Synthese von Sialyl-Lewis X -Glycopeptiden und -Mimetika als Zelladhäsionsinhibitoren für E-Selektin

Die Selektine initiieren im Verlauf von Entzündungsprozessen einen ersten Zellkontakt zwischen Leukozyten und Endothelzellen und ermöglichen so die Auswanderung der Leukozyten aus den Blutgefäßen in das umliegende Gewebe, wo sie ihre immunologische Wirkung entfalten können. Viele Krankheiten gehen allerdings mit einer übermäßigen, durch Selektine vermittelten Zelladhäsion einher. Daher war es das Ziel dieser Arbeit, Selektininhibitoren zu synthetisieren, die pathologische Zelladhäsionsprozesse, wie man sie z.B. bei rheumatoider Arthritis, bei Erkrankungen der Herzkranzgefäße oder im Verlauf von Tumormetastasierungen findet, unterbinden können. Als Leitstruktur für solche Inhibitoren dient das auf den natürlichen Selektinliganden vorkommende Tetrasaccharid Sialyl-Lewis-X. Sialyl-Lewis-X stellt aber nur einen Teil der natürlichen Selektinliganden dar. Es bindet auch nur im millimolaren Bereich an die Selektine. Die komplexen natürlichen Selektinliganden wie z.B. ESL-1 (E-Selektin-Ligand-1), die an verschiedenen Glycosylierungs-stellen des Glycoproteins Sialyl-Lewis-X präsentieren, binden mit deutlich höherer Affinität an die Selektine. Für eine spezifische Rezeptorbindung sind daher außer dem Tetrasaccharid weitere Partialstrukturen verantwortlich, wobei gezeigt werden konnte, dass ein Anknüpfen von Sialyl-Lewis-X-Derivaten an die Partialsequenz 672-681 des ESL-1 eine Affinitätssteigerung hervorruft. Ein weiterer Nachteil des natürlichen Sialyl-Lewis-X-Tetrasaccharids im Hinblick auf seine pharmakologische Verwendung besteht darin, dass sowohl die fucosidische Bindung als auch die glycosidische Verknüpfung zur Neuraminsäure durch Enzyme leicht gespalten werden, wodurch Sialyl-Lewis-X als potenzielles Anti-Adäsionsmolekül an Wert verliert. Um die Kohlenydratliganden vor einem solchen enzymatischen Abbau zu bewahren, wurden in dieser Arbeit neben der im Sialyl-Lewis-X vorliegenden L-Fucose die im Menschen nicht vorkommenden Kohlenhydrate D-Arabinose und L-Galactose sowie neben der Neuraminsäure die (S)-Cyclohexylmilchsäure zur Herstellung der sechs Glycopeptid-Selektinliganden 1-6 mit der Partialsequenz 672-681 des ESL-1 verknüpft. Die Tetrasaccharide und Tetrasaccharid-Mimetika können aus den geschützten Monosacchariden und der geschützten Cyclohexylmilch-säure in parallelen Synthesen im Gramm-Maßstab hergestellt werden. Die automatisierten Glycopeptid-Festphasensynthesen wurden an einem Peptidsynthesizer nach der Fmoc-Strategie unter Verwendung von mit Asparaginsäure vorbeladenen TentaGel®-Harzen durchgeführt. Die Strukturen aller sechs Glycopeptide 1-6 wurden sowohl durch hoch auflösende massenspektrometrische Analysen als auch durch ein- und zweidimensionale NMR-Experimente belegt. Als Ergebnis dieser Arbeit liegen sechs Sialyl-Lewis-X-Glycopeptide und -Mimetika mit der Partialsequenz 672-681 des ESL-1 vor. Diese werden in Kürze auf ihre Wirksamkeit als Zelladhäsions-inhibitoren für E-Selektin getestet. Daraus sollen sich Erkenntnisse über Struktur-Wirkungs-Beziehungen gewinnen lassen, insbesondere was das kooperative Zusammenwirken von Saccharid- und Peptidteilstrukturen in der Erkennung der Liganden durch das E-Selektin anbetrifft.

Einfluss des Aktin-Zytoskeletts und intrazellulärer Signalkaskaden auf die postsynaptische Lokalisation von Gephyrin

Neuronen haben für die Informationsübertragung untereinander spezielle Strukturen entwickelt, welche als Synapsen bezeichnet werden. Um eine schnelle und präzise synaptische Signalübertragung zu gewährleisten, ist eine hohe Konzentration von Neurotransmitter-regulierten Ionenkanälen in der postsynaptischen Plasmamembran notwendig. Die spezifische Verankerung der Rezeptoren wird durch intrazelluläre Proteine der Postsynapse vermittelt. Das periphere Membranprotein Gephyrin spielt eine essentielle Rolle in der synaptischen Lokalisation von Glyzin- und GABAA-Rezeptoren an inhibitorischen Synapsen. Um das postsynaptische Netzwerk zu stabilisieren, ist eine Interaktion von Gephyrin mit Proteinen der Mikrofilamente und der Mikrotubuli nötig. In der vorliegenden Arbeit sollte analysiert werden, wie Gephyrin mit dem Aktin-Zytoskelett interagiert, und ob die Größe und Stabilität neuronaler Gephyrincluster durch das Aktin-Zytoskelett reguliert wird. Dies wurde mittels Expression von GFP-Gephyrin-Konstrukten in HEK293T-Zellen und Aktin-depolymerisierende Alkaloidbehandlung von hippokampalen Primärkulturzellen untersucht. Der Einfluss unterschiedlicher Signalkaskaden auf die Lokalisation und Funktionalität von GABAA- oder Glyzin-Rezeptoren wurde bereits intensiv untersucht, jedoch für Rezeptor-assoziierte Proteine wie Gephyrin existierten nur wenig relevante Daten. Ein weiteres Ziel war daher, durch pharmakologische Beeinflussung von Schlüsselenzymen in hippokampalen Primärkulturen jene Signalwege zu identifizieren, die am Transport von Gephyrin, seiner Stabilisierung im postsynaptischen Netzwerk und seinem Abbau beteiligt sind. Im Verlauf der Arbeit konnte belegt werden, dass das Aktin-regulierende Phosphoprotein ena/VASP als Adapter die Interaktion von Gephyrin mit F-Aktin vermittelt, und dass diese Bindung ausreicht, um Gephyrin an das Aktin-Zytoskelett zu rekrutieren. Entgegen früheren Veröffentlichungen konnte die Bindung von ena/VASP im Bereich der sog. Linkerregion von Gephyrin nachgewiesen werden. Aktin-depolymerisierende Alkaloidbehandlungen von hippokampalen Neuronen bestätigten, das die Lokalisation von Gephyrin an sich entwickelnden inhibitorischen Kontakten von einem intakten Mikrofilamentsystem abhängig zu sein scheint. Das Aktin-Zytoskelett könnte somit eine transiente Rolle in der Ausbildung und Stabilisierung des Gephyrin-Netzwerkes in der frühen Entwicklung von inhibitorischen GABAergen Synapsen haben, während die Abhängigkeit der synaptisch-lokalisierten Gephyrincluster vom Aktin-Zytoskelett mit steigender neuronaler Differenzierung abnimmt. Zusätzlich konnte erstmals der Einfluss einzelner Signaltransduktionskaskaden auf die synaptische Lokalisation von Gephyrin nachgewiesen werden. Dabei hatte die Inhibition der Protein- Phosphatasen 1 und 2A eine Destabilisierung synaptisch-lokalisierter Gephyrincluster bei gleichzeitigem Anstieg der zytoplasmatischen Immunreaktivität zur Folge. Dies ist möglicherweise auf eine Hyperphosphorylierung wichtiger Sequenzabschnitten von Gephyrin zurückzuführen, wobei Änderungen im Phosphorylierungsstatus der Linkerregion von Gephyrin unter anderem die Assoziation mit dem Zytoskelett beeinträchtigen oder lösen könnten. Umgekehrt könnte eine Dephosphorylierung möglicherweise die Stabilität der Vernetzung erhöht. Kopräzipitationsstudien konnten zusätzlich nachweisen, dass Gephyrin, PP1 und PP2A nicht nur gemeinsam an inhibitorischen Synapsen vorliegen, sondern dass eine direkte Interaktion besteht. Dabei handelt es sich um den ersten Nachweis einer direkten Bindung von Gephyrin an Ser/Thr-Phosphatasen. Die Komplexbildung von PP1 und PP2A mit Gephyrin könnten der Regulation des Phosphorylierungsgrades dienen. Der genaue Mechanismus wird jedoch in weiteren Experimenten zu untersuchen sein.

Post-transkriptionelle Regulation der Expression der humanen induzierbaren NO-Synthase

Die Expression der humanen induzierbaren NO-Synthase (iNOS) wird sowohl über transkriptionelle als auch über post-transkriptionelle Mechanismen reguliert. Dabei spielt die Modulation der iNOS-mRNA-Stabilität durch RNA-bindende Proteine eine bedeutende Rolle. In dieser Arbeit konnte eine Beteiligung des p38-MAPK-Signaltransduktionsweges sowie der RNA-bindenden Proteine TTP, KSRP, HuR und PTB an der Regulation der iNOS-Expression dargestellt werden. Hemmung der p38-MAPK führte zu einer Reduktion der iNOS-mRNA-Expression, hatte aber keinen Effekt auf die iNOS-Promotoraktivität. Das RNA-bindende Protein Tristetraprolin (TTP) erhöhte die Stabilität der iNOS-mRNA nach Zytokin-Stimulation, ohne jedoch mit ihr zu interagieren. Die Proteinexpression von TTP war unter dem Einfluss von Zytokinen erhöht; Inhibition der p38-MAPK verursachte eine Verminderung der Zytokin-stimulierten TTP-Expression. Das „KH-type splicing regulatory protein" (KSRP) übte einen destabilisierenden Effekt auf die iNOS-mRNA aus. Der Abbau der mRNA wird dabei wahrscheinlich durch eine Zytokin-unabhängige Interaktion von KSRP mit dem Exosom vermittelt. Ebenso konnte zwischen KSRP und TTP eine Wechselwirkung beobachtet werden, die nach Induktion der iNOS-Expression mit Zytokinen verstärkt und durch p38-MAPK-Inhibitoren hemmbar war. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass die Bindung von KSRP an die iNOS-mRNA-3’-UTR für die Vermittlung des destabilisierenden Effekts essentiell ist. Eine genaue Lokalisierung der KSRP-Bindungsstelle ergab, dass KSRP ebenso wie HuR mit dem AU-reichen Element am 3’-Ende der 3’-UTR interagiert. KSRP und HuR sind in der Lage, um diese Bindungsstelle zu konkurrieren. Nach Zytokin-Stimulation war dementsprechend die endogene Bindung von KSRP an die iNOS-mRNA vermindert, während die endogene Bindung von HuR an die iNOS-mRNA verstärkt war. Die Stabilisierung der iNOS-mRNA nach Zytokin-Stimulation ergibt sich demnach aus einer Verminderung der Bindung des KSRP-Exosom-Komplexes an die iNOS-mRNA als Folge der verstärkten Interaktion von TTP und KSRP. Dies ermöglicht parallel eine vermehrte Bindung von HuR an die iNOS-3’-UTR und führt damit zu einer Stabilisierung der iNOS-mRNA und so letztendlich auch zu einer Erhöhung der iNOS-Expression. Außerdem konnte eine Beteiligung des Polypyrimidin-Trakt-bindenden Proteins (PTB) an der Regulation der humanen iNOS-Expression gezeigt werden. PTB erhöhte die Expression der iNOS und interagierte Zytokin-unabhängig mit KSRP. Zusammenfassend lässt sich schließen, dass ein Zusammenspiel verschiedener Proteine in einem komplexen Netzwerk für die fein abgestimmte Regulation der humanen iNOS-Expression auf post-transkriptioneller Ebene verantwortlich.

Räumliche und zeitliche Einbindung einer strukturierten Population der Westlichen Smaragdeidechse (Lacerta bilineata, DAUDIN 1802) im Mittelrheintal

In der vorliegenden Arbeit wurde die räumliche und zeitliche Dynamik einer strukturierten Population der Westlichen Smaragdeidechse (DAUDIN, 1802) im Mittelrheintal zwischen 1997 und 2000 untersucht. Dazu wurden die Teilaspekte der Hibernation, der Thermoregulation und der Raumnutzung der Art analysiert. Die Ergebnisse der Hibernation deuten auf eine hohe Relevanz dieses Jahresabschnitts für die Art in Bezug auf die Verbreitung in Südexponierten Steilhanglagen am Nordrand ihrer Verbreitung hin. Die Hibernationsstandorte unterscheiden sich im Mikroklimaprofil von Trockenmauern und Sommerlöchern. Die Standorte der Hibernation liegen in Zonen höchster Insolation im Untersuchungsgebiet. Die Analyse der Thermoregulation zeigte geschlechtsspezifische und saisonale Unterschiede, die mit den unterschiedlichen Jahresaktivitätszyklen erklärt werden können. Die Weibchen zeigen eine engere Bindung an die klimatischen Entwicklungen von Mirkohabitatstrukturen als die Männchen, was mit endogenen Faktoren zusammenhängen könnte. Die Parallelen und Unterschiede zu anderen Arten werden diskutiert. In der Raumnutzung zeigen sich auch Unterschiede zwischen Männchen und Weibchen, die auch mit den unterschiedlichen Jahresaktivitätszyklen erklärt werden können. Im Frühjahr und im Herbst zeigt die Art eine Bindung an Standorte hoher Insolation im Untersuchungsgebiet, im Sommer dagegen keine. In der Gesamtbetrachtung werden die Ergebnisse in Bezug auf das Verbreitungsbild der Art, Schutzaspekte und Schlüsselfaktoren der Habitatqualität diskutiert.

Radiochemical aspects of production and processing of radiometals for preparation of metalloradiopharmaceuticals

Radiometals play an important role in nuclear medicine as involved in diagnostic or therapeutic agents. In the present work the radiochemical aspects of production and processing of very promising radiometals of the third group of the periodic table, namely radiogallium and radiolanthanides are investigated. The 68Ge/68Ga generator (68Ge, T½ = 270.8 d) provides a cyclotron-independent source of positron-emitting 68Ga (T½ = 68 min), which can be used for coordinative labelling. However, for labelling of biomolecules via bifunctional chelators, particularly if legal aspects of production of radiopharmaceuticals are considered, 68Ga(III) as eluted initially needs to be pre-concentrated and purified. The first experimental chapter describes a system for simple and efficient handling of the 68Ge/68Ga generator eluates with a cation-exchange micro-chromatography column as the main component. Chemical purification and volume concentration of 68Ga(III) are carried out in hydrochloric acid – acetone media. Finally, generator produced 68Ga(III) is obtained with an excellent radiochemical and chemical purity in a minimised volume in a form applicable directly for the synthesis of 68Ga-labelled radiopharmaceuticals. For labelling with 68Ga(III), somatostatin analogue DOTA-octreotides (DOTATOC, DOTANOC) are used. 68Ga-DOTATOC and 68Ga-DOTANOC were successfully used to diagnose human somatostatin receptor-expressing tumours with PET/CT. Additionally, the proposed method was adapted for purification and medical utilisation of the cyclotron produced SPECT gallium radionuclide 67Ga(III). Second experimental chapter discusses a diagnostic radiolanthanide 140Nd, produced by irradiation of macro amounts of natural CeO2 and Pr2O3 in natCe(3He,xn)140Nd and 141Pr(p,2n)140Nd nuclear reactions, respectively. With this produced and processed 140Nd an efficient 140Nd/140Pr radionuclide generator system has been developed and evaluated. The principle of radiochemical separation of the mother and daughter radiolanthanides is based on physical-chemical transitions (hot-atom effects) of 140Pr following the electron capture process of 140Nd. The mother radionuclide 140Nd(III) is quantitatively absorbed on a solid phase matrix in the chemical form of 140Nd-DOTA-conjugated complexes, while daughter nuclide 140Pr is generated in an ionic species. With a very high elution yield and satisfactory chemical and radiolytical stability the system could able to provide the short-lived positron-emitting radiolanthanide 140Pr for PET investigations. In the third experimental chapter, analogously to physical-chemical transitions after the radioactive decay of 140Nd in 140Pr-DOTA, the rapture of the chemical bond between a radiolanthanide and the DOTA ligand, after the thermal neutron capture reaction (Szilard-Chalmers effect) was evaluated for production of the relevant radiolanthanides with high specific activity at TRIGA II Mainz nuclear reactor. The physical-chemical model was developed and first quantitative data are presented. As an example, 166Ho could be produced with a specific activity higher than its limiting value for TRIGA II Mainz, namely about 2 GBq/mg versus 0.9 GBq/mg. While free 166Ho(III) is produced in situ, it is not forming a 166Ho-DOTA complex and therefore can be separated from the inactive 165Ho-DOTA material. The analysis of the experimental data shows that radionuclides with half-life T½ < 64 h can be produced on TRIGA II Mainz nuclear reactor, with specific activity higher than any available at irradiation of simple targets e.g. oxides.

Bioinformatische, genomweite Analyse genexpressionsregulierender Faktoren in Lebergewebe

Für eine Reihe einzelner genetischer Faktoren und Promotorelemente wurde in der Vergangenheit eine Regulation der Genexpression in der Leber (und auch in anderen Geweben) gezeigt. Mit der Verfügbarkeit des gesamten humanen Genoms sowie dessen Expressionsdaten in großen Microarray- und SAGE-Datenbanken bietet sich die Möglichkeit, solche Regulationsmechanismen in großem, genomweitem Maßstab zu untersuchen. Dabei geht diese Arbeit der Frage nach, ob es übergeordnete, eine Expression speziell in der Leber fördernde oder hemmende Faktoren gibt oder ob jedes Gen von einer unabhängigen Kombination von Faktoren reguliert wird, in dessen Summe die Expression des individuellen Gens in der Leber am stärksten ist. Sollten sich übergeordnete, eine Expression in der Leber stimulierende Faktoren finden, wären diese interessant für die Entwicklung neuer Behandlungskonzepte bei Lebererkrankungen. Zur Untersuchung dieser Fragestellung wurden aus einem Affymetrix Microarray Datenset für 12 Gewebe die Expressiondaten von insgesamt jeweils 15.472 Genen extrahiert. In einem zweiten Schritt wurden zusätzlich die Promotorsequenzen der einzelnen zugehörigen Gene, definiert als eine 1000 bp Region upstream des Transkriptionsstarts, in dieselbe Datenbank abgelegt. Die Promotorsequenzen wurden über den PromotorScan-Algorithmus analysiert. Auf diese Weise wurden Transkriptionsfaktorbindungsstellen auf 7042 der Promotoren identifiziert. Es fand sich eine Gesamtzahl von 241.984 Transkriptionsfaktorbindungsstellen. Anhand der Microarray-Expressionsdaten wurde die Gesamtgruppe der verfügbaren Gene und Promotoren in zwei Gruppen unterteilt, nämlich in die Gruppe der Gene, deren Expression in der Leber deutlich am höchsten gefunden wurde und in die Gruppe der Gene, die in anderen Geweben am höchsten exprimiert waren. Jeder potentiell bindende Transkriptionsfaktor wurde auf unterschiedliches Vorkommen in diesen beiden Gruppen hin untersucht. Dies geschah unter der Vorstellung, dass übergeordnete Faktoren, die eine Expression in der Leber stimulieren in der Gruppe der Gene, die in der Leber am höchsten exprimiert sind, verhältnismäßig wesentlich häufiger zu finden sein könnten. Eine solches häufigeres Vorkommen ließ sich jedoch für keinen einzigen Faktor nachweisen. Transkriptionsfaktorbindungsstellen sind typischerweise zwischen 5 und 15 bp lang. Um auszuschließen, dass mit dem verwendeten PromotorScan-Algorithmus Transkriptionsfaktorbindungsstellen, die bisher nicht bekannt sind, nicht übersehen wurden, wurden die Häufigkeit sämtlicher möglicher 8 bp (48) und 10 bp (410) Nukleotid-Kombinationen in diesen Promotoren untersucht. Biologisch relevante Unterschiede fanden sich zwischen den beiden Gruppen nicht. In gleicher Weise wurde auch die Bedeutung von TATA-Boxen untersucht. TATA-Boxen kommt bei der Transkriptionsinitiierung eine wichtige Rolle zu, indem über sie die Bindung des initialen Transkriptionskomplexes vermittelt wird. Insgesamt 1033 TATA-Boxen wurden ebenfalls mittels PromotorScan vorausgesagt. Dabei waren 57 auf Promotoren von Genen, die in der Leber überexprimiert waren und 976 auf Promotoren von Genen, die in anderen Geweben überexprimiert waren. Der Vergleich dieser beiden Gruppen ließ keine signifikant unterschiedliche Häufigkeit an TATA-Boxen erkennen. Im weiteren wurde die Bedeutung von CpG-Islands für eine potentiell differentielle Regulation untersucht. Insgesamt wurden 8742 CpG-Islands in einem Bereich von bis zu 5 kb upstream des Transkriptionsstarts identifiziert, 364 davon auf Promotoren von Genen, die am höchsten in der Leber exprimiert waren, 8378 auf Promotoren von Genen, die in anderen Geweben am höchsten exprimiert waren. Signifikante Unterschiede in der Verteilung von CpG-Islands auf Promotoren dieser beiden Gengruppen ließen sich nicht nachweisen. Schließlich wurden die RNA- und Proteinsequenzen des Transkriptoms und Proteoms hinsichtlich ihrer Zusammensetzung aus einzelnen Nukleotiden bzw. Aminosäuren analysiert. Auch hierbei fanden sich keine signifikanten Unterschiede in der Verteilung zwischen beiden Gengruppen. Die Zusammenschau der Ergebnisse zeigt, dass die Regulation der einzelnen Gene im Lebergewebe im wesentlichen individuell erfolgt. Im Rahmen der vorgelegten bioinformatischen Analysen fanden sich keine übergeordneten genetischen „Leberfaktoren“, die speziell eine Expression von Genen in der Leber stimulieren. Neue therapeutische Ansätze, die auf eine Regulation der Genexpression in der Leber zielen, werden somit auch weiterhin auf die Beeinflussung individueller Gene fokussiert bleiben.

Der Carrier DcuB als zweiter Sensor des Zweikomponentensystems DcuSR in Escherichia coli

Escherichia coli kann C4-Dicarboxylate und andere Carbonsäuren als Substrate für den aeroben und anaeroben Stoffwechsel nutzen. Die Anwesenheit von C4-Dicarboxylaten im Außenmedium wird über das Zweikomponentensystem DcuSR, bestehend aus der membranständigen Sensorkinase DcuS und dem cytoplasmatischen Responseregulator DcuR, erkannt. Die Bindung von C4-Dicarboxylaten an die periplasmatische Domäne von DcuS führt zu einer Induktion der Zielgene. Hierzu zählen die Gene für den anaeroben Fumarat/Succinat-Antiporter DcuB (dcuB), die anaerobe Fumarase (fumB) und die Fumaratreduktase (frdABCD). Unter aeroben Bedingungen stimuliert DcuSR die Expression des dctA Gens, das für den aeroben C4-Dicarboxylat-Carrier DctA kodiert. Für den Carrier DcuB konnte eine regulatorische Funktion bei der Expression der DcuSR-regulierten Gene gezeigt werden. Die Inaktivierung des dcuB Gens führte bereits ohne Fumarat zu einer maximalen Expression einer dcuB´-´lacZ Reportergenfusion und anderer DcuSR-abhängiger Gene. Diese Stimulierung erfolgte nur in einem dcuS-positiven Hintergrund. DcuB unterscheidet sich damit von den alternativen Carriern DcuA und DcuC, die diesen Effekt nicht zeigten. Mithilfe ungerichteter Mutagenese wurden DcuB-Punktmutanten hergestellt (Thr394Ile und Asp398Asn), die eine Geninduktion verursachten, aber eine intakte Transportfunktion besaßen. Dies zeigt, dass der regulatorische Effekt von DcuB unabhängig von dessen Transportfunktion ist. Durch gerichtete Mutagenese wurde die Funktion einer Punktmutation (Thr394) näher charakterisiert. Es werden zwei Modelle zur Membrantopologie von DcuB und der Lage der Punktmutationen im Protein vorgestellt. Da DcuB seine regulatorische Funktion über eine Interaktion mit DcuS vermitteln könnte, wurden mögliche Wechselwirkungen zwischen DcuB und DcuS als auch DcuR mithilfe von Two-Hybrid-Systemen untersucht. Für biochemische Untersuchungen von DcuB wurde außerdem die Expression des Proteins in vivo und in vitro versucht. Unter aeroben Bedingungen beeinflusst der C4-Dicarboxylat-Carrier DctA die Expression der DcuSR-abhängigen Gene. Eine Mutation des dctA Gens bewirkte eine stärkere Expression einer dctA´-´lacZ Reportergenfusion im Vergleich zum Wildtyp. Diese Expression nahm in einem dcuS-negativen Hintergrund ab, die Succinat-abhängige Induktion blieb jedoch erhalten. Unter anaeroben Bedingungen kann das dctA Gen auch durch Inaktivierung von DcuB induziert werden. Es wird ein Modell vorgestellt, das die Beteiligung beider Carrier an der DcuSR-abhängigen Regulation erklärt.

In vivo- und in vitro-Untersuchungen zur Immunantwort und Parasitenentwicklung bei Infektionen mit dem Darmparasiten Cryptosporidium parvum

Cryptosporidium parvum ist ein intrazellulärer protozoischer Darmparasit (Apikomplexa), der weltweit zu den bedeutendsten Erregern von Diarrhöen beim Menschen und einer Reihe von Nutztieren zählt. Vor allem immunkompromittierte Personen wie zum Beispiel AIDS-Patienten erleiden schwere, chronische bis lebensbedrohende Erkrankungen. Da nach wie vor keine effektive Therapie gegen eine Kryptosporidiose in Form eines spezifisch wirkenden Chemotherapeutikums oder einer Vakzine existiert, ist es notwendig, die Immunantwort des Wirtes gegen den Parasiten und dessen Bindung, Invasion und die intrazelluläre Entwicklung in den Epithelzellen eingehend zu studieren, um neue Ansatzpunkte zu entwickeln. Wohingegen Menschen zeitlebens suszeptibel für eine Infektion mit C. parvum sind, entwickeln Mäuse eine natürliche Resistenz und können als adulte Tiere nicht mehr infiziert werden. Daher sind Mausmodelle der Kryptosporidiose auf neonatale oder immunsupprimierte und immundefiziente adulte Mäuse beschränkt. Bei der Überwindung einer C. parvum-Infektion sind Effektoren der natürlichen und adaptiven Immunität beteiligt. Die zentrale Rolle spielen CD4+-T-Zellen, sowie Interferon-gamma und Interleukin-12. Im Rahmen dieser Arbeit wurden Infektionen in IFN-gamma (GKO)- und IL-12 p40 (IL12KO)-Knockout-Mäusen (C57BL/6) etabliert, für die bereits gezeigt wurde, dass sie eine Suszeptibilität gegenüber einer Erstinfektion besitzen. Erstmals wurden die beiden Infektionsmodelle parallel unter denselben Bedingungen analysiert, um Rückschlüsse auf die Funktion und die Bedeutung der beiden Th1-Zytokine IFN-gamma und IL-12 bei der Auseinandersetzung mit dem Parasiten und der Überwindung einer Infektion ziehen zu können. Es wurden deutliche Unterschiede im Infektionsverlauf, bei der Höhe und Dauer der Parasitenausscheidung und der induzierten systemischen und mukosalen Antikörperantwort beobachtet. Zum ersten Mal konnte gezeigt werden, dass neben IL12KO auch GKO in der Lage sind, eine erste Infektion zu überwinden und eine Resistenz gegenüber einer erneuten Konfrontation mit dem Parasiten zu entwickeln. Alle Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Etablierung einer protektiven Immunität gegen eine Kryptosporidiose generell unabhängig von der Anwesenheit der Zytokine IFN-gamma und IL-12 ist, der Verlust von IFN-gamma jedoch schwerer wiegt. Bei GKO-Mäusen persistierte der Parasit in Form einer niedriggradigen chronischen Infektion. Die beiden Infektionsmodelle stellten sich als ideales System für die Etablierung einer effektiven Immunisierungsstrategie heraus. Intranasale Immunisierungen, welche neben einer systemischen auch eine mukosale Immunantwort induzieren können, schienen einen richtigen Ansatz darzustellen. Intraperitoneale und subkutane Immunisierungen führten zwar zur Ausbildung einer starken spezifischen IgG-Antwort im Serum, diese war jedoch nicht in der Lage, einen Schutz vor einer Infektion zu vermitteln. Neben den in vivo Untersuchungen wurde des Weiteren auch die intrazelluläre Entwicklung von C. parvum in einem in vitro Kultursystem verfolgt. Zum ersten Mal wurde die Genexpression von vier Oberflächenproteinen der invasiven Zoitenstadien und eines Oozystenwandproteins parallel durch RT-PCR analysiert. Es konnte gezeigt werden, dass alle untersuchten Gene während der intrazellulären Entwicklung differentiell exprimiert werden, was eine unterschiedliche Funktion der Proteine während des Entwicklungszyklus nahe legt. Das Expressionsmuster der verschiedenen Gene charakterisiert bestimmte Abschnitte innerhalb des Entwicklungszyklus. Dabei wurden Marker für die Invasion (CP17) sowie für die asexuelle (GP900) und sexuelle Replikation (COWP) identifiziert.

Funktion des Rezeptors der sekretorischen Phospholipasen A 2 bei der Signaltransduktion in glomerulären Mesangiumzellen und entzündlichen Erkrankungen der Niere

Die sekretorischen Phospholipasen A2 (sPLA2) sind Enzyme, welche die Hydrolyse der Esterbindung an der sn-2-Position von Phospholipiden katalysieren, wodurch freie Fettsäuren, welche als Vorläufermolekül von Eicosanoiden dienen, freiwerden. Außerdem wurde gezeigt, dass sPLA2s auch unabhängig von ihrer katalytischen Aktivität durch die Bindung an einen spezifischen sPLA2-M-Typ-Rezeptor (MTR) intrazelluläre Signalwege, wie z.B. die Induktion von proinflammatorischen Genen, aktivieren können. Deshalb wurden in dieser Arbeit weiterführende Studien zur Aufklärung der Lokalisation und der Signaltransduktion der sPLA2s sowie die Bedeutung des MTR durchgeführt. Als Zellmodell für in-vitro-Studien wurden glomeruläre Mesangiumzellen verwendet, da diese Zellen eine zentrale Rolle bei entzündlichen Nierenerkrankungen, wie z.B. der Glomerulonephritis spielen. Durch Isolierung von Mesangiumzellen aus MTR-knockout-Mäusen (C57BL/6) sollten potentielle Unterschiede in der MTR-vermittelten Signaltransduktion im Vergleich zu Mesangiumzellen isoliert aus (C57BL/6) Wildtyp-Mäusen herausgearbeitet werden. Die Untersuchungen dieser Arbeit zeigen, dass verschiedene sPLA2-Enzyme in Maus-Mesangiumzellen exprimiert werden und diese an der konstitutiven Biosynthese von Prostaglandinen beteiligt sind. Der spezifische M-Typ-Rezeptor wird in diesen Zellen im Gegensatz zu Ratten-Mesangiumzellen weder unter physiologischen noch unter proinflammatorischen Bedingungen exprimiert und spielt daher vermutlich keine Rolle bei der Signaltransduktion durch sPLA2s.

Bedeutung und Regulation von Apolipoprotein J in atherosklerotischen Läsionen

Apolipoprotein J (ApoJ) ist ein heterodimeres sekretiertes Glycoprotein, welchem sowohl antiapoptotische als auch antiinflammatorische Eigenschaften zugeschrieben werden. Es wird unter vielen pathophysiologischen Zuständen verstärkt exprimiert. Dazu zählen viele Krankheiten wie z.B. Krebs, M. Alzheimer, Creuzfeldt Jakob und Atherosklerose. Die vorliegende Arbeit befasst sich zum Einen mit der Funktion von ApoJ bei Atherosklerose und zum Anderen mit der Regulation von ApoJ durch in atherosklerotischen Läsionen vorkommende Bestandteile. Für die Untersuchungen der Funktion von ApoJ bei der Atherosklerose wurde die „Mainzer Hypothese“ zugrunde gelegt, die davon ausgeht, dass enzymatisch verdautes LDL (high density lipoprotein) (E-LDL) ursächlich für die Entstehung von atherosklerotischen Läsionen ist. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass ApoJ zwar an E-LDL bindet, nicht aber an natives LDL und dass durch diese Bindung die zytotoxische Wirkung von E-LDL auf glatte Muskelzellen der Ratte unterdrückt wird. Mittels Annexinfärbung und Caspase-Messung konnte gezeigt werden, dass ApoJ in diesem Fall eine antiapoptotische Funktion aufweist. Durch immunhistochemische Untersuchungen an humanen Gewebsschnitten aus frühen atherosklerotischen Läsionen konnte eine Kolokalisation von ApoJ und E-LDL nachgewiesen werden. Diese Ergebnisse unterstreichen die Mainzer Hypothese. Durch eine Behandlung von glatten Muskelzellen der Ratte mit den Lipoproteinen LDL/E-LDL und nekrotischen Zellen sollte die Regulation von ApoJ durch in atherosklerotischen Läsionen vorhandenen Stimuli untersucht werden. Frühere Arbeiten unserer Arbeitsgruppe konnten bereits zeigen, dass eine Behandlung mit nekrotischen Zellen zu einer vermehrten Expression der ApoJ-mRNA führt und dass diese Regulation in Korrelation mit der Expression von Toll-like Rezeptoren (TLR) der verschiedenen Zellen steht. In dieser Arbeit konnte RNA aus nekrotischen Zellen als ApoJ-induzierende Komponente identifiziert werden. Durch Inhibition der TLR3-Signalwege konnten erste Hinweise darüber gewonnen werden, über welche Signaltransduktionswege die ApoJ Regulation erfolgt. Eine Behandlung der Zellen mit E LDL und LDL hingegen führte zu einer Repression der ApoJ-Sekretion. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass in atherosklerotischen Läsionen sowohl ApoJ induzierende wie auch repremierende Stimuli vorhanden sind.

Computational modeling of surface interactions

Die Wechselwirkung zwischen Proteinen und anorganischen Oberflächen fasziniert sowohl aus angewandter als auch theoretischer Sicht. Sie ist ein wichtiger Aspekt in vielen Anwendungen, unter anderem in chirugischen Implantaten oder Biosensoren. Sie ist außerdem ein Beispiel für theoretische Fragestellungen betreffend die Grenzfläche zwischen harter und weicher Materie. Fest steht, dass Kenntnis der beteiligten Mechanismen erforderlich ist um die Wechselwirkung zwischen Proteinen und Oberflächen zu verstehen, vorherzusagen und zu optimieren. Aktuelle Fortschritte im experimentellen Forschungsbereich ermöglichen die Untersuchung der direkten Peptid-Metall-Bindung. Dadurch ist die Erforschung der theoretischen Grundlagen weiter ins Blickfeld aktueller Forschung gerückt. Eine Möglichkeit die Wechselwirkung zwischen Proteinen und anorganischen Oberflächen zu erforschen ist durch Computersimulationen. Obwohl Simulationen von Metalloberflächen oder Proteinen als Einzelsysteme schon länger verbreitet sind, bringt die Simulation einer Kombination beider Systeme neue Schwierigkeiten mit sich. Diese zu überwinden erfordert ein Mehrskalen-Verfahren: Während Proteine als biologische Systeme ausreichend mit klassischer Molekulardynamik beschrieben werden können, bedarf die Beschreibung delokalisierter Elektronen metallischer Systeme eine quantenmechanische Formulierung. Die wichtigste Voraussetzung eines Mehrskalen-Verfahrens ist eine Übereinstimmung der Simulationen auf den verschiedenen Skalen. In dieser Arbeit wird dies durch die Verknüpfung von Simulationen alternierender Skalen erreicht. Diese Arbeit beginnt mit der Untersuchung der Thermodynamik der Benzol-Hydratation mittels klassischer Molekulardynamik. Dann wird die Wechselwirkung zwischen Wasser und den [111]-Metalloberflächen von Gold und Nickel mittels eines Multiskalen-Verfahrens modelliert. In einem weiteren Schritt wird die Adsorbtion des Benzols an Metalloberflächen in wässriger Umgebung studiert. Abschließend wird die Modellierung erweitert und auch die Aminosäuren Alanin und Phenylalanin einbezogen. Dies eröffnet die Möglichkeit realistische Protein- Metall-Systeme in Computersimulationen zu betrachten und auf theoretischer Basis die Wechselwirkung zwischen Peptiden und Oberflächen für jede Art Peptide und Oberfläche vorauszusagen.

Untersuchungen zur Induktion von Filopodien durch das Amyloid Precursor Like Protein 1 (APLP1), ein Mitglied der APP-Genfamilie

Die Alzheimer Krankheit ist eine fortschreitendende Demenzerkrankung von der in Deutschland ca. 1,6 Millionen Menschen betroffen sind. Im Gehirn der Patienten finden sich sogenannte amyloide Plaques, deren Hauptbestandteil das Aβ-Protein ist. Dieses Peptid ist ein Spaltprodukt des APP-Proteins (engl. amyloid precursor protein). APP ist das namensgebende Mitglied der APP-Proteinfamilie zu der neben APP die beiden APP-Homologen APLP1 und APLP2 (engl. amyloid precursor like protein) gehören. Obwohl inzwischen über die pathologische Rolle dieser Proteinfamilie bei der Alzheimer Krankheit vieles bekannt ist, bleiben die physiologischen Funktionen dieser Proteine bisher größtenteils ungeklärt. Die vorliegende Arbeit beschreibt erstmals einen APLP1-spezifischen Effekt auf die Ausbildung von Filopodien. Sowohl das humane als auch das murine APLP1 induzierten nach transienter Überexpression die Bildung zahlreicher filopodialer Fortsätze auf der Membran von PC12-Zellen. Vergleichbare Resultate konnten mit beiden APLP1-Proteinen auch auf der Membran von embryonalen (E18.5), cortikalen Neuronen der Ratte gezeigt werden. Dass APLP1 einen derartigen Effekt auf Neuronen und PC12-Zellen zeigt, begründet die Annahme, dass APLP1 in vivo eine Funktion bei der Entwicklung und Differenzierung von Neuronen übernimmt. Anhand von Versuchen mit deletierten APLP1-Proteinen und APLP1/APLP2-Chimärproteinen konnte gezeigt werden, dass die von Exon 5 und Exon 6 codierten Bereiche des APLP1 für die Induktion der Filopodien essentiell sind. Unter Einbeziehung von in ihrer räumlichen Struktur bereits bekannten Domänen und aufgrund von Homologievergleichen der primären Aminosäuresequenz dieser Region mit entsprechenden Bereichen der APP- bzw. APLP2-Proteine wurde die wahrscheinliche Lage der Filopodien-induzierenden Domäne innerhalb des von Exon 6 codierten Bereiches diskutiert. Es konnte ferner gezeigt werden, dass die untersuchte Induktion von Filopodien durch die sogenannte α-Sekretierung moduliert werden kann. Unter den gewählten Versuchsbedingungen war nur membranständiges APLP1, nicht aber sekretiertes APLP1 in der Lage, Filopodien zu induzieren. Abschliessend wurden Ergebnisse gezeigt, die erste Einblicke in Signalkaskaden erlauben, die von APLP1 angesteuert werden und so die Enstehung der Filopodien auslösen. Bezüglich des primären Prozesses der Signalkaskade, der Bindung von APLP1 an einen bisher unbekannten Rezeptor, wurde die Möglichkeit diskutiert, ob APP oder APLP2 oder sogar APLP1 selbst als Rezeptor fungieren könnten. Die beobachteten Prozesse nach Überexpression von APLP1 entsprechen vermutlich einer physiologischen Funktion bei der Differenzierung von Neuronen, die mit der Interaktion einer extrazellulär gelegenen Domäne mit einem Rezeptor beginnt, die Aktivierung einer Signalkaskade zur Akrinreorganisation zu Folge hat und die Entstehung filopodialer Strukturen auslöst.

Differential cell type-specific transcriptional regulation of the CYP1A1 gene

Cytochrome P450 1A1 (CYP1A1) monooxygenase plays an important role in the metabolism of environmental pollutants such as polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) and halogenated polycyclic aromatic hydrocarbons (HAHs). Oxidation of these compounds converts them to the metabolites that subsequently can be conjugated to hydrophilic endogenous entities e.g. glutathione. Derivates generated in this way are water soluble and can be excreted in bile or urine, which is a defense mechanism. Besides detoxification, metabolism by CYP1A1 may lead to deleterious effects since the highly reactive intermediate metabolites are able to react with DNA and thus cause mutagenic effects, as it is in the case of benzo(a) pyrene (B[a]P). CYP1A1 is normally not expressed or expressed at a very low level in the cells but it is inducible by many PAHs and HAHs e.g. by B[a]P or 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin (TCDD). Transcriptional activation of the CYP1A1 gene is mediated by aryl hydrocarbon receptor (AHR), a basic-helix-loop-helix (bHLH) transcription factor. In the absence of a ligand AHR stays predominantly in the cytoplasm. Ligand binding causes translocation of AHR to the nuclear compartment, its heterodimerization with another bHLH protein, the aryl hydrocarbon nuclear translocator (ARNT) and binding of the AHR/ARNT heterodimer to a DNA motif designated dioxin responsive element (DRE). This process leads to the transcriptional activation of the responsive genes containing DREs in their regulatory regions, e.g. that coding for CYP1A1. TCDD is the most potent known agonist of AHR. Since it is not metabolized by the activated enzymes, exposure to this compound leads to a persisting activation of AHR resulting in diverse toxic effects in the organism. To enlighten the molecular mechanisms that mediate the toxicity of xenobiotics like TCDD and related compounds, the AHR-dependent regulation of the CYP1A1 gene was investigated in two cell lines: human cervix carcinoma (HeLa) and mouse hepatoma (Hepa). Study of AHR activation and its consequence concerning expression of the CYP1A1 enzyme confirmed the TCDD-dependent formation of the AHR/ARNT complex on DRE leading to an increase of the CYP1A1 transcription in Hepa cells. In contrast, in HeLa cells formation of the AHR/ARNT heterodimer and binding of a protein complex containing AHR and ARNT to DRE occurred naturally in the absence of TCDD. Moreover, treatment with TCDD did not affect the AHR/ARNT dimer formation and binding of these proteins to DRE in these cells. Even though the constitutive complex on DRE exists in HeLa, transcription of the CYP1A1 gene was not increased. Furthermore, the CYP1A1 level in HeLa cells remained unchanged in the presence of TCDD suggesting repressional mechanism of the AHR complex function which may hinder the TCDD-dependent mechanisms in these cells. Similar to the native, the mouse CYP1A1-driven reporter constructs containing different regulatory elements were not inducible by TCDD in HeLa cells, which supported a presence of cell type specific trans-acting factor in HeLa cells able to repress both the native CYP1A1 and CYP1A1-driven reporter genes rather than species specific differences between CYP1A1 genes of human and rodent origin. The different regulation of the AHR-mediated transcription of CYP1A1 gene in Hepa and HeLa cells was further explored in order to elucidate two aspects of the AHR function: (I) mechanism involved in the activation of AHR in the absence of exogenous ligand and (II) factor that repress function of the exogenous ligand-independent AHR/ARNT complex. Since preliminary studies revealed that the activation of PKA causes an activation of AHR in Hepa cells in the absence of TCDD, the PKA-dependent signalling pathway was the proposed endogenous mechanism leading to the TCDD-independent activation of AHR in HeLa cells. Activation of PKA by forskolin or db-cAMP as well as inhibition of the kinase by H89 in both HeLa and Hepa cells did not lead to alterations in the AHR interaction with ARNT in the absence of TCDD and had no effect on binding of these proteins to DRE. Moreover, the modulators of PKA did not influence the CYP1A1 activity in these cells in the presence and in the absence of TCDD. Thus, an involvement of PKA in the regulation of the CYP1A1 Gen in HeLa cells was not evaluated in the course of this study. Repression of genes by transcription factors bound to their responsive elements in the absence of ligands has been described for nuclear receptors. These receptors interact with protein complex containing histone deacetylase (HDAC), enzyme responsible for the repressional effect. Thus, a participation of histone deacetylase in the transcriptional modulation of CYP1A1 gene by the constitutively DNA-bound AHR/ARNT complex was supposed. Inhibition of the HDAC activity by trichostatin A (TSA) or sodium butyrate (NaBu) led to an increase of the CYP1A1 transcription in the presence but not in the absence of TCDD in Hepa and HeLa cells. Since amount of the AHR and ARNT proteins remained unchanged upon treatment of the cells with TSA or NaBu, the transcriptional upregulation of CYP1A1 gene was not due to an increased expression of the regulatory proteins. These findings strongly suggest an involvement of HDAC in the repression of the CYP1A1 gene. Similar to the native human CYP1A1 also the mouse CYP1A1-driven reporter gene transfected into HeLa cells was repressed by histone deacetylase since the presence of TSA or NaBu led to an increase in the reporter activity. Induction of reporter gene did not require a presence of the promoter or negative regulatory regions of the CYP1A1 gene. A promoter-distal fragment containing three DREs together with surrounding sequences was sufficient to mediate the effects of the HDAC inhibitors suggesting that the AHR/ARNT binding to its specific DNA recognition site may be important for the CYP1A1 repression. Histone deacetylase is recruited to the specific genes by corepressors, proteins that bind to the transcription factors and interact with other members of the HDAC complex. Western blot analyses revealed a presence of HDAC1 and the corepressors mSin3A (mammalian homolog of yeast Sin3) and SMRT (silencing mediator for retinoid and thyroid hormone receptor) in both cell types, while the corepressor NCoR (nuclear receptor corepressor) was expressed exclusively in HeLa cells. Thus the high inducibility of CYP1A1 in Hepa cells may be due to the absence of NCoR in these cells in contrast to the non-responsive HeLa cells, where the presence of NCoR would support repression of the gene by histone deacetylase. This hypothesis was verified in reporter gene experiments where expression constructs coding for the particular members of the HDAC complex were cotransfected in Hepa cells together with the TCDD-inducible reporter constructs containing the CYP1A1 regulatory sequences. An overexpression of NCoR however did not decrease but instead led to a slight increase of the reporter gene activity in the cells. The expected inhibition was observed solely in the case of SMRT that slightly reduced constitutive and TCDD-induced reporter gene activity. A simultaneous expression of NCoR and SMRT shown no further effects and coexpression of HDAC1 with the two corepressors did not alter this situation. Thus, additional factors that are likely involved in the repression of CYP1A1 gene by HDAC complex remained to be identified. Taking together, characterisation of an exogenous ligand independent AHR/ARNT complex on DRE in HeLa cells that repress transcription of the CYP1A1 gene creates a model system enabling investigation of endogenous processes involved in the regulation of AHR function. This study implicates HDAC-mediated repression of CYP1A1 gene that contributes to the xenobiotic-induced expression in a tissue specific manner. Elucidation of these processes gains an insight into mechanisms leading to deleterious effects of TCDD and related compounds.

Charakterisierung zentraler Enzyme des Ajmalin-Biosynthesewegs aus Rauvolfia serpentina

In der vorliegenden Arbeit werden verschiedene Enzyme des Ajmalin-Biosynthesewegs aus der Arzneipflanze Rauvolfia serpentina charakterisiert. Dabei handelt es sich einerseits um die Vomilenin-Reduktase und die 2β-(R)-1.2-Dihydrovomilenin-Reduktase. Es wurden Versuche unternommen, diese Enzyme heterolog zu exprimieren. Eine aktive Expression konnte nicht durchgeführt werden, was mit großer Wahrscheinlichkeit auf Modifikationen in der Ursprungspflanze zurückzuführen ist. Allerdings bestehen auch Zweifel, ob es sich bei den Volllängenklonen um die cDNAs der Reduktasen handelte. Zum anderen sollte eine Strukturaufklärung der Vinorin-Synthase im Komplex mit Liganden vorgenommen werden. Die erhaltenen Proteinkristalle stellten sich als derart empfindlich gegenüber Schwankungen ihrer Umgebung und dem Eindringen von Liganden in den Kristall dar, dass eine erfolgreiche Komplexierung und strukturelle Beschreibung durch Röntgenstrukturanalyse nicht möglich war. Weiterhin wurden Mutagenesestudien mit der Vinorin-Synthase durchgeführt. Eine Asparaginsäure bildet eine Salzbrücke mit einem Arginin. Alle durchgeführten Mutationen dieser Asparaginsäure führten zu einem absoluten Aktivitätsverlust. Eine Funktion des Asparagins 277, als mitverantwortliche Aminosäure zur Bindung des Co-Substrats Acetyl-CoA, konnte anhand der Mutagenesestudien ausgeschlossen werden. Weiterhin ist es erstmals gelungen die Polyneuridinaldehyd-Esterase aus Rauvolfia serpentina zu kristallisieren. Schließlich konnte die dreidimensionale Struktur der Polyneuridinaldehyd-Esterase aufgeklärt werden. Es folgte eine Beschreibung struktureller Eigenschaften der Polyneuridinaldehyd-Esterase im Vergleich zu einem Modell, welches durch ein „Molecular Modelling“ erstellt wurde.

Design, Synthese und biochemische/biologische Evaluierung bioisosterer Oligopyrrolcarboxamide mit aliphatisch-amidisch verknüpften DNA-Interkalatoren

Die DNA stellt aufgrund der genetischen Krankheitsursache nach wie vor ein überaus attraktives Target für das Design antitumoraktiver Zytostatika dar. Ein wesentlicher Schwerpunkt der heutigen Forschung besteht vor allem in der Entwicklung niedermolekularer, sequenzspezifischer DNA-Liganden zur gezielten Ausschaltung defekter Gene. Im Rahmen dieser Arbeit erfolgte daher in Anlehnung an die antitumoral wirksame Leitsubstanz Netropsin - ein AT-selektiver Minor Groove Binder mit Bispyrrolcarboxamid-Grundstruktur - erstmals der systematische Aufbau einer neuen Serie bioisosterer Hybridmoleküle, bestehend aus einem interkalierenden Strukturelement (Acridon, Naphthalimid, 5-Nitronaphthalimid, Anthrachinon, 11H-Pyrido[2,3-a]carbazol) und Thiophenpyrrol-, Imidazolpyrrol-, Thiazolpyrrol- bzw. Bisimidazolcarboxamid als rinnenbindende Oligoamid-Einheit (sog. Combilexine). Die chromophoren Systeme am N-Terminus wurden hierbei über aliphatische Linker variabler Kettenlänge mit der Carboxamid-Kette verknüpft. Als C-terminale Funktion kam sowohl die N,N-Dimethyl-1,3-diaminopropan- als auch die um ein C-Atom kürzere Dimethylaminoethylamin-Seitenkette zum Einsatz. Unter Verwendung modernster Reagenzien aus der Peptidkupplungschemie ist es gelungen, ein präparativ gut zugängliches, reproduzierbares Verfahren zur Synthese dieser bioisosteren Combilexine zu entwickeln. Anhand biophysikalischer/biochemischer, zellbiologischer und physikochemischer (1H-NMR-spektroskopischer und röntgenstrukturanalytischer) Methoden sowie Molecular Modelling Studien wurden erstmals bezüglich der DNA-Bindung, der Topoisomerase-Hemmung und der Antitumor-Zellzytotoxizität in einem breiten Rahmen vororientierende Struktur-Wirkungsbeziehungen an bioisosteren Liganden erstellt. Wenngleich zwischen den in vitro und in silico ermittelten Befunden keine konkreten Gesetzmäßigkeiten zu erkennen waren, so ließ die Summation der Ergebnisse dennoch darauf schließen, dass es sich bei den Naphthalimidpropion- und Acridonbuttersäure-Derivaten mit C-terminaler Propylendiamin-Funktion um die aussichtsreichsten Kandidaten in Bezug auf die DNA-Affinität bzw. Zytotoxizität handelte.