Erkennung der alpha-Kette des GM-CSF-Rezeptors (CSF2RA) durch einen HLA-unabhängigen alpha:beta-T-Zellrezeptor

Aus dem tumorreaktiven T-Zellrepertoire der Melanompatientin Ma-Mel-86/INTH, bei der im Verlauf Lymphknotenmetastasen HLA-Klasse I-negativer Tumorzellen auftraten, wurden durch Stimulation mit autologen Tumorzellen CD8+ T-Zellklone isoliert und expandiert, die auf Melanomzellen der Patientin CSF2RA (engl. GM-CSF receptor alpha chain) in HLA-unabhängiger Weise erkannten. Aus einem der T-Zellklone wurde ein CSF2RA-reaktiver α:β-T-Zellrezeptor (TCR, engl. T-cell receptor) kloniert (Bezeichnung: TCR-1A.3/46). Die α-Kette des TCR enthielt die Domänen TRAV14/DV4*01, TRAJ48*01 und TRAC*01, die β-Kette die Domänen TRBV10-3*01, TRBD2*01, TRBJ2-7*01 und TRBC2*01. Durch Austausch der humanen konstanten gegen die homologen murinen Domänen wurde der TCR optimiert (Bezeichnung: cTCR-1A.3/46) und hinsichtlich seiner Expression und Funktionalität nach retroviralem Transfer in humane PBMC (engl. peripheral blood mononuclear cells) im 51Chromfreisetzungstest, im IFN-γ-ELISpot-Assay und in einem Degranulations-Assay validiert. TCR-transgene T-Zellen lysierten nicht nur spezifisch die HLA-defizienten, CSF2RA+ Melanomlinien des Modells Ma-Mel-86, sondern erkannten auch Zelllinien verschiedener Spezies nach Transfektion von CSF2RA sowie Monozyten, Granulozyten, dendritische Zellen und ein breites Spektrum hämatologischer Malignome myeloiden Ursprungs ungeachtet deren HLA-Phänotypen. Lymphatische Zellen sowie CD34+ Blutstammzellen wurden in In vitro-Untersuchungen nicht erkannt. Der Zusatz von GM-CSF zu Zellen, die CSF2RA und CSF2RB exprimierten, inhibierte die Erkennung durch TCR-transgene PBMC, während die Koexpression der α- und der ß-Kette des GM-CSF-Rezeptors alleine keinen negativen Effekt auf die Erkennung hatte. Daraus war zu schließen, dass CSF2RA präferentiell freistehend und weniger nach Integration in den heteromultimerischen GM-CSF-Rezeptor-Komplex erkannt wurde. In der zweidimensionalen Collier-de-Perles-Visualisierung der IMGT-Datenbank (engl. International immunogenetics information system) wies der CSF2RA-reaktive TCR-1A.3/46 im Vergleich zu TCR von konventionellen, HLA-restringierten T-Zellen keine Besonderheiten auf. Darüber hinaus waren auch die von den HLA-unabhängigen T-Zellen exprimierten CD8-Moleküle identisch zu den CD8-Molekülen HLA-abhängiger CTL (engl. cytotoxic T lymphocytes). Die Präsenz von CD8-Molekülen förderte die HLA-unabhängige Erkennung von CSF2RA, schien aber dafür nicht zwingend erforderlich zu sein, da Antikörper gegen CD8 die Erkennung zu ca. 65 % blockierten und TCR-transgene CD4+ T-Zellen im Vergleich zu TCR-transduzierten CD8+ T-Zellen eine deutlich verringerte, aber noch erhaltene Funktionalität aufwiesen. Es ist derzeit nicht klar, ob HLA-unabhängige T-Zellen gegen CSF2RA im peripheren Blut der Patientin vorkamen, weil sie der im Tiermodell postulierten Thymusselektion MHC-unabhängiger TCR (Tikhonova et al., Immunity 36:79, 2012) entkommen waren, oder weil ein ursprünglich gegen einen HLA-Peptid-Komplex gerichteter TCR eine HLA-unabhängige Kreuzreaktivität aufwies. CSF2RA verbessert die Glucoseutilisation in malignen Zellen, und es wurden ihm embryotrophe Eigenschaften zugeschrieben (Spielholz et al., Blood 85:973, 1995; Sjöblom et al., Biol. Reprod. 67:1817, 2002). Damit kann CSF2RA malignes Wachstum fördern und ist somit ein potentielles Zielmolekül für die Immuntherapie. Seine HLA-unabhängige Erkennung würde sowohl die HLA-Vielfalt als auch den HLA-Verlust als typische Limitationen der T-Zellimmuntherapie umgehen. Zur Überprüfung der In vivo-Spezifität des HLA-unabhängigen TCR gegen CSF2RA und damit zum Ausschluss relevanter off-tumor-/on-target- bzw. off-tumor-/off-target-Effekte ist jedoch eine Testung in einem präklinischen Tiermodell erforderlich.

Melanoma patient Ma-Mel-86/INTH developed lymph-node metastases of HLA class I-negative tumor cells. From her peripheral blood CD8+ T-cell clones recognizing CSF2RA (GM-CSF receptor alpha chain) in an HLA class I-independent manner were isolated and expanded by stimulation with autologous tumor cells. From one of these T-cell clones a CSF2RA-reactive α:β-T-cell receptor (designated TCR-1A.3/46) was cloned. Its α-chain comprised the domains TRAV14/DV4*01, TRAJ48*01 and TRAC*01, and its β-chain contained the domains TRBV10-3*01, TRBD2*01, TRBJ2-7*01 and TRBC2*01. By replacing the human constant domains with their homologous murine counterparts the TCR was optimized (designated cTCR-1A.3/46) and validated regarding its expression and functionality using 51chromium release, IFN-γ-ELISpot and degranulation assays. TCR-transgenic T cells not only specifically lysed HLA-deficient, CSF2RA+ Ma-Mel-86 melanoma lines but also recognized various cell lines of different species upon transfection with CSF2RA. In addition, monocytes, granulocytes, dendritic cells and a broad range of hematological malignancies of myeloid origin were targeted, irrespective of their HLA phenotypes. Lymphatic cells as well as CD34+ blood stem cells were not recognized in in vitro assays. The addition of GM-CSF to cells expressing both CSF2RA and CSF2RB inhibited the recognition by TCR-transgenic PBMC (peripheral blood mononuclear cells), while coexpression of the GM-CSF receptor α- and β-chain alone did not negatively affect antigen recognition. This led to the conclusion that CSF2RA+ cells were preferentially recognized when free CSF2RA was accessible on the cell surface and to a lesser extent when the protein was integrated into the heteromultimeric GM-CSF receptor complex. According to the two-dimensional Collier-de-Perles visualization of the IMGT database (International immunogenetics information system), the CSF2RA-reactive TCR-1A.3/46 did not show characteristic features compared to TCR derived from conventional HLA-restricted T cells. Additionally, CD8 molecules expressed by HLA-independent T cells were identical to CD8 molecules expressed by HLA-dependent CTL (engl. cytotoxic T lymphocytes). The presence of CD8 molecules promoted HLA-independent recognition of CSF2RA but appeared not to be essential, since antibodies directed against CD8 blocked recognition only by about 65 % and TCR-transgenic CD4+ T cells exhibited a decreased but still retained functionality. It remains to be elucidated if the presence of HLA-independent, anti-CSF2RA T cells in the patient´s peripheral blood was due to their escape from thymus selection, as postulated in animal models (Tikhonova et al., Immunity 36:79, 2012), or if it resulted from an HLA-independent cross reactivity of a primarily HLA-restricted TCR. CSF2RA has been shown to improve glucose utilization by malignant cells and to mediate embryotrophic effects (Spielholz et al., Blood 85:973, 1995; Sjöblom et al., Biol. Reprod. 67:1817, 2002). Thus, CSF2RA can support malignant growth and, therefore, represents a potential target molecule for immunotherapy. Its HLA-independent recognition might circumvent HLA diversity and HLA loss as typical limitations of T cell-based immunotherapy. However, preclinical testing in animal models is required to validate the in vivo specificity of the HLA-independent, anti-CSF2RA TCR and to exclude relevant off-tumor/on-target and off-tumor/off-target effects.