In vivo- und in vitro-Untersuchungen zur Immunantwort und Parasitenentwicklung bei Infektionen mit dem Darmparasiten Cryptosporidium parvum

Cryptosporidium parvum ist ein intrazellulärer protozoischer Darmparasit (Apikomplexa), der weltweit zu den bedeutendsten Erregern von Diarrhöen beim Menschen und einer Reihe von Nutztieren zählt. Vor allem immunkompromittierte Personen wie zum Beispiel AIDS-Patienten erleiden schwere, chronische bis lebensbedrohende Erkrankungen. Da nach wie vor keine effektive Therapie gegen eine Kryptosporidiose in Form eines spezifisch wirkenden Chemotherapeutikums oder einer Vakzine existiert, ist es notwendig, die Immunantwort des Wirtes gegen den Parasiten und dessen Bindung, Invasion und die intrazelluläre Entwicklung in den Epithelzellen eingehend zu studieren, um neue Ansatzpunkte zu entwickeln. Wohingegen Menschen zeitlebens suszeptibel für eine Infektion mit C. parvum sind, entwickeln Mäuse eine natürliche Resistenz und können als adulte Tiere nicht mehr infiziert werden. Daher sind Mausmodelle der Kryptosporidiose auf neonatale oder immunsupprimierte und immundefiziente adulte Mäuse beschränkt. Bei der Überwindung einer C. parvum-Infektion sind Effektoren der natürlichen und adaptiven Immunität beteiligt. Die zentrale Rolle spielen CD4+-T-Zellen, sowie Interferon-gamma und Interleukin-12. Im Rahmen dieser Arbeit wurden Infektionen in IFN-gamma (GKO)- und IL-12 p40 (IL12KO)-Knockout-Mäusen (C57BL/6) etabliert, für die bereits gezeigt wurde, dass sie eine Suszeptibilität gegenüber einer Erstinfektion besitzen. Erstmals wurden die beiden Infektionsmodelle parallel unter denselben Bedingungen analysiert, um Rückschlüsse auf die Funktion und die Bedeutung der beiden Th1-Zytokine IFN-gamma und IL-12 bei der Auseinandersetzung mit dem Parasiten und der Überwindung einer Infektion ziehen zu können. Es wurden deutliche Unterschiede im Infektionsverlauf, bei der Höhe und Dauer der Parasitenausscheidung und der induzierten systemischen und mukosalen Antikörperantwort beobachtet. Zum ersten Mal konnte gezeigt werden, dass neben IL12KO auch GKO in der Lage sind, eine erste Infektion zu überwinden und eine Resistenz gegenüber einer erneuten Konfrontation mit dem Parasiten zu entwickeln. Alle Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Etablierung einer protektiven Immunität gegen eine Kryptosporidiose generell unabhängig von der Anwesenheit der Zytokine IFN-gamma und IL-12 ist, der Verlust von IFN-gamma jedoch schwerer wiegt. Bei GKO-Mäusen persistierte der Parasit in Form einer niedriggradigen chronischen Infektion. Die beiden Infektionsmodelle stellten sich als ideales System für die Etablierung einer effektiven Immunisierungsstrategie heraus. Intranasale Immunisierungen, welche neben einer systemischen auch eine mukosale Immunantwort induzieren können, schienen einen richtigen Ansatz darzustellen. Intraperitoneale und subkutane Immunisierungen führten zwar zur Ausbildung einer starken spezifischen IgG-Antwort im Serum, diese war jedoch nicht in der Lage, einen Schutz vor einer Infektion zu vermitteln. Neben den in vivo Untersuchungen wurde des Weiteren auch die intrazelluläre Entwicklung von C. parvum in einem in vitro Kultursystem verfolgt. Zum ersten Mal wurde die Genexpression von vier Oberflächenproteinen der invasiven Zoitenstadien und eines Oozystenwandproteins parallel durch RT-PCR analysiert. Es konnte gezeigt werden, dass alle untersuchten Gene während der intrazellulären Entwicklung differentiell exprimiert werden, was eine unterschiedliche Funktion der Proteine während des Entwicklungszyklus nahe legt. Das Expressionsmuster der verschiedenen Gene charakterisiert bestimmte Abschnitte innerhalb des Entwicklungszyklus. Dabei wurden Marker für die Invasion (CP17) sowie für die asexuelle (GP900) und sexuelle Replikation (COWP) identifiziert.

Cryptosporidium parvum is an enteric intracellular protozoan parasite (Apicomplexa) and a major cause of diarrhea in humans and a wide range of livestock worldwide. Infection can become severe, chronic and life-threatening mainly in immunocompromised persons such as patients with AIDS. Currently no effective chemotherapy or vaccine is available. Therefore it is necessary to study the immune response of the host as well as the attachment, invasion and intracellular development of the parasite more closely. Whereas humans are susceptible to infection with C. parvum throughout life, mice develop a natural resistance and cannot be infected as adults. Thus, mouse models for cryptosporidiosis are restricted to neonates or immunosuppressed and immunodeficient adult animals. In the resolution of and resistance to an infection both, innate and adaptive immunity are involved. CD4+ T-cells and the cytokines interferon-gamma and interleukin-12 are playing a central role. We have established infections in IFN-gamma (GKO) and IL-12 p40 (IL12KO) knockout mice (C57BL/6) which have been shown to be susceptible to infections with C. parvum. For the first time both infection models were analyzed in parallel under the same conditions to elucidate the function and relevance of the Th1-cytokines IFN-gamma and IL-12 during the immune response and resolution of an infection. Pronounced differences in the course of infection, the extent and duration of the parasite shedding and the induced systemic and mucosal antibody response were observed. For the first time it could be shown that besides IL12KO also GKO mice recover from infection and become resistant to reinfection. The results suggest that development of a protective immunity against cryptosporidiosis after primary infection is independent of the presence of IFN-gamma and IL-12; but loss of IFN-gamma is more profound. In GKO mice the parasite persists in terms of a low-level chronic infection. Both infection models turned out to be potential models for the development of an effective vaccination strategy. Intranasal immunizations, which can induce systemic and mucosal immune response, seemed to be an appropriate approach. Intraperitoneal and subcutaneous immunizations led to a strong parasite-specific IgG-response in the serum; however, no protection against an infection was mediated. In addition to the in vivo experiments the intracellular development of C. parvum was investigated in an in vitro culture system. For the first time the gene expression of four surface proteins of the invasive zoite stages and an oocyst wall protein was analyzed in parallel by reverse transcription PCR. The results showed that all examined genes are differentially expressed during the intracellular development, suggesting different functions of the proteins within the life cycle. The expression patterns of the different genes characterize certain sections of the life cycle. Thus, markers for the invasion (CP17) and the asexual (GP900) and sexual replication (COWP) had been identified.