading to an arrest of further germline development. Transient expression studies of MAB1 in tobacco (Nicotiana tabacum) Bright Yellow-2 cells revealed a cell cycle-dependent nuclear localization pattern but no direct colocalization with the spindle apparatus. MAB1 is able to form homodimers and interacts with the E3 ubiquitin ligase component Cullin 3a (CUL3a) in the cytoplasm, likely as a substrate-specific adapter protein. The microtubule-severing subunit p60 of katanin was identified as a candidate substrate for MAB1, suggesting that MAB1 resembles the animal key ACD regulator Maternal Effect Lethal 26 (MEL-26). In summary, our findings provide further evidence for the importance of posttranslational regulation for asymmetric divisions and germline progression in plants and identified an unstable key protein that seems to be involved in regulating the stability of a spindle apparatus regulator(s).

Anti-parasitic and anti-viral immune responses in insects

Insects encounter many microorganisms in nature and to survive they have developed counter measures against the invading pathogens. In Drosophila melanogaster research on insect immunity has mainly been focused on infections by bacteria and fungi. We have explored the immune response against natural infections of the parasite Octosporea muscaedomesticae and the Drosophila C virus as compared to natural infections of bacteria and fungi. By using Affymetrix Drosophila GeneChips, we were able to obtain 48 genes uniquely induced after parasitic infection. It was also clearly shown that natural infections led to different results than when injecting the pathogens. In order to search for the ultimate role of the lepidopteran protein hemolin, we used RNA interference (RNAi). We could show that injection of double stranded RNA (dsRNA) of Hemolin in pupae of Hyalophora cecropia led to embryonic malformation and lethality and that there was a sex specific difference. We continued the RNAi investigation of hemolin in another lepidopteran species, Antheraea pernyi, and discovered that hemolin was induced by dsRNA per se. A similar induction of hemolin was seen after infection with baculovirus and we therefore performed in vivo experiments on baculovirus infected pupae. We could show that a low dose of dsHemolin prolonged the period before the A. pernyi pupae showed any symptoms of infection, while a high dose led to a more rapid onset of symptoms. By performing in silico analysis of the hemolin sequence from A. pernyi in comparison with other Hemolin sequences, it was possible to select a number of sites that either by being strongly conserved or variable could be important targets for future studies of hemolin function.

Knock down von Desmoglein 2 durch induzierbare Cre-spezifische Rekombination in der Maus

Desmosomen sind hoch organisierte adhäsive interzelluläre Verbindungen, die benachbarte Zellen durch Verankerung mit den Intermediärfilamenten des Zytoskeletts miteinander verknüpfen und so Zellen und Geweben Stabilität verleihen. Die Adhäsionsmoleküle der Desmosomen sind die desmosomalen Cadherine. Diese transmembranen Glykoproteine gehen im Interzellulärraum Verbindungen mit den desmosomalen Cadherinen der Nachbarzelle ein und sind im zytoplasmatischen Bereich Anheftungspunkte für weitere an der Desmosomenbildung beteiligte Proteine. Ziel dieser Arbeit war die Untersuchung der Rolle von Desmoglein 2 (Dsg 2), einem in allen Epithelien exprimierten desmosomalen Cadherin. Da der konstitutive knock out von Dsg 2 embryonal letal ist, wurde im Rahmen dieser Doktorarbeit eine transgene Maus generiert, in der die Reduktion von Dsg 2 temporär regulierbar war (konditionaler knock down). Dazu wurde der Mechanismus der RNA Interferenz genutzt, wodurch Sequenz-spezifische, post-transkriptionelle Regulation von Genen möglich ist. Unter Verwendung eines über Cre/lox-induzierbaren Vektors wurden transgene Mäuse generiert, welche nach Induktion Dsg 2 shRNA exprimieren, die in der Zelle in siRNA umgewandelt wird und zum Abbau der Dsg 2 mRNA führt. Durch Verpaarung der generierten Dsg 2 knock down Maus mit der über Tamoxifen induzierbaren Cre Deleter knock in Mauslinie Rosa26CreERT2 konnte deutliche Reduktion der Dsg 2 Proteinmenge in Leber, Darm und Herz erreicht werden. In Immunfärbungen der Leber wurde zudem eine reduzierte Desmosomenbildung durch Expression der Dsg 2 shRNA detektiert. Die für diese Versuche generierte und getestete Rosa26CreERT2 Mauslinie ermöglichte jedoch nicht in allen Zellen eines Gewebes die komplette Aktivierung der Cre Rekombinase und damit die Expression der shRNA. Dadurch entstanden mosaikartige Wildtyp/knock down-Gewebe, in denen noch ausreichend Desmosomen gebildet wurden, um die Gewebestabilität und -struktur zu erhalten. Für eine funktionale Untersuchung von Dsg 2 in Zusammenhang mit der chronisch entzündlichen Darmerkrankung Colitis ulcerosa wurden die Dsg 2 knock down Mäuse mit Darm-spezifischen, induzierbaren Cre Deleter Mäusen (VillinCreERT2) verpaart. Nach Aktivierung der Cre Rekombinase mittels Tamoxifen wurde in bitransgenen Tieren über Gabe von Azoxymethan (AOM) und Dextransodiumsulfat (DSS) Colitis ulcerosa induziert. Diese entzündliche Erkrankung des Darms ist mit der Induktion von Darmtumoren assoziiert. Bereits nach einmaliger Induktion mit AOM/DSS wurde in der ersten endoskopischen Untersuchung eine starke Entzündung des Darmgewebes und die Ausbildung von flächig wachsenden Tumoren in den Dsg 2 knock down Tieren hervorgerufen. Es ist anzunehmen, dass durch knock down von Dsg 2, und die damit verbundene verminderte Desmosomenbildung und Zelladhäsion, Infiltration von Bakterien durch die epitheliale Barriere des Darms möglich war, und so die Entzündungsreaktion in der Darmmukosa verstärkte. In Zusammenhang mit Verlust der epithelialen Festigkeit durch verringerte Zellkontakte kam es zur Hyperproliferation der Darmmukosa, die sich in Ausbildung von flächigen Tumoren äußerte. In weiteren Experimenten müssen nun die Tumore und das entzündete Gewebe der Colitis-induzierten Mäuse mittels Immunfluoreszenz untersucht werden, um Veränderungen in der Desmosomenformation in situ detektieren zu können. Des Weiteren sind Verpaarungen der Dsg 2 knock down Maus mit anderen Cre Rekombinase exprimierenden Mauslinien möglich, um den Einfluss von Dsg 2 auch in anderen Geweben, beispielsweise im Herzen, zu untersuchen. Die hier vorgelegte Arbeit zeigt also erstmalig den ursächlichen Zusammenhang zwischen Dsg 2 und dem Auftreten von Colitis-assoziierten Tumoren in einem konditionalen RNAi-vermittelten knock down Tiermodell. Die Etablierung dieser Maus ist somit das erste konditionale Mausmodell, welches die bei vielen Krebspatienten gefundenen flachzellig wachsenden Tumore in vivo rekapituliert. Vorausschauend kann man sagen, dass mit Hilfe des im Rahmen dieser Doktorarbeit entwickelten Tiermodells wichtige Erkenntnisses über die Pathologie von Darmtumoren erbracht werden können, die unser Verständnis der Colitis-induzierten Tumorentstehung verbessern.

AICAR and metformin, but not exercise, increase muscle glucose transport through AMPK-, ERK-, and PDK1-dependent activation of atypical PKC

Activators of 5'-AMP-activated protein kinase (AMPK) 5-aminoimidazole-4-carboxamide-1-beta-d-ribofuranoside (AICAR), metformin, and exercise activate atypical protein kinase C (aPKC) and ERK and stimulate glucose transport in muscle by uncertain mechanisms. Here, in cultured L6 myotubes: AICAR- and metformin-induced activation of AMPK was required for activation of aPKC and ERK; aPKC activation involved and required phosphoinositide-dependent kinase 1 (PDK1) phosphorylation of Thr410-PKC-zeta; aPKC Thr410 phosphorylation and activation also required MEK1-dependent ERK; and glucose transport effects of AICAR and metformin were inhibited by expression of dominant-negative AMPK, kinase-inactive PDK1, MEK1 inhibitors, kinase-inactive PKC-zeta, and RNA interference (RNAi)-mediated knockdown of PKC-zeta. In mice, muscle-specific aPKC (PKC-lambda) depletion by conditional gene targeting impaired AICAR-stimulated glucose disposal and stimulatory effects of both AICAR and metformin on 2-deoxyglucose/glucose uptake in muscle in vivo and AICAR stimulation of 2-[(3)H]deoxyglucose uptake in isolated extensor digitorum longus muscle; however, AMPK activation was unimpaired. In marked contrast to AICAR and metformin, treadmill exercise-induced stimulation of 2-deoxyglucose/glucose uptake was not inhibited in aPKC-knockout mice. Finally, in intact rodents, AICAR and metformin activated aPKC in muscle, but not in liver, despite activating AMPK in both tissues. The findings demonstrate that in muscle AICAR and metformin activate aPKC via sequential activation of AMPK, ERK, and PDK1 and the AMPK/ERK/PDK1/aPKC pathway is required for metformin- and AICAR-stimulated increases in glucose transport. On the other hand, although aPKC is activated by treadmill exercise, this activation is not required for exercise-induced increases in glucose transport, and therefore may be a redundant mechanism.

Improving gene silencing of siRNAs via tricyclo-DNA modification

;Small interfering RNAs (siRNAs) can be exploited for the selective silencing of disease-related genes via the RNA interference (RNAi) machinery and therefore raise hope for future therapeutic applications. Especially chemically modified siRNAs are of interest as they are expected to convert lead siRNA sequences into effective drugs. To study the potential of tricyclo-DNA (tc-DNA) in this context we systematically incorporated tc-DNA units at various positions in a siRNA duplex targeted to the EGFP gene that was expressed in HeLa cells. Silencing activity was measured by FACS, mRNA levels were determined by RT-PCR and the biostability of the modifed siRNAs was determined in human serum. We found that modifications in the 3'-overhangs in both the sense and antisense strands were compatible with the RNAi machinery leading to similar activities compared to wild type (wt) siRNA. Additional modifications at the 3'-end, the 5'- end and in the center of the sense (passenger) strand were also well tolerated and did not compromise activity. Extensive modifications of the 3'- and the 5'-end in the antisense (guide) strand, however, abolished RNAi activity. Interestingly, modifications in the center of the duplex on both strands, corresponding to the position of the cleavage site by AGO2, increased efficacy relative to wt by a factor of 4 at the lowest concentrations (2 nM) investigated. In all cases, reduction of EGFP fluorescence was accompanied with a reduction of the EGFP mRNA level. Serum stability analysis further showed that 3'-overhang modifications only moderately increased stability while more extensive substitution by tc-DNA residues significantly enhanced biostability.

THE ROLE OF BROAD IN DETERMINING NEURONAL COMPOSITION IN THE DROSOPHILA BRAIN

To elucidate the individual roles of the four Broad-Complex (BR-C) isoforms, Z1-Z4, on neuronal composition in the mushroom body, I undertook a series of overexpression experiments and created tools for knockdown experiments. Specifically, I imaged and analyzed Drosophila brains from earlier experiments in which BR-C isoforms Z1 and Z3 were individually overexpressed in the MB. The knockdown experiments required the creation of the molecular tools necessary for isoform-specific RNA interference (RNAi). For these I performed PCR to amplify DNA sequences unique to each isoform and inserted those into the pWIZ vector, which will permit expression of loopless hairpin double stranded RNA to trigger the RNAi pathway in the fly.

The metastatic T-cell hybridoma antigen/P-selectin glycoprotein ligand 1 is required for hematogenous metastasis of lymphomas

Using variants of the murine BW5147 lymphoma cell-line, we have previously identified 3 monoclonal antibodies (MAbs) that discriminate between metastatic and nonmetastatic BW5147-derived T-cell hybridomas and lymphomas, as well as BW5147-unrelated T-lymphomas. These MAbs were reported to recognize an identical membrane-associated sialoglycoprotein, termed "metastatic T-cell hybridoma antigen" (MTH-Ag). Here, we document that the expression pattern of the MTH-Ag on metastatic and nonmetastatic BW5147 variants correlates with that of the P-selectin glycoprotein ligand 1 (PSGL-1), a sialomucin involved in leukocyte recruitment to sites of inflammation. Moreover, the MAbs against the MTH-Ag recognize PSGL-1 when it is transfected in MTH-Ag-negative BW5147 variants, suggesting that the MTH-Ag is PSGL-1. Overexpression of MTH-Ag/PSGL-1 in MTH-Ag-negative BW5147 variants did not affect their in vivo malignancy. Yet, down-regulation of MTH-Ag/PSGL-1 expression on metastatic, MTH-Ag-positive BW5147 variants, using an RNA interference (RNAi) approach, resulted, in a dose-dependent manner, in a significant reduction of liver and spleen colonization and a delay in mortality of the recipient mice upon intravenous inoculation. Collectively, these results demonstrate that, although MTH-Ag/PSGL-1 overexpression alone may not be sufficient for successful dissemination and organ colonization, MTH-Ag/PSGL-1 plays a critical role in hematogenous metastasis of lymphoid cancer cells.

Specificity, duplex degradation and subcellular localization of antagomirs

MicroRNAs (miRNAs) are an abundant class of 20-23-nt long regulators of gene expression. The study of miRNA function in mice and potential therapeutic approaches largely depend on modified oligonucleotides. We recently demonstrated silencing miRNA function in mice using chemically modified and cholesterol-conjugated RNAs termed 'antagomirs'. Here, we further characterize the properties and function of antagomirs in mice. We demonstrate that antagomirs harbor optimized phosphorothioate modifications, require >19-nt length for highest efficiency and can discriminate between single nucleotide mismatches of the targeted miRNA. Degradation of different chemically protected miRNA/antagomir duplexes in mouse livers and localization of antagomirs in a cytosolic compartment that is distinct from processing (P)-bodies indicates a degradation mechanism independent of the RNA interference (RNAi) pathway. Finally, we show that antagomirs, although incapable of silencing miRNAs in the central nervous system (CNS) when injected systemically, efficiently target miRNAs when injected locally into the mouse cortex. Our data further validate the effectiveness of antagomirs in vivo and should facilitate future studies to silence miRNAs for functional analysis and in clinically relevant settings.