Untersuchungen zur Plasmapheresetherapie bei Patienten mit thrombotisch thrombozytopenischer Purpura

Die thrombotische thrombozytopenische Purpura (TTP) ist charakterisiert durch eine Triade aus Thrombozytopenie, hämolytischer Anämie und Mikrothromben. Ursächlich für diese Mikroangiopathie ist ein Mangel der Von Willebrand Faktor (VWF)-spaltenden Protease, ADAMTS13, der durch Autoantikörper oder eine genetische Mutation bedingt sein kann. In der Folge treten hochmolekulare, prothrombotische VWF Multimere im Blut auf, die eine Plättchenadhäsion und -aggregation initiieren, die zu mikrovaskulären Thromben in den Arteriolen und Kapillaren zahlreicher Organe insbesondere im zentralen Nervensystem führt. rnMomentan ist der Goldstandard der Therapie dieser ansonsten tödlich verlaufenden Erkrankung, die Plasmapherese (PEX). Hierfür stehen mit Fresh Frozen Plasma (FFP) und solvent/detergent (s/d) Plasma zwei Präparate zur Verfügung. Die Effizienz der Therapie bei der TTP konnte in den letzten Jahrzehnten im klinischen Alltag belegt werden, dennoch geht die intensive und invasive Therapie mit vielen Risiken und Nebenwirkungen für die Patienten einher, die in dieser Arbeit herausgearbeitet werden sollten. rnIn einer deutschlandweiten Patientenstudie wurde retrospektiv, mittels Fragebögen, ein Nebenwirkungsprofil der Plasmapherese erstellt, sowie mögliche Prädispositionen für die TTP untersucht. Zudem wurden mögliche Auslöser für das Auftreten einer klinisch manifesten TTP analysiert. Die Auswertung zeigte, dass Parästhesien (64,4 %) und Schüttelfrost (61,2 %) als häufigste Nebenwirkungen der PEX bei den Patienten auftraten. Weitere Symptome waren vermehrte Kopfschmerzen (50,6 %) und Tachykardien (36,8 %). Nebenwirkungen wie schwerer Kollaps (9 %) traten selten auf. Patienten mit Allergien in der Anamnese reagierten nicht empfindlicher auf die PEX, als andere. Ein Unterschied in der Häufigkeit der Nebenwirkungen hinsichtlich der verschiedenen Plasmapräparate konnte nicht gezeigt werden, relativiert wird dies durch den sehr geringen Einsatz von Octaplas® bei der untersuchten Patientenkohorte.rnEs konnte eine deutliche Verbindung zwischen dem Auftreten der TTP und anderen Autoimmunerkrankungen gezeigt werden. Von insgesamt 87 Patienten leiden 20,8 % an einer weiteren Autoimmunerkrankung. Insbesondere die Hashimoto Thyreoiditis liegt bei den Befragten als häufige Begleiterkrankung vor. Die genetische Prädisposition hat sich in den vergangen Jahren als ein primärer Risikofaktor für die TTP herausgestellt.rnAls mögliche Trigger eines TTP Schubes konnten Infektionen (38,7 %), Medikamente (u.a. Kontrazeptiva, Chinolone, Clarithromycin) (24,3 %), und Schwangerschaft (5,4 %) ausgemacht werden.rnEin weiterer Untersuchungspunkt der Dissertation war die Beurteilung der ADAMTS13-Aktivität in den Plasmapräparaten. Hierfür wurden drei verschieden Methoden, zwei auf Fluoreszenz Resonanz Energie Transfer beruhende Assays und eine turbidimetrische Messung, verwendet. In allen Methoden konnte eine physiologische ADAMTS13-Aktivität, 646 ng/ml für FFP und 634 ng/ml für Octaplas®, gemessen werden, die sich für beide Präparate nicht signifikant unterschied. Auffällig waren jedoch die höheren Schwankungen der Aktivität bei den verschiedenen Chargen bei FFP gegenüber Octaplas®. rnAufgrund des Herstellungsverfahrens bietet Octaplas® einen sichereren Schutz vor Virusübertragungen und dem Auftreten von TRALI als FFP. Jedoch kann es aufgrund der niedrigen Konzentration an Protein S prothrombotisch wirken. FFP enthält dagegen einen höheren Gehalt an Gerinnungsfaktoren. rnAbschließend ist festzuhalten, dass beide Präparate für die Therapie der TTP geeignet sind. Welches Präparat gewählt wird, sollte individuell für den zu behandelnden Patienten entschieden werden. Bei TTP-Patienten, die in der Vergangenheit bereits sensibel auf FFP reagierten, bietet sich eine Therapie mit Octaplas® an. Die schnelle Bereitstellung einer adäquaten Therapie spielt bei der thrombotisch thrombozytopenischen Purpura die entscheidende Rolle.

Gene therapy for a novel mouse model of Canavan disease

Canavan disease (CD) is a rare leukodystrophy caused by loss-of-function mutations in the gene encoding aspartoacylase (ASPA), an oligodendrocyte-enriched enzyme. It is characterised by the accumulation of the ASPA substrate N-acetylaspartate (NAA) in brain, blood and urine, leading to a spongiform vacuolisation of the brain, severe motoric and cognitive impairments and premature death. To date, no therapy is available due to the lack of a gene-transfer system allowing transgene expression in oligodendrocytes (OLs) and the restoration of the missing enzyme. Hence, the aim of this study was to establish a novel gene-transfer system and its preclinical evaluation in a CD animal model.rnIn the first part of this thesis, a novel ASPA mouse mutant was generated. A βgeo cassette (including the genes encoding β-galactosidase and neomycin) flanked by frt sites was inserted into intron 1 of the intact aspa gene. Additionally, exon 2 was flanked by loxP sites for optional conditional deletion of the targeted locus. The resulting ASPA-deficient aspalacZ/lacZ-mouse was found to be an accurate model of CD and an important tool to identify novel aspects of its complex pathology. Homozygous mutants showed a CD-like histopathology, neurological impairment, behavioural deficits as well as a reduced body weight. Additionally, MRI data revealed changes in brain metabolite composition. rnRecombinant adeno-associated viral (rAAV) vectors have become a versatile tool for gene transfer to the central nervous system because they are efficient, non-toxic and replication-deficient. Based on the natural neurotropism of AAV vectors, AAV-based gene delivery has entered the clinics for the treatment of neurodegenerative diseases. However, the lack of AAV vectors with oligodendroglial tropism has precluded gene therapy for leukodystrophies. In the second part of this work, it was shown that the transduction profile of established AAV serotypes can be targeted towards OLs in a transcriptional approach, using the oligodendrocyte-specific myelin basic protein (MBP) promoter to drive transgene expression in OLs.rnIn the last part of this work, the therapeutic efficacy of AAV-mediated aspa gene transfer to OLs of juvenile aspalacZ/lacZ mice was evaluated. AAV-aspa injections into multiple sites of the brain parenchyma resulted in transduction of OLs in the grey and white matter throughout the brain. Histological abnormalities in the brain of ASPA-deficient mice were ameliorated and accompanied by a reduction of NAA levels. Furthermore, the treatment resulted in normalisation of body weight, motor function and nest-building behaviour. These data provide a proof-of-concept for a successful gene therapy of Canavan disease. This might pave the way towards translation into clinical application and serve as the basis for the genetic treatment of other leukodystrophies.

Generation of FLT3-ITD-reactive T-cell populations from different sources

Approximately 25% of acute myeloid leukemias (AMLs) carry internal tandem duplications (ITD) of various lengths within the gene encoding the FMS-like tyrosine kinase receptor 3 (FLT3). Although varying duplication sites exist, most of these length mutations affect the protein´s juxtamembrane domain. FLT3-ITDs support leukemic transformation by constitutive phosphorylation resulting in uncontrolled activation, and their presence is associated with worse prognosis. As known form previous work, they represent leukemia- and patient-specific neoantigens that can be recognized by autologous AML-reactive CD8+ T cells (Graf et al., 2007; Graf et al., unpublished). Herein, in patient FL, diagnosed with FLT3-ITD+ AML and in first complete remission after induction chemotherapy, T cells against her leukemia´s individual FLT3-ITD were detected at a frequency up to 1.7x10-3 among peripheral blood CD8+ T lymphocytes. This rather high frequency suggested, that FLT3-ITD-reactive T cells had been expanded in vivo due to the induction of an anti-leukemia response.rnrnCell material from AML patients is limited, and the patients´ anti-leukemia T-cell repertoire might be skewed, e.g. due to complex previous leukemia-host interactions and chemotherapy. Therefore, allogeneic sources, i.e. buffy coats (BCs) from health donors and umbilical cord blood (UCB) donations, were exploited for the presence and the expansion of FLT3-ITD-reactive T-cell populations. BC- and UCB-derived CD8+ T cells, were distributed at 105 cells per well on microtiter plates and, were stimulated with antigen-presenting cells (APCs) transfected with in vitro-transcribed mRNA (IVT-mRNA) encoding selected FTL3-ITDs. APCs were autologous CD8- blood mononuclear cells, monocytes or FastDCs.rnrnBuffy coat lymphocytes from 19 healthy individuals were analyzed for CD8+ T-cell reactivity against three immunogenic FLT3-ITDs previously identified in patients VE, IN and QQ and designated as VE_, IN_ and QQ_FLT3-ITD, respectively. These healthy donors carried at least one of the HLA I alleles known to present an ITD-derived peptide from one of these FLT3-ITDs. Reactivities against single ITDs were observed in 8/19 donors. In 4 donors the frequencies of ITD-reactive T cells were determined and were estimated to be in the range of 1.25x10-6 to 2.83x10-7 CD8+ T cells. These frequencies were 1,000- to 10,000-fold lower than the frequency of autologous FLT3-ITD-reactive T cells observed in patient FL. Restricting HLA I molecules were identified in two donors. In one of them, the recognition of VE_FLT3-ITD was found to be restricted by HLA-C*07:02, which is different from the HLA allele restricting the anti-ITD T cells of patient VE. In another donor, the recognition of IN_FLT3-ITD was restricted by HLA-B*35:01, which also had been observed in patient IN (Graf et al., unpublished). By gradual 3´-fragmentation of the IN_FLT3-ITD cDNA, the 10-mer peptide CPSDNEYFYV was identified as the target of allogeneic T cells against IN_FLT3-ITD. rnLymphocytes in umbilical cord blood predominantly exhibit a naïve phenotype. Seven UCB donations were analyzed for T-cell responses against the FLT3-ITDs of patients VE, IN, QQ, JC and FL irrespective of their HLA phenotype. ITD-reactive responses against all stimulatory FLT3-ITDs were observed in 5/7 UCB donations. The frequencies of T cells against single FLT3-ITDs in CD8+ lymphocytes were estimated to be in the range of 1.8x10-5 to 3.6x10-6, which is nearly 15-fold higher than the frequencies observed in BCs. Restricting HLA I molecules were identified in 4 of these 5 positive UCB donations. They were mostly different from those observed in the respective patients. But in one UCB donation T cells against the JC_FLT3-ITD had exactly the same peptide specificity and HLA restriction as seen before in patient JC (Graf et al., 2007). Analyses of UCB responder lymphocytes led to the identification of the 10-mer peptide YESDNEYFYV, encoded by FL_FLT3-ITD, that was recognized in association with the frequent allele HLA-A*02:01. This peptide was able to stimulate and enrich ITD-reactive T cells from UCB lymphocytes in vitro. Peptide responders not only recognized the peptide, but also COS-7 cells co-transfected with FL_FLT3-ITD and HLA-A*02:01.rnrnIn conclusion, T cells against AML- and individual-specific FLT3-ITDs were successfully generated not only from patient-derived blood, but also from allogeneic sources. Thereby, ITD-reactive T cells were detected more readily and at higher frequencies in umbilical cord blood than in buffy coat lymphocytes. It occurred that peptide specificity and HLA restriction of allogeneic, ITD-reactive T cells were identical to autologous patient-derived T cells. As shown herein, allogeneic, FLT3-ITD-reactive T cells can be used for the identification of FLT3-ITD-encoded peptides, e.g. for future therapeutic vaccination studies. In addition, these T cells or their receptors can be applied to adoptive transfer.

Hydrogels for DNA isolation from blood

This dissertation describes the synthesis of surface attached hydrogel biomaterials, characterization of their properties, evaluation of structuring concepts and the investigation of these materials in the isolation of DNA from human whole blood. Photosensitive hydrogel precursor materials on the basis of hydroxyethylmethacrylate (HEMA) were synthesized by free radical polymerization. In order to obtain surface bound hydrogel films, the precursors were deposited on a suitable substrate and subsequently irradatiated with UV - light to accomplish the formation of crosslinks in the film and create surface attachment. The composition of the polymerization precursor materials was determined by comprehensive NMR and GPC studies, revealing the copolymerizationrnbehaviour of the used monomers - HEMA derivatives and the photocrosslinkerrnMABP - and their respective distribution in the hydrogel precursors. The degree of crosslinking of the hydrogels was characterized with UV/vis spectroscopy. Stress-strain measurements were conducted in order to investigate the mechanical properties of the biomaterials. Moreover, the swelling process and biomolecule adsorption properties of the hydrogels were investigated with SPR/OW spectroscopy. For this, the deposition and binding of the hydrogels on gold or SiO2 surfaces was facilitated with photocrosslinkable adhesion promotors. The produced hydrogels were mechanically rigid and stablernunder the conditions of PCR and blood lysis. Furthermore, strategies towards the increase of hydrogel surface structure and porosity with porosigens, 2D laser interference lithography and photocleavable blockcopolymers were investigated. At last, a combinatorial strategy was used for the determination of the usefulness of hydrogels for the isolation from DNA from blood. A series of functionalized hydrogel precursors were synthesized, transferred to the surface inside a PCR tube and subsequently screened in regard to DNA adsorption properties with Taqman quantitative PCR. This approach yielded a promising candidate for a functional PCR tube coating that would allow the entire DNA isolation procedure being carried out in a single reaction container.rnThereforce, the practical application of such macromolecular architectures can be envisioned to improve industrial DNA diagnostic processes.

Evaluation zellulärer Mechanismen der allergen-spezifischen Immuntherapie in einem chronischen Modell der allergischen Atemwegsentzündung

Klinische Studien haben gezeigt, dass die allergenspezifische Immuntherapie (SIT) eine effektive Therapieoption für allergische Erkrankungen ist. Obwohl dieses Therapieverfahren seit über 100 Jahren existiert, sind die zugrunde liegenden Suppressionsmechanismen jedoch nicht vollständig verstanden. Bisher wird angenommen, dass der Behandlungserfolg der SIT auf einer Blockade durch allergenspezifische Antikörper, einer Verschiebung des Th1-Th2-Gleichgewichtes und/oder auf einer Suppression durch regulatorische T-Zellen (Tregs) basiert. Um die Effekte der SIT in einer chronischen Erkrankung in vivo untersuchen zu können, wurde in dieser Doktorarbeit ein Mausmodell für chronisches Asthma entwickelt, das die Situation im Menschen nach einer SIT nachahmt. rnDurch eine SIT war es möglich, allergeninduzierte Asthmasymptome wie Atemwegshyperreagibilität (AHR), Eosinophilie in der Lunge, IgE-Produktion und Atemwegsentzündung im Modell zu unterdrücken. Bemerkenswert ist, dass durch OVA-spezifische Immuntherapie (OVA-IT) ebenfalls eine Verringerung der strukturellen Veränderungen im Lungengewebe im chronischen Krankheitsverlauf erreicht wurde.rnDes Weiteren wurde in diesem Modell nach den Prozessen gesucht, die für die toleranzinduzierende Wirkung der SIT verantwortlich sein können. Dabei wurde im Vergleich zur Placebo-behandelten Gruppe eine erhöhte Antwort spezifischer IgG1-Antikörper, eine verstärkte Th1-Antwort, sowie eine erhöhte Frequenz von FoxP3+ Tregs und von IL-10-produzierenden T-Zellen (Tr1-Zellen) nach OVA-IT festge-stellt. Zur weiteren Untersuchung der von SIT-induzierten T-Zellantworten wurden Mausmodelle des allergischen Asthmas mit einem akuten Verlauf gewählt.rnDie Bedeutung der Th1-Zellen für die SIT wurde in T-bet-/- Mäusen untersucht, welche aufgrund des Fehlens des Transkriptionsfaktors T-bet keine stabile Th1-Antwort induzieren können. Durch SIT war es möglich, allergeninduzierte Asthmasymptome wie AHR, eosinophile Granulozyten in der Lunge, IgE-Produktion und Atemwegsentzündung in den T-bet-/- Tieren im gleichen Maße wie in den Wildtyptieren zu unterdrücken. Diese Untersuchung zeigte, dass die SIT auch ohne funktionelle Th1-Zellen die allergische Entzündung unterdrücken kann. rnDie Rolle der Tregs für die SIT wurde in DO11.10 Mäusen und DO11.10 RAG-/- Mäusen untersucht. In beiden Stämmen konnte nach SIT eine Induktion OVA-spezifischer Tregs nachgewiesen werden. In DO11.10 RAG-/- Mäusen können durch den Knockout im rag2-Gen keine natürlichen, d.h. im Thymus gereiften, Tregs entstehen. Im Blut von DO11.10 RAG-/- Mäusen war direkt nach Durchführung der OVA-IT eine FoxP3+ Treg-Population detektierbar. Demnach wird durch die OVA-IT eine de-novo-Induktion von FoxP3+ Tregs in Gang gesetzt. In Abwesenheit der natürlichen Tregs zeigte sich weiterhin, dass diese Zellen zur Produktion von IL-10 in T-Zellen und somit zum Erfolg der SIT beitragen.rnDie Rolle der FoxP3+ Tregs bei der SIT wurde in DEREG Mäusen untersucht. Eine Depletion der FoxP3+ Tregs in DEREG Mäusen während der Durchführung der OVA-IT hob die protektiven Effekte der Therapie jedoch nur teilweise auf. rnUm die Rolle des regulatorischen Zytokins IL-10 bei der SIT zu untersuchen, wurde ein blockierender Antikörper gegen den IL-10-Rezeptor (anti-IL-10R) im chronischen Modell des allergischen Asthmas mit SIT angewendet. Anti-IL-10R hob die protektive Wirkung der SIT auf die AHR, die Atemwegsentzündung und die strukturellen Veränderungen im Lungengewebe auf. Somit ist die protektive Wirkung der SIT abhängig vom IL-10-Signalweg.rnZusammenfassend stellt diese Arbeit die Bedeutung der SIT für allergische Erkrankungen heraus. SIT kann durch die positive Beeinflussung der allergiebedingten, strukturellen Veränderungen in der Lunge auch für Asthmapatienten große Vorteile bringen. Die aus Studien bekannten Mechanismen konnten im Modell bestätigt werden und wurden im weiteren Verlauf untersucht. Die Arbeit stellt im Besonderen die Bedeutung der IL-10-produzierenden und FoxP3+ Tregs für die Effektivität der SIT in den Vordergrund. Zudem ist durch die Etablierung eines neuen Mausmodells der SIT für chronisches allergisches Asthma ein Mittel zur weiteren Erforschung der zugrunde liegenden Prozesse dieser erfolgreichen Therapie geschaffen worden. rn

Freisetzung von frei zirkulierender DNA unter einer Fahrradergometrie bei Straßenradfahrern

Ziel dieser Studie war es zu untersuchen, ob die unter Belastung vorliegenden Anstiege plasmatischer zellfreier DNA über den Mechanismus der NETose zu erklären sind. Zudem sollte die Assoziation von zellfreier DNA und leistungsphysiologischen Parametern geklärt werden. Anhand eines Stufenprotokolls wurden Straßenradfahrer belastet und durch Blutuntersuchungen auf DNA, MPO, Elastase sowie Leistungsphysiologie untersucht. Anhand der Ergebnisse kann die Herkunft der DNA aus NETs nicht bewiesen werden. Die Neutrophilen Granulozyten zeigen eine Degranulationsreaktion, die aber nicht parallel mit den DNA-Anstiegen verläuft. Leitsungsphysiologisch war auffällig, dass die absolute Leistung mit der DNA korreliert sowie Parameter des Herzkreislaufsystems ebenfalls ähnliche ansteigen wie die DNA im Blut.

Molekulare Ursachen und therapeutische Intervention bei der Alzheimer-Demenz

Ein charakteristisches, neuropathologisches Merkmal der Alzheimer-Demenz (AD), der am häufigsten vorkommenden Demenz-Form des Menschen, ist das Auftreten von senilen Plaques im Gehirn der Patienten. Hierbei stellt das neurotoxische A-beta Peptid den Hauptbestandteil dieser Ablagerungen dar. Einen Beitrag zu der pathologisch erhöhten A-beta Generierung liefert das verschobene Expressionsgleichgewicht der um APP-konkurrierenden Proteasen BACE-1 und ADAM10 zu Gunsten der beta-Sekretase BACE-1. In der vorliegenden Dissertation sollten molekulare Mechanismen identifiziert werden, die zu einem pathologisch veränderten Gleichgewicht der APP-Spaltung und somit zum Entstehen und Fortschritt der AD beitragen. Des Weiteren sollten Substanzen identifiziert werden, die durch Beeinflussung der Genexpression einer der beiden Proteasen das physiologische Gleichgewicht der APP-Prozessierung wiederherstellen können und somit therapeutisch einsetzbar sind.rnAnhand eines „Screenings“ von 704 Transkriptionsfaktoren wurden 23 Faktoren erhalten die das Verhältnis ADAM10- pro BACE-1-Promotor Aktivität beeinflussten. Exemplarisch wurden zwei der molekularen Faktoren auf ihren Wirkmechanismus untersucht: Der TF „X box binding protein-1“ (XBP-1), der die so genannte „unfolded protein response“ (UPR) reguliert, erhöhte die Expression von ADAM10 in Zellkultur-Experimenten. Die Menge dieses Faktors war in AD-Patienten im Vergleich zu gesunden, Alters-korrelierten Kontrollen signifikant erniedrigt. Im Gegensatz dazu verminderte der Seneszenz-assoziierte TF „T box 2“ (Tbx2) die Menge an ADAM10 in SH-SY5Y Zellen. Die Expression des Faktors selbst war in post-mortem Kortexgewebe von AD-Patienten erhöht. Zusätzlich zu den TFs konnten in einer Kooperation mit dem Helmholtz Zentrum München drei microRNAs (miRNA 103, 107, 1306) bioinformatisch prädiziert und experimentell validiert werden, die die Expression des humanen ADAM10 reduzierten.rnIm Rahmen dieser Arbeit konnten damit körpereigene Faktoren identifiziert werden, die die Menge an ADAM10 regulieren und folglich potenziell an der Entstehung der gestörten Homöostase der APP-Prozessierung beteiligt sind. Somit ist die AD auch im Hinblick auf eine A-beta-vermittelte Pathologie als multifaktorielle Krankheit zu verstehen, in der verschiedene Regulatoren zur gestörten APP-Prozessierung und somit zur pathologisch gesteigerten A-beta Generierung beitragen können. rnEine pharmakologische Erhöhung der ADAM10 Genexpression würde zu der Freisetzung von neuroprotektivem APPs-alpha und gleichzeitig zu einer reduzierten A-beta Generierung führen. Deshalb war ein weiteres Ziel dieser Arbeit die Evaluierung von Substanzen mit therapeutischem Potenzial im Hinblick auf eine erhöhte ADAM10 Expression. Von 640 FDA-zugelassenen Medikamenten einer Substanz-Bibliothek wurden 23 Substanzen identifiziert, die die Menge an ADAM10 signifikant steigerten während die Expression von BACE-1 und APP unbeeinflusst blieb. In Zusammenarbeit mit dem Institut für Pathologie (Johannes Gutenberg Universität Mainz) wurde ein Zellkultur-basiertes Modell etabliert, um die Permeationsfähigkeit der potenziellen Kandidaten-Substanzen über die Blut-Hirn Schranke (BHS) zu untersuchen. Von den 23 Medikamenten konnten neun im Rahmen des etablierten Modells als BHS-gängig charakterisiert werden. Somit erfüllen diese verbleibenden Medikamente die grundlegenden Anforderungen an ein AD-Therapeutikum. rnADAM10 spaltet neben APP eine Vielzahl anderer Substrate mit unterschiedlichen Funktionen in der Zelle. Zum Beispiel reguliert das Zelladhäsionsmolekül Neuroligin-1 (NL-1), das von ADAM10 prozessiert wird, die synaptische Funktion exzitatorischer Neurone. Aus diesem Grund ist die Abschätzung potenzieller, Therapie-bedingter Nebenwirkungen sehr wichtig. Im Rahmen eines Forschungsaufenthalts an der Universität von Tokio konnte in primären, kortikalen Neuronen der Ratte bei einer Retinoid-induzierten Erhöhung von ADAM10 neben einer vermehrten alpha-sekretorischen APP-Prozessierung auch eine gesteigerte Spaltung von NL-1 beobachtet werden. Dies lässt vermuten, dass bei einer Behandlung mit dem Retinoid Acitretin neben einer vermehrten APP-Spaltung durch ADAM10 auch die Regulation glutamaterger Neurone durch die Spaltung von NL-1 betroffen ist. Anhand eines geeigneten Alzheimer-Tiermodells sollten diese Befunde weiter analysiert werden, um so auf einen sicheren therapeutischen Ansatz bezüglich einer vermehrten ADAM10 Genexpression schließen zu können.rn

18 F-Click-Radiomarkierung polymerer Trägersysteme zur ex vivo- und in vivo-Evaluierung

Die Positronen-Emissions-Tomographie (PET) ist ein leistungsstarkes, nicht-invasives, bildgebendes Verfahren in der Nuklearmedizin und hat darüber hinaus zunehmende Bedeutung in der Arzneistoffentwicklung. Zur Verbesserung des therapeutischen Index von niedermolekularen Pharmaka werden vermehrt Wirkstofftransportsysteme eingesetzt. Eine Klasse dieser Wirkstofftransportsysteme sind Liposomen. Die Weiterentwicklung der klassischen Liposomen sind sogenannte „Stealth“-Liposomen, die eine Polyethylenglykol (PEG)-Korona zur Herabsetzung der Erkennung und Ausscheidung tragen. Zur (Weiter-)Entwicklung und deren in vivo-Evaluierung bietet die PET die Möglichkeit, die Auswirkungen von strukturellen Anpassungen auf die pharmakokinetischen Eigenschaften solcher Transportsysteme zu untersuchen. Zur Evaluierung neuartiger, cholesterolverankerter, linear-hyperverzweigter Polyglycerole (Ch-PEG-hbPG) als sterisch stabilisierende Polymere in Liposomen wurden diese im Rahmen dieser Arbeit mit der prosthetischen Gruppe 18F-TEG-N3 über kupferkatalysierte Alkin-Azid Cycloaddition (CuAAC) in sehr hohen Ausbeuten radiomarkiert. Zum systematischen Vergleich des in vivo-Verhaltens wurde ebenfalls ein cholesterolbasiertes lineares PEG (Ch-PEG) mit CuAAC nahezu quantitativ radiomarkiert. Als drittes Element wurde die Direktmarkierung von Cholesterol mit [18F]F- entwickelt. Diese drei Verbindungen wurden zuerst separat als Einzelkomponenten und anschließend, in Liposomen formuliert, in Tierstudien an Mäusen hinsichtlich ihrer initialen Pharmakokinetik und Biodistribution untersucht. Dabei zeigte sich ein ähnliches Verhalten der neuartigen Ch-PEG-hbPG-Derivate zu den bekannten Ch-PEG, mit dem Vorteil der Multifunktionalität an den hyperverzweigten Strukturen. Die liposomalen Strukturen mit der neuartigen sterischen Stabilisierung wiesen eine erhöhte Blutzirkulationszeit und vorteilhafte Blut-zu-Leber- und Blut-zu-Lunge-Verhältnisse im Vergleich zu den linear stabilisierten Analoga auf.rnEine weitere Klasse von Wirkstofftransportsystemen sind polymere Trägersysteme wie pHPMA. Alkinfunktionalisierte Polymere konnten in zwei verschiedenen Größen (~12 und 60 kDa) mittels CuAAC in sehr hohen Ausbeuten mit der prosthetischen Gruppe 18F-TEG-N3 radiomarkiert werden. Bicyclononinderivate der gleichen Größen konnten ohne Kupferkatalyse über ringspannungsvermittelte Alkin-Azid-Cycloaddition (SPAAC) mikrowellengestützt markiert werden und stehen somit zur in vivo-Untersuchung hinsichtlich des Einflusses der Markierungsart zur Verfügung.

3D-ultrastructure, functions and stress responses of rhogocytes from the freshwater gastropods Biomphalaria glabrata and Lymnaea stagnalis

Rhogocytes, also termed ‘pore cells’, exist free in the hemolymph or embedded in the connective tissue of different body parts of molluscs, notably gastropods. These unique cells can be round, elongated or irregularly shaped, and up to 30 μm in diameter. Their hallmark is the so-called slit apparatus: i.e. pocket-like invaginations of the plasma membrane creating extracellular lacunae, bridged by cytoplasmic bars. These bars form distinctive slits of ca. 20 nm width. A slit diaphragm composed of proteins establishes a molecular sieve with holes of 20 x 20 nm. Different functions have been assigned to this special molluscan cell type, notably biosynthesis of the hemolymph respiratory protein hemocyanin. It has further been proposed, but not proven, that in the case of red-blooded snail species rhogocytes might synthesize the hemoglobin. However, the secretion pathway of these hemolymph proteins, and the functional role of the enigmatic slit apparatus remained unclear. Additionally proposed functions of rhogocytes, such as heavy metal detoxification or hemolymph protein degradation, are also not well studied. This work provides more detailed electron microscopical, histological and immunobiochemical information on the structure and function of rhogocytes of the freshwater snails Biomphalaria glabrata and Lymnaea stagnalis. By in situ hybridization on mantle tissues, it proves that B. glabrata rhogocytes synthesize hemoglobin and L. stagnalis rhogocytes synthesize hemocyanin. Hemocyanin is present, in endoplasmic reticulum lacunae and in vesicles, as individual molecules or pseudo-crystalline arrays. The first 3D reconstructions of rhogocytes are provided by means of electron tomography and show unprecedented details of the slit apparatus. A highly dense material in the cytoplasmic bars close to the diaphragmatic slits was shown, by immunogold labeling, to contain actin. By immunofluorescence microscopy, the protein nephrin was localized at the periphery of rhogocytes. The presence of both proteins in the slit apparatus supports the previous hypothesis, hitherto solely based on similarities of the ultrastructure, that the molluscan rhogocytes are phylogenetically related to mammalian podocytes and insect nephrocytes. A possible secretion pathway of respiratory proteins that includes a transfer mechanism of vesicles through the diaphragmatic slits is proposed and discussed. We also studied, by electron microscopy, the reaction of rhogocytes in situ to two forms of animal stress: deprivation of food and cadmium contamination of the tank water. Significant cellular reactions to both stressors were observed and documented. Notably, the slit apparatus surface and the number of electron-dense cytoplasmic vesicles increased in response to cadmium stress. Food deprivation led to an increase in hemocyanin production. These observations are also discussed in the framework of using such animals as potential environmental biomarkers.

Erkennung der alpha-Kette des GM-CSF-Rezeptors (CSF2RA) durch einen HLA-unabhängigen alpha:beta-T-Zellrezeptor

Aus dem tumorreaktiven T-Zellrepertoire der Melanompatientin Ma-Mel-86/INTH, bei der im Verlauf Lymphknotenmetastasen HLA-Klasse I-negativer Tumorzellen auftraten, wurden durch Stimulation mit autologen Tumorzellen CD8+ T-Zellklone isoliert und expandiert, die auf Melanomzellen der Patientin CSF2RA (engl. GM-CSF receptor alpha chain) in HLA-unabhängiger Weise erkannten. Aus einem der T-Zellklone wurde ein CSF2RA-reaktiver α:β-T-Zellrezeptor (TCR, engl. T-cell receptor) kloniert (Bezeichnung: TCR-1A.3/46). Die α-Kette des TCR enthielt die Domänen TRAV14/DV4*01, TRAJ48*01 und TRAC*01, die β-Kette die Domänen TRBV10-3*01, TRBD2*01, TRBJ2-7*01 und TRBC2*01. Durch Austausch der humanen konstanten gegen die homologen murinen Domänen wurde der TCR optimiert (Bezeichnung: cTCR-1A.3/46) und hinsichtlich seiner Expression und Funktionalität nach retroviralem Transfer in humane PBMC (engl. peripheral blood mononuclear cells) im 51Chromfreisetzungstest, im IFN-γ-ELISpot-Assay und in einem Degranulations-Assay validiert. TCR-transgene T-Zellen lysierten nicht nur spezifisch die HLA-defizienten, CSF2RA+ Melanomlinien des Modells Ma-Mel-86, sondern erkannten auch Zelllinien verschiedener Spezies nach Transfektion von CSF2RA sowie Monozyten, Granulozyten, dendritische Zellen und ein breites Spektrum hämatologischer Malignome myeloiden Ursprungs ungeachtet deren HLA-Phänotypen. Lymphatische Zellen sowie CD34+ Blutstammzellen wurden in In vitro-Untersuchungen nicht erkannt. Der Zusatz von GM-CSF zu Zellen, die CSF2RA und CSF2RB exprimierten, inhibierte die Erkennung durch TCR-transgene PBMC, während die Koexpression der α- und der ß-Kette des GM-CSF-Rezeptors alleine keinen negativen Effekt auf die Erkennung hatte. Daraus war zu schließen, dass CSF2RA präferentiell freistehend und weniger nach Integration in den heteromultimerischen GM-CSF-Rezeptor-Komplex erkannt wurde. In der zweidimensionalen Collier-de-Perles-Visualisierung der IMGT-Datenbank (engl. International immunogenetics information system) wies der CSF2RA-reaktive TCR-1A.3/46 im Vergleich zu TCR von konventionellen, HLA-restringierten T-Zellen keine Besonderheiten auf. Darüber hinaus waren auch die von den HLA-unabhängigen T-Zellen exprimierten CD8-Moleküle identisch zu den CD8-Molekülen HLA-abhängiger CTL (engl. cytotoxic T lymphocytes). Die Präsenz von CD8-Molekülen förderte die HLA-unabhängige Erkennung von CSF2RA, schien aber dafür nicht zwingend erforderlich zu sein, da Antikörper gegen CD8 die Erkennung zu ca. 65 % blockierten und TCR-transgene CD4+ T-Zellen im Vergleich zu TCR-transduzierten CD8+ T-Zellen eine deutlich verringerte, aber noch erhaltene Funktionalität aufwiesen. Es ist derzeit nicht klar, ob HLA-unabhängige T-Zellen gegen CSF2RA im peripheren Blut der Patientin vorkamen, weil sie der im Tiermodell postulierten Thymusselektion MHC-unabhängiger TCR (Tikhonova et al., Immunity 36:79, 2012) entkommen waren, oder weil ein ursprünglich gegen einen HLA-Peptid-Komplex gerichteter TCR eine HLA-unabhängige Kreuzreaktivität aufwies. CSF2RA verbessert die Glucoseutilisation in malignen Zellen, und es wurden ihm embryotrophe Eigenschaften zugeschrieben (Spielholz et al., Blood 85:973, 1995; Sjöblom et al., Biol. Reprod. 67:1817, 2002). Damit kann CSF2RA malignes Wachstum fördern und ist somit ein potentielles Zielmolekül für die Immuntherapie. Seine HLA-unabhängige Erkennung würde sowohl die HLA-Vielfalt als auch den HLA-Verlust als typische Limitationen der T-Zellimmuntherapie umgehen. Zur Überprüfung der In vivo-Spezifität des HLA-unabhängigen TCR gegen CSF2RA und damit zum Ausschluss relevanter off-tumor-/on-target- bzw. off-tumor-/off-target-Effekte ist jedoch eine Testung in einem präklinischen Tiermodell erforderlich.

Blood-CNS barriers in neurodegenerative diseases

The blood-brain barrier (BBB) and the blood-spinal cord barrier (BSCB) separate the brain and the spinal cord from the circulating blood and are important for the maintenance of the CNS homeostasis. They build a physical barrier thereby protecting the CNS from pathogens and toxic agents, and their disruption plays a crucial role in the pathogenesis of several CNS disorders. In this thesis, the blood-CNS-barriers were studied via in vitro models in two case studies for neurodegenerative disorders, in particular Alzheimer’s disease (AD) and amyotrophic lateral sclerosis (ALS). The first model evaluates treatment possibilities of AD using nanotechnology-based strategies. Since the toxic amyloid-β42 (Aβ42) peptide plays a crucial role in the pathogenesis of AD, reduced generation or enhanced clearance of Aβ42 peptides are expected to modify the disease course in AD. Therefore, several Aβ42-lowering drugs like flurbiprofen had been tested in clinical trials, but most of them failed due to their low brain penetration. Here, flurbiprofen was embedded in polylactide (PLA) nanoparticles and its transport was examined in an in vitro BBB model. The embedding of flurbiprofen into the nanoparticles disguised its cytotoxic potential and enabled the administration of higher drug concentrations which resulted in a sufficient transport of the drug across an endothelial cell monolayer. These results demonstrate that non-permeable drugs can be transported efficiently via nanoparticles and that these nanotechnology-based strategies are a promising tool to generate novel therapeutic options for AD and other CNS diseases. rnThe focus of the second project was to investigate the impaired integrity of the BSCB in a mouse model for ALS. About 20% of all familial ALS cases are associated with missense mutations or small deletions in the gene that encodes Cu/Zn-superoxide dismutase 1 (SOD1). To date, the molecular mechanisms resulting in ALS are still unknown, but there is evidence that the disruption of the BSCB is one of the primary pathological events. In both familial and sporadic ALS patients, loss of endothelial integrity and endothelial cell damage was observed, and studies with SOD1 transgenic mice demonstrated that the BSCB disruption was found prior to motor neuron degeneration and neurovascular inflammation. Thus, an in vitro model for ALS endothelial cells was generated which exhibited comparable integrity characteristics and tight junction (TJ) protein expression profiles as isolated primary endothelial cells of the BSCB of SOD1 transgenic mice. In this, an alteration of the βcat/AKT/FoxO1 pathway, which regulates the expression of the TJ protein claudin-5, could be observed. These data furthermore indicate that ALS is a neurovascular disease, and understanding of the primary events in ALS pathogenesis will hopefully provide ideas for the development of new therapeutic strategies. rn

Methylierungs- und Expressionsuntersuchungen zur Aufklärung der molekularen Pathogenese in chronisch entzündlichen Darmerkrankungen

Unter der Bezeichnung Chronisch Entzündliche Darmerkrankungen (CED) werden zwei Erscheinungsformen, Colitis Ulcerosa (CU) und Morbus Crohn (MC) zusammengefasst. Das Leitsymptom von CED sind chronische Entzündungen des Magen-Darm-Trakts, insbesondere des terminalen Ileum und des Colons. Es wird angenommen, dass eine aberrante Immunantwort auf das intestinale Mikrobiom in einem genetisch prädisponierten Individuum zur Entstehung von CED führt.rnFür diese Studie ist der genetische, bzw. epigenetische Aspekt, der Pathogenese von CU und MC von besonderem Interesse. In verschiedenen Assoziationsstudien wurden bereits 163 mit CED assoziierte, krankheitsrelevante Gen Loci identifiziert. Zusätzlich wurden Studien durchgeführt, die Methylierungs- und Expressionsunterschiede in Gewebe oder Blut von CED-Patienten gegenüber gesunden Probanden (Kontrollen) aufzeigten. rnIn der vorliegenden Studie wurden entzündliche- und nicht-entzündliche Gewebeproben von CU- (Colon) und MC-Patienten (terminales Ileum und Colon) und gesunden Probanden (terminales Ileum und Colon; nicht entzündlich) auf genspezifischer- und genomweiter Ebene auf Methylierungs- und Expressionsunterschiede hin untersucht. Im Rahmen der genspezifischen Analysen wurde in vier Genen (IL17REL, MUC2, MUC6, MUC15) eine aberrante Methylierung im Vergleich der MC- oder CU-Gewebeproben mit den Kontrollen detektiert. Die an 24 ausgewählten CU Colon-Proben (NE und E) und Colon Kontrollen durchgeführte genomweite Methylierungsanalyse zeigte aberrante Methylierungsmuster in über 2500 Genen im Vergleich der entzündlichen CU Colon E-Proben mit den Kontrollen. Fünf dieser Gene (BACH2, STAT3, STAT4, STK4 und WIPF1) wurden ausgewählt und die Veränderung der Methylierung an einem größeren Patientenkollektiv, welches auch Proben von MC-Patienten umfasst, bestätigt. Zusätzlich zu der aberranten Methylierung wurden Expressionsveränderungen des IL17REL-, MUC6- und STAT4-Gens in MC-Patienten sowie des MUC2-Gens in CU-Patienten identifiziert. rnDa über die Promoterregion und Funktion von IL17REL nur sehr wenig bis gar nichts bekannt ist, wurden zusätzlich Promoteranalysen mittels Dual-Luciferase-Assay durchgeführt. Die Ergebnisse zeigten, dass die höchste Aktivität des putativen IL17REL-Promoters im Bereich -806 – -8 vor der 5’UTR zu finden ist. In diesem Bereich lagen auch die in der Methylierungsanalyse untersuchten CpGs.rn

Improvements in production and storage of HP-129 Xe

Seit seiner Entdeckung im Jahre 1978 wurden für hyperpolarisiertes (HP) 129Xe zahlreiche Anwendungen gefunden. Aufgrund seiner hohen Verstärkung von NMR-Signalen wird es dabei typischerweise für Tracer- und Oberflächenstudien verwendet. Im gasförmigen Zustand ist es ein interessantes, klinisches Kontrastmittel, welches für dynamische Lungen MRT genutzt oder auch in Blut oder lipophilen Flüssigkeiten gelöst werden kann. Weiterhin findet HP-Xe auch in der Grundlagenphysik in He-Xe Co-Magnetometern Verwendung, mit welchen z. B. das elektrische Dipolmoment von Xe bestimmt werden soll, oder es dient zur Überprüfung auf Lorentz-Invarianzen. Alle diese Anwendungen profitieren von einem hohen Polarisationsgrad (PXe), um hohe Signalstärken und lange Lagerzeiten zu erreichen. rnIn dieser Arbeit wurden zwei mobile Xe-Polarisatoren konstruiert: einer für Experimente in der Grundlagenphysik mit einer Produktionsrate von 400 mbar·l/h mit PXe ≈ 5%. Der zweite Xe-Polarisator wurde für medizinische Anwendungen entwickelt und soll 1 bar l/h mit PXe > 20% erzeugen. Der letztere wurde noch nicht getestet. Die Arbeitsbedingungen des Xe-Polarisators für Grundlagenphysik (Strömung des Gasgemischs, Temperatur, Druck und Konzentration von Xe) wurden variiert, um einen höchstmöglichen Polarisationsgrad zu erzielen. Die maximale Polarisation von 5,6 % wurde bei Verwendung eine Gasmischung von 1% Xe bei einem Durchfluss von 200 ml/min, einer Temperatur von 150°C und einem Gesamtdruck von 4 bar erreicht. rnWeiterhin muss HP-Xe auch effizient gelagert werden, um Polarisationsverluste zu minimieren. Das ist besonders für solche Anwendungen notwendig, welche an einem entfernten Standort durchgeführt werden sollen oder auch wenn lange Spinkohärenzeiten gefordert sind, z.B. bei He-Xe Co-Magnetometern. rnHierbei bestand bisher die größte Schwierigkeit darin, die Reproduzierbarkeit der gemessenen Lagerzeiten sicherzustellen. In dieser Arbeit konnte die Spin-Gitter-Relaxationszeit (T1) von HP-129Xe in unbeschichteten, Rb-freien, sphärischen Zellen aus Aluminiumsilikatglas (GE-180) signifikant verbessert werden. Die T1–Zeit wurde in einem selbstgebauten Niederfeld-NMR-System (2 mT) sowohl für reines HP-Xe als auch für HP-Xe in Mischungen mit N2, SF6 und CO2 bestimmt. Bei diesen Experimenten wurde die maximale Relaxationszeit für reines Xe (85% 129 Xe) bei (4,6 ± 0,1) h festgestellt. Dabei lagen die typischen Wand-Relaxationszeiten bei ca. 18 h für Glaszellen mit einem Durchmesser von 10 cm. Des Weiteren wurde herausgefunden, dass CO2 eine unerwartet hohe Effizienz bei der Verkürzung der Lebensdauer der Xe-Xe Moleküle zeigte und somit zu einer deutlichen Verlängerung der gesamten T1-Zeit genutzt werden kann. rnIm Verlauf vieler Experimente wurde durch wiederholte Messungen mit der gleichen Zelle, ein "Alterungsprozess“ bei der Wandrelaxation identifiziert und untersucht. Dieser Effekt könnte leicht rückgängig gemacht werden, indem die anfängliche Reinigungsprozedur wiederholt wurde. Auf diese Weise kann eine konstante Wandrelaxation sichergestellt werden, durch die sehr reproduzierbare T1-Messungen möglich werden. rnSchließlich wurde die maximale Relaxationszeit für HP-Xe mit natürlicher Häufigkeit in Mischungen mit SF6 bestimmt. Überraschenderweise war dieser Wert um ca. 75% niedriger als der Wert für Xenon, das zu 85% mit 129Xe angereichert war. Dieser Effekt wurde durch drei unabhängige Experimente bestätigt, da er nicht von der bestehenden Theorie der Xe-Relaxation ableitbar ist. rnDie Polarisation von HP-Xe, PXe, wird normalerweise durch den Vergleich der NMR-Signale des HP-Xe mit einer thermischen polarisierten Probe (z. B. 1H2O oder Xe) bestimmt. Dabei beinhaltet der Vergleich unterschiedlicher Messungen an verschiedenen Proben (unterschiedlicher Druck, Signalintensität und Messverfahren) viele experimentelle Unsicherheiten, welche sich oft nicht leicht bestimmen lassen. Eine einfache, genaue und kostengünstige Methode zur Bestimmung von PXe durch eine direkte Messung der makroskopischen Magnetisierung in einem statischen Magnetfeld vermeidet alle diese Unsicherheiten. Dieses Verfahren kann Polarisationen von > 2 % mit einer Genauigkeit von maximal 10% fast ohne Polarisationsverlust bestimmen. Zusätzlich kann diese Methode ohne weitere Änderungen auch für Bestimmungen des Polarisationsgrades anderer HP-Gase verwendet werden.rn

Klinische, zelluläre und immunologische Charakterisierung des Asthmas im Hinblick auf die Asthma-Kontrolle

Asthma, eine der häufigsten Atemwegserkrankungen, ist ein komplexes Syndrom heterogener Phänotypen. Ihnen allen gemeinsam ist eine Entzündung der Atemwege mit bronchialer Hyperreagibilität und variabler Atemwegsobstruktion.Die Globale Initiative für Asthma (GINA) empfiehlt, eine Therapie am Grad der Asthmakontrolle zu orientieren. Es wird dabei zwischen kontrolliertem, teilweise kontrolliertem und unkontrolliertem Asthma unterschieden. rnDer vorliegenden Dissertation lag die Frage zu Grunde, inwieweit etablierte klinische, funktionelle, zelluläre und Labor-Parameter den Verlauf der Asthmakontrolle wiederspiegeln. Diese Parameter sollten bei klinisch stabiler Kontrolle ebenfalls stabil bleiben, oder eine Änderung gleichgerichtet wiedergeben. Hierzu wurden 120 Patienten im Hinblick auf ihre Asthmakontrolle kategorisiert und im zeitlichen Verlauf an 3 Visiten zum Zeitpunkt 0 (V0), eine Woche (V1) und 6 Monate später (V2) untersucht. Bestimmt wurden klinische Parameter wie Fragebögen zur Asthmakontrolle (ACQ-5 Scores), funktionelle Parameter wie die Lungenfunktion oder die bronchiale Hyperreagibilität zelluläre Parameter wie das Stickoxid im Exhalat (NO) als Korrelat der bronchialen Entzündung, der Anteil eosinophiler Granulozyten im Sputum, die Anzahl eosinophiler und neutrophiler Granulozyten pro nl Blut, die Gesamt-IgE-Spiegel im Serum und zellbiologische Parameter wie die Anteile regulatorischer T-Zellen und die Anteile der T-Zellen, die die Zytokine IFN-ɣ, IL-4, IL-5, IL-10, IL-13 und IL-17 produzieren.rnDie Verbesserung der Asthmakontrolle spiegelte sich in einem Rückgang des NOs um im Median 5,8 ppb (p=0,016) nach 6 Monaten wieder. Sonst ließen sich keine Parameter identifizieren, die die Entwicklung der Asthmakontrolle in positiver oder negativer Richtung abbildeten. Bemerkenswerter Weise bildete selbst der ACQ, der als etabliertes Messinstrument für die Asthmakontrolle gilt, diese Veränderungen nicht ab.rnZellbiologisch unterschieden sich die Patienten mit unterschiedlicher Asthmakontrolle weder in den Anteilen Zytokin-produzierender T-Zellen, noch im Anteil regulatorischer T-Zellen.rnDie Anteile der Zytokin-produzierenden T-Zellen unterlagen im zeitlichen Verlauf zwar deutlicheren Schwankungen als die Anteile regulatorischer T-Zellen, im Median blieben beide jedoch konstant. Die Anteile der Zytokin-produzierenden T-Zellen und regulatorischer Zellen lassen also keine Rückschlüsse auf den Verlauf der Asthmakontrolle zu.rnZusammenfassend ist lediglich das NO geeignet, die Verbesserung der Asthmakontrolle zu beschreiben. Deshalb erscheint es im Angesicht der Ergebnisse dieser Studie nicht sinnvoll, therapeutische Entscheidung lediglich auf Basis eines einzelnen Parameters zu treffen. Hierfür bleibt nach wie vor nur die Zusammenschau verschiedener Untersuchungsergebnisse.rn

Entwicklung eines Screeningverfahrens zum simultanen Nachweis von Opioiden in menschlichen Körperflüssigkeiten, Geweben und Haaren für forensisch-toxikologische und klinische Untersuchungen

In den letzten Jahren stieg in Deutschland der Gebrauch bzw. Missbrauch von Opioid-Analgetika zunehmend an. Das entwickelte Verfahren sollte unter Einbeziehung neuer Substanzen möglichst viele verschiedene Opioide und auch ihre pharmakologisch aktiven Stoffwechselprodukte berücksichtigen.rnVor Analyse wurden Blut-, Serum- oder Urinproben mit Phosphatpuffer versetzt und mittels Festphasenextraktion an C18-Säulenmaterial aufgearbeitet. Post-Mortem-Gewebematerial wurde mit isotonischer Kochsalzlösung versetzt, homogenisiert und anschließend durch eine Festphasenextraktion aufgereinigt. Haarproben wurden nach Zerkleinerung mit Methanol unter Ultrabeschallung extrahiert. Die Flüssigchromatographie gekoppelt mit Tandem-Massenspektrometrie (Elektrosprayionisation im positiven Modus) erwies sich als geeignetes Verfahren für die simultane Bestimmung der Opioide in biologischem Probenmaterial (Körperflüssigkeiten, Gewebe und Haaren). Der Multi-Analyt Assay erlaubt die quantitative Analyse von 35 verschiedenen Opioiden. Die Analyten wurden durch eine Phenyl-Hexyl Säule und einen Wasser/Acetonitril Gradienten durch eine UPLC 1290 Infinity gekoppelt mit einem 6490 Triple Quadrupol von Agilent Technologies separiert.rnDie LC/MS Methode zur simultanen Bestimmung von 35 Opioiden in Serum und Haaren wurde nach den Richtlinien der Gesellschaft für Toxikologische und Forensische Chemie (GTFCh) validiert. Im Fall der Serumvalidierung lagen die Nachweisgrenzen zwischen 0.02 und 0.6 ng/ml und die Bestimmungsgrenzen im Bereich von 0.1 bis 2.0 ng/ml. Die Kalibrationskurven waren für die Kalibrationslevel 1 bis 6 linear. Wiederfindungsraten lagen für alle Verbindungen zwischen 51 und 88 %, außer für Alfentanil, Bisnortiliidn, Pethidin und Morphin-3-Glucuronid. Der Matrixeffekt lag zwischen 86 % (Ethylmorphin) und 105 % (Desomorphin). Für fast alle Analyten konnten akzeptable Werte bei der Bestimmung der Genauigkeit und Richtigkeit nach den Richtlinien der GTFCh erhalten werden. Im Fall der Validierung der Haarproben lagen die Nachweisgrenzen zwischen 0.004 und 0.6 ng/Probe und die Bestimmungsgrenzen zwischen 0.1 ng/Probe und 2.0 ng/Probe. Für die Kalibrationslevel 1 bis 6 waren alle Kalibrationsgeraden linear. Die Wiederfindungsraten lagen für die Opioide im Bereich von 73.5 % (Morphin-6-Glucuronid) und 114.1 % (Hydrocodon). Die Werte für die Bestimmung der Richtigkeit lagen zwischen - 6.6 % (Methadon) und + 11.7 % (Pholcodin). Präzisionsdaten wurden zwischen 1.0 % für Dextromethorphan und 11.5 % für Methadon ermittelt. Die Kriterien der GTFCh konnten bei Ermittlung des Matrixeffekts für alle Substanzen erfüllt werden, außer für 6-Monoacetylmorphin, Bisnortilidin, Meperidin, Methadon, Morphin-3-glucuronid, Morphin-6-glucuronid, Normeperidin, Nortilidin und Tramadol.rnZum Test des Verfahrens an authentischem Probenmaterial wurden 206 Proben von Körperflüssigkeiten mit Hilfe der simultanen LC/MS Screening Methode untersucht. Über 150 Proben wurden im Rahmen von forensisch-toxikologischen Untersuchungen am Instituts für Rechtsmedizin Mainz analysiert. Dabei konnten 23 der 35 Opioide in den realen Proben nachgewiesen werden. Zur Untersuchung der Pharmakokinetik von Opioiden bei Patienten der anästhesiologischen Intensivstation mit Sepsis wurden über 50 Blutproben untersucht. Den Patienten wurde im Rahmen einer klinischen Studie einmal täglich vier Tage lang Blut abgenommen. In den Serumproben wurde hauptsächlich Sufentanil (0.2 – 0.8 ng/ml in 58 Fällen) und Piritramid (0.4 – 11 ng/ml in 56 Fällen) gefunden. Außerdem wurden die Proben von Körperflüssigkeiten und Gewebe von 13 verschiedenen Autopsiefällen mit Hilfe des Multi-Analyt Assays auf Opioide untersucht.rnIn einem zweiten Schritt wurde die Extraktions- und Messmethode zur Quantifizierung der 35 Opioide am Forensic Medicine Center in Ho Chi Minh City (Vietnam) etabliert. Insgesamt wurden 85 Herzblutproben von Obduktionsfällen mit Verdacht auf Opiatintoxikation näher untersucht. Der überwiegende Teil der untersuchten Fälle konnte auf eine Heroin- bzw. Morphin-Vergiftung zurückgeführt werden. Morphin wurde in 68 Fällen im Konzentrationsbereich 1.7 – 1400 ng/ml und der Heroinmetabolit 6-Monoactetylmorphin in 34 Fällen (0.3 – 160 ng/ml) nachgewiesen werden.rnSchließlich wurden noch 15 Haarproben von Patienten einer psychiatrischen Klinik, die illegale Rauschmittel konsumiert hatten, mit Hilfe der simultanen Opioid-LC/MS Screeningmethode gemessen. Die Ergebnisse der Untersuchung wurden mit früheren Auswertungen von gaschromatographischen Analysen verglichen. Es zeigte sich eine weitgehende Übereinstimmung der Untersuchungsergebnisse für die Opioide 6-Monoacetylmorphin, Morphin, Codein, Dihydrocodein und Methadon. Mit der LC/MS Methode konnten weitere Substanzen, wie zum Beispiel Bisnortilidin, Dextromethorphan und Tramadol in den Haarproben gefunden werden, die bislang nicht entdeckt worden waren.rn