The biopsychosocial processes in autism spectrum disorder

Abstract Background Autism is a disorder characterized by pervasive social and communicative impairments, repetitive and stereotyped behaviors and restricted interests. Its causes and effects have been researched from various neurocognitive theoretical perspectives and with the aid of neuroimaging technology. We aimed to describe biopsychosocial processes characteristic of the Autism Spectrum Disorders. Method Literature review using Medline and Scopus databases published between 2001 and 2011, with the keywords "autism", "theory of mind", "executive functions", "central coherence" and “fMRI”. Results The studies found were plotted and organized into tables and an explanatory diagram of the main findings was produced. Conclusions The most popular neurocognitive theories are still unable to fully explain the characteristics of the complications that autistic spectrum disorder causes to the quality of life of individuals living with autism. The association of clinical research and neuroimaging may contribute to a better understanding of the functioning of the brain affected by the disorder.

Dorsal periaqueductal gray stimulation facilitates anxiety-, but not panic-related, defensive responses in rats tested in the elevated T-maze

The escape response to electrical or chemical stimulation of the dorsal periaqueductal gray matter (DPAG) has been associated with panic attacks. In order to explore the validity of the DPAG stimulation model for the study of panic disorder, we determined if the aversive consequences of the electrical or chemical stimulation of this midbrain area can be detected subsequently in the elevated T-maze. This animal model, derived from the elevated plus-maze, permits the measurement in the same rat of a generalized anxiety- and a panic-related defensive response, i.e., inhibitory avoidance and escape, respectively. Facilitation of inhibitory avoidance, suggesting an anxiogenic effect, was detected in male Wistar rats (200-220 g) tested in the elevated T-maze 30 min after DPAG electrical stimulation (current generated by a sine-wave stimulator, frequency at 60 Hz) or after local microinjection of the GABA A receptor antagonist bicuculline (5 pmol). Previous electrical (5, 15, 30 min, or 24 h before testing) or chemical stimulation of this midbrain area did not affect escape performance in the elevated T-maze or locomotion in an open-field. No change in the two behavioral tasks measured by the elevated T-maze was observed after repetitive (3 trials) electrical stimulation of the DPAG. The results indicate that activation of the DPAG caused a short-lived, but selective, increase in defensive behaviors associated with generalized anxiety.

Phenotypical characterization and adhesin identification in Escherichia coli strains isolated from dogs with urinary tract infections

Pathogenic strains of Escherichia coli are the most common bacteria associated with urinary tract infections in both humans and companion animals. Standard biochemical tests may be useful in demonstrating detailed phenotypical characteristics of these strains. Thirteen strains of E. coli isolated from dogs with UTIs were submitted to biochemical tests, serotyping for O and H antigens and antimicrobial resistance testing. Furthermore, the presence of papC, sfa, and afa genes was evaluated by PCR, and genetic relationships were established using enterobacterial repetitive intergenic consensus PCR (ERIC-PCR). The antimicrobial that showed the highest resistance rate among the isolates was nalidixic acid (76.9%), followed by cephalotin (69.2%), sulfamethoxazole + trimethoprim (61.5%), tetracycline (61.5%), streptomycin (53.8%), ciprofloxacin (53.8%), ampicillin (46.2%), gentamicin (30.8%) and chloramphenicol (23.1%). No isolate was resistant either to meropenem or nitrofurantoin. Among the five clusters that were identified using ERIC-PCR, one cluster (A) had only one strain, which belonged to a serotype with zoonotic potential (O6:H31) and showed the genes papC+, sfa+, afa-. Strains with the genes papC-, sfa+, afa- were found in two other clusters (C and D), whereas all strains in clusters B and E possessed papC-, sfa-, afa- genes. Sucrose and raffinose phenotypic tests showed some ability in discriminating clusters A, B and C from clusters D and E.

Práctica aleatoria y aprendizaje deportivo-motor

[ES] Los efectos de la práctica es un asunto que posee una larga tradición investigadora en el ámbito del aprendizaje motor. En las últimas décadas el interés se ha centrado en analizar si una práctica aleatoria posee unos efectos más favorables que una práctica repetitiva en el aprendizaje. Este fue el objetivo de este estudio en el que participaron voluntariamente cuarenta y ocho estudiantes universitarios.

ParTec and KarnUMa-Digital tools as a help for freshman learning

[EN]Freshman students always present lower success rates than other levels of students. Digital systems is a course usually taught at first year studentsand its success rate is not very high. In this work we introduce three digital tools to improve freshman learning designed for easy use and one of them is a tool for mobile terminals that can be used as a game. The first tool is ParTec and is used to implement and test the partition technique. This technique is used to eliminate redundant states in finite state machines. This is a repetitive task that students do not like to perform. The second tool is called KarnUMa and is used for simplifying logic functions through Karnaugh Maps. Simplifying logical functions is a core task for this course and although students usually perform this task better than other tasks, it can still be improved. The third tool is a version of KarnUMa, designed for mobile devices. All the tools are available online for download and have been a helpful tool for students.

Genetica molecolare dell'autismo: studi di associazione ed analisi di geni candidati

Autism is a neurodevelpmental disorder characterized by impaired verbal communication, limited reciprocal social interaction, restricted interests and repetitive behaviours. Twin and family studies indicate a large genetic contribution to ASDs (Autism Spectrum Disorders). During my Ph.D. I have been involved in several projects in which I used different genetic approaches in order to identify susceptibility genes in autism on chromosomes 2, 7 and X: 1)High-density SNP association and CNV analysis of two Autism Susceptibility Loci. The International Molecular Genetic Study of Autism Consortium (IMGSAC) previously identified linkage loci on chromosomes 7 and 2, termed AUTS1 and AUTS5, respectively. In this study, we evaluated the patterns of linkage disequilibrium (LD) and the distribution of haplotype blocks, utilising data from the HapMap project, across the two strongest peaks of linkage on chromosome 2 and 7. More than 3000 SNPs have been selected in each locus in all known genes, as well as SNPs in non-genic highly conserved sequences. All markers have been genotyped to perform a high-density association analysis and to explore copy number variation within these regions. The study sample consisted of 127 and 126 multiplex families, showing linkage to the AUTS1 and AUTS5 regions, respectively, and 188 gender-matched controls. Association and CNV analysis implicated several new genes, including IMMP2L and DOCK4 on chromosome 7 and ZNF533 and NOSTRIN on the chromosome 2. Particularly, my contribution to this project focused on the characterization of the best candidate gene in each locus: On the AUTS5 locus I carried out a transcript study of ZNF533 in different human tissues to verify which isoforms and start exons were expressed. High transcript variability and a new exon, never described before, has been identified in this analysis. Furthermore, I selected 31 probands for the risk haplotype and performed a mutation screen of all known exons in order to identify novel coding variants associated to autism. On the AUTS1 locus a duplication was detected in one multiplex family that was transmitted from father to an affected son. This duplication interrupts two genes: IMMP2L and DOCK4 and warranted further analysis. Thus, I performed a screening of the cohort of IMGSAC collection (285 multiplex families), using a QMPSF assay (Quantitative Multiplex PCR of Short fluorescent Fragments) to analyse if CNVs in this genic region segregate with autism phenotype and compare their frequency with a sample of 475 UK controls. Evidence for a role of DOCK4 in autism susceptibility was supported by independent replication of association at rs2217262 and the finding of a deletion segregating in a sib-pair family. 2)Analysis of X chromosome inactivation. Skewed X chromosome inactivation (XCI) is observed in females carrying gene mutations involved in several X-linked syndromes. We aimed to estimate the role of X-linked genes in ASD susceptibility by ascertaining the XCI pattern in a sample of 543 informative mothers of children with ASD and in a sample of 164 affected girls. The study sample included families from different european consortia. I analysed the XCI inactivation pattern in a sample of italian mothers from singletons families with ASD and also a control groups (144 adult females and 40 young females). We observed no significant excess of skewed XCI in families with ASD. Interestingly, two mothers and one girl carrying known mutations in X-linked genes (NLGN3, ATRX, MECP2) showed highly skewed XCI, suggesting that ascertainment of XCI could reveal families with X-linked mutations. Linkage analysis was carried out in the subgroup of multiplex families with skewed XCI (≥80:20) and a modest increased allele sharing was obtained in the Xq27-Xq28 region, with a peak Z score of 1.75 close to rs719489. In this region FMR1 and MECP2 have been associated in some cases with austim and therefore represent candidates for the disorder. I performed a mutation screen of MECP2 in 33 unrelated probands from IMGSAC and italian families, showing XCI skewness. Recently, Xq28 duplications including MECP2, have been identified in families with MR, with asymptomatic carrier females showing extreme (>85%) skewing of XCI. For these reason I used the sample of probands from X-skewed families to perform CNV analysis by Real-time quantitative PCR. No duplications have been found in our sample. I have also confirmed all data using as alternative method the MLPA assay (Multiplex Ligation dependent Probe Amplification). 3)ASMT as functional candidate gene for autism. Recently, a possible involvement of the acetylserotonin O-methyltransferase (ASMT) gene in susceptibility to ASDs has been reported: mutation screening of the ASMT gene in 250 individuals from the PARIS collection revealed several rare variants with a likely functional role; Moreover, significant association was reported for two SNPs (rs4446909 and rs5989681) located in one of the two alternative promoters of the gene. To further investigate these findings, I carried out a replication study using a sample of 263 affected individuals from the IMGSAC collection and 390 control individuals. Several rare mutations were identified, including the splice site mutation IVS5+2T>C and the L326F substitution previously reported by Melke et al (2007), but the same rare variants have been found also in control individuals in our study. Interestingly, a new R319X stop mutation was found in a single autism proband of Italian origin and is absent from the entire control sample. Furthermore, no replication has been found in our case-control study typing the SNPs on the ASMT promoter B.

Squaraine mit ausgedehnter Konjugation

Squaraine mit ausgedehnter Konjugation: Die vorliegende Arbeit ist in zwei Teilbereiche gegliedert, wobei der erste Teil die Synthese und Eigenschaftsuntersuchung symmetrischer und unsymmetrischer, stilbenoider Squaraine mit ausgedehnter Konjugation (DAD-Systeme) betrifft. Im zweiten Teil der Arbeit werden als Modellverbindungen für diese Squaraine Oligo(phenylenvinylen)e (OPVs) mit terminaler Donor-Acceptor-Substitution hergestellt.Es wurden drei unterschiedliche Klassen von konjugationsverlängerten Squarainen synthetisiert: unsymmetrische und symmetrische Monosquaraine sowie Oligosquaraine mit zwei, drei oder vier quarylium-Einheiten. Um eine bessere Löslichkeit zu gewährleisten, tragen die meisten Verbindungen voluminöse, flexible Bis(2-hexyloctyl)amino-Reste. Teilweise konnte die Löslichkeit auch durch zusätzliche Hexylseitenketten noch weiter verbessert werden. Der Aufbau der stilbenoiden Resorcine, die zur Synthese der entsprechenden Squaraine benötigt werden, erfolgte fast ausschließlich über die Wittig-Horner-Reaktion. Die 3,5-Dihydroxysubstitution erhöht die Nucleophilie in der 4-Position, so daß sich die stilbenoiden Resorcine in guten Ausbeuten mit Quadratsäure oder mit einer Semiquadratsäure zu den gewünschten Squarainen kondensieren ließen. Die Herstellung der Donor-Acceptor-substituierten OPVs erfolgte nach einer konvergenten Synthesestrategie, bei der auf eine repetitive Wittig-Horner-Reaktion und eine einfache Schutzgruppentechnik zurückgegriffen wurde. Als Acceptorgruppen dienten Formyl-, Cyano- und Nitrosubstituenten, als Donorgruppe wurden Bis(2-Hexyloctyl)amino-Reste eingesetzt. Die igenschaftsuntersuchungen an den konjugierten Oligomeren konnten zur Aufklärung des ungewöhnlichen spektroskopischen Verhaltens der Squaraine beitragen. Es wurde ein athematischer Ansatz entwickelt, der das Absorptionsverhalten D-A-substituierter Oligo(phenylenvinylen)e exakt beschreiben kann. Semiempirische Rechnungen und elektrooptische bsorptionsmessungen an diesen Verbindungen bestätigten die experimentell gefundenen Trends.

Charakterisierung verschiedener Reifungsstadien humaner dendritischer Zellen und ihr Einfluss auf die T-Zelldifferenzierung

Diese Zusammenfassung der kumulativen Habilitationsschrift bezieht sich auf folgende Originalarbeiten:

Comparative genomic sequencing analysis of a region in human chromosome 11p15.3, mouse chromosome 7 and analysis of the novel STK33, Stk33 gene

The comparative genomic sequence analysis of a region in human chromosome 11p15.3 and its homologous segment in mouse chromosome 7 between ST5 and LMO1 genes has been performed. 158,201 bases were sequenced in the mouse and compared with the syntenic region in human, partially available in the public databases. The analysed region exhibits the typical eukaryotic genomic structure and compared with the close neighbouring regions, strikingly reflexes the mosaic pattern distribution of (G+C) and repeats content despites its relative short size. Within this region the novel gene STK33 was discovered (Stk33 in the mouse), that codes for a serine/threonine kinase. The finding of this gene constitutes an excellent example of the strength of the comparative sequencing approach. Poor gene-predictions in the mouse genomic sequence were corrected and improved by the comparison with the unordered data from the human genomic sequence publicly available. Phylogenetical analysis suggests that STK33 belongs to the calcium/calmodulin-dependent protein kinases group and seems to be a novelty in the chordate lineage. The gene, as a whole, seems to evolve under purifying selection whereas some regions appear to be under strong positive selection. Both human and mouse versions of serine/threonine kinase 33, consists of seventeen exons highly conserved in the coding regions, particularly in those coding for the core protein kinase domain. Also the exon/intron structure in the coding regions of the gene is conserved between human and mouse. The existence and functionality of the gene is supported by the presence of entries in the EST databases and was in vivo fully confirmed by isolating specific transcripts from human uterus total RNA and from several mouse tissues. Strong evidence for alternative splicing was found, which may result in tissue-specific starting points of transcription and in some extent, different protein N-termini. RT-PCR and hybridisation experiments suggest that STK33/Stk33 is differentially expressed in a few tissues and in relative low levels. STK33 has been shown to be reproducibly down-regulated in tumor tissues, particularly in ovarian tumors. RNA in-situ hybridisation experiments using mouse Stk33-specific probes showed expression in dividing cells from lung and germinal epithelium and possibly also in macrophages from kidney and lungs. Preliminary experimentation with antibodies designed in this work, performed in parallel to the preparation of this manuscript, seems to confirm this expression pattern. The fact that the chromosomal region 11p15 in which STK33 is located may be associated with several human diseases including tumor development, suggest further investigation is necessary to establish the role of STK33 in human health.

Genomisches Imprinting Beckwith-Wiedemann-Syndrom assoziierter Gene

In der vorliegenden Arbeit wurde das Imprinting von Genen der Chromosomenregion 11p15.5 des Menschen und des orthologen murinen Abschnitts 7F5 untersucht. Bei der Analyse der humanen Gene H19, IGF2 und KCNQ1OT1 stand deren Regulation durch differentiell methylierte Regionen (DMR) und die Identifizierung von Methylierungsfehlern bei Patienten mit Verdacht auf Beckwith-Wiedemann Syndrom (BWS) im Vordergrund. Hierzu wurden unmethylierte Cytosinnukleotide durch Bisulfitbehandlung in Uracilnukleotide umgewandelt und PCR-amplifizierte DNA-Fragmente sequenziert. Die elterliche Herkunft der Allele wurde mit Hilfe von Einzelnukleotidpolymorphismen (SNP) bestimmt. Während in der H19-Promotorregion in Lymphozyten eine nur tendenziell allelspezifische Methylierung festgestellt werden konnte, wurde im B1-Repeat der H19/IGF2-Region in allen Kontroll- und 20 Patienten-DNAs eine spezifische Methylierung des väterlichen Allels nachgewiesen. Vier BWS-DNAs zeigten hingegen eine nahezu vollständige Hypomethylierung. In der zwe

Polyphenylene dendrimers

The main goals of this work were the design, synthesis, and characterization of new functional polyphenylene dendrimers. Polyphenylene dendrimers are highly branched, monodisperse macromolecules consisting exclusively of benzene rings. They can be obtained in high yield by a repetitive Diels-Alder cycloaddition - deprotection protocol. Their shape-persistent dendritic scaffold allows to obtain nanoparticles with functional groups in defined relative orientation. In the first chapter polyphenylene dendrimers with a pyrene core are presented. The focus of the investigations was upon the shielding efficiency of dendritic shells of different generations upon the pyrene-functionality in the core. The herein presented materials combine high quantum efficiency, good solubility and improved film forming properties making them possible candidates for several applications in electronic devices. The defined functionalization of polyphenylene dendrimers often requires a great synthetic effort, since for every desired function the appropriate building block has to be synthesized. To overcome these disadvantages, a new functionalization concept based upon benzophenone precursors has been developed. This new concept has successfully been applied for the functionalization of the dendritic core, the dendrimer shell, and the dendrimer surface. To investigate the accessibility and reactivity of the embedded groups, many functions of different size and nature were introduced. Moreover, suitable precursors for the synthesis of dendrimer entrapped species, trityl cations, trityl radicals, and ketyl radical anions, were obtained. The combination of the synthetic protocols of core- and surface-functionalization resulted in a new type of functional molecules, highly interesting from the point of electron transfer processes. A polyphenylene dendron was used to arrange a triphenylamine donor and a perylene acceptor moiety in a defined spatial distance and orientation. The in-depth photophysical investigation of a first model compound is reported. The herein presented functionalized dendrimers are highly interesting as well from the point of view of fundamental research (looking into the optic and electronic properties of such unique shape persistent structures) as from the point of view of their potential application as tailor-made nanomaterials in the field of optoelectronics.

RNA-basierte Impfstoffe zur Induktion optimaler Immunantworten

Antigen-kodierende RNA wird als eine sichere und effiziente Alternative zu traditionellen Impfstoff-Formulierungen, wie Peptid-, Protein-, rekombinanten viralen oder DNA basierten Impfstoffen betrachtet. Der endgültige klinische Nutzen RNA-basierter Impfstoffe wird von der Optimierung verschiedener Parameter abhängig sein, die zur Induktion und effizienten Expansion der humoralen und zellvermittelten Immunantwort beitragen. Vor diesem Hintergrund war die Zielsetzung der vorliegenden Arbeit, die Etablierung pharmakologischer und immunologischer Parameter für die Generierung effektiver Immunantworten durch RNA-Impfstoffe sowie deren Wirksamkeit in vitro und im Mausmodell unter Nutzung von Modellantigenen zu testen. Zur Untersuchung und Optimierung der RNA-Pharmakokinetik, als einem Schlüsselaspekt der klinischen Medikamentenentwicklung, wurde der Einfluss von strukturellen Modifikationen auf die Transkriptstabilität und Translationseffizienz von Reporter-Proteinen in einer zeitabhängigen Kinetik evaluiert. Es wurde gezeigt, dass ein poly(A) Schwanz von 120 Adenosinen, verglichen mit einem kürzeren, ein freies 3´ poly(A) Ende, verglichen mit einem verdeckten und eine doppelte β-globin 3´ UTR, unabhängig voneinander zu einer Erhöhung der IVT-RNA Stabilität und zu einer Verbesserung der Translationseffizienz beitrugen und dadurch insgesamt zu einer erhöhten Proteinexpression führten. Antigen-kodierende IVT-RNA mit diesen molekularen Merkmalen in Kombination führte, im Vergleich zur Standard IVT-RNA, zu einer erhöhten Dichte und Stabilität von Peptid/MHC-Komplexen auf der Zelloberfläche transfizierter DCs und dadurch zu einer verbesserten Stimulation von CD4+ und CD8+ T-Zellen im murinen und humanen System. Mit dem Ziel, die RNA kodierte Antigenform für die Induktion einer verstärkten Antikörperantwort zu modifizieren, wurde im zweiten Teil der Arbeit ein Antigen-IgM Fusionskonstrukt hergestellt und hinsichtlich seiner Eignung als neues Impfstoff-Format untersucht. Die Ausgangshypothese, dass die RNA kodierten Antigen-IgM Fusionsproteine polymerisieren, von transfizierten Zellen sezerniert werden und aufgrund der repetitiven Antigenstruktur im Vergleich mit dem monomeren Antigen zu einer Verstärkung der Antikörperantwort führen, wurde in vitro und in vivo im Mausmodell bestätigt. Die Entwicklung und Evaluierung von Zytokinfusionsproteinen zur selektiven Verstärkung der antigenspezifischen Immunantworten bildeten den dritten Schwerpunkt der vorliegenden Arbeit. Zur weiteren Verstärkung der Antikörperantwort wurde basierend auf den Resultaten aus dem zweiten Teil ein IL2-IgM Fusionskonstrukt hergestellt. Die Ko-Transfektion von Antigen-IgM und IL2-IgM kodierender IVT-RNA führte zu einer signifikant stärkeren Antikörperantwort als die Ko-Transfektion von Antigen-IgM und IL2. Für die Initiierung einer erfolgreichen anti-Tumor-Immunantwort ist das Priming antigenspezifischer T-Zellen essentiell. Um die Effizienz dieses Prozesses zu steigern, wurde ein bifunktionelles IL2-mCD40L Fusionskonstrukt hergestellt und sein Einfluss auf die Effektorfunktion von DCs in vitro und in vivo untersucht. Es wurde gezeigt, dass ein RNA kodiertes IL2-mCD40L Fusionsprotein als genetisches Adjuvanz zu einer Effizienzsteigerung des Priming zytotoxischer T-Zellen führt. Somit wurden in dieser Arbeit durch die Optimierung der Pharmakokinetik, die Modifikation der Antigenform und die Herstellung und Evaluierung von Zytokinfusionskonstrukten als genetische Adjuvantien, RNA-basierte Impfstoffe für eine optimierte Induktion von antigenspezifischen Immunantworten weiter verbessert.

Induktion und Analyse spezifischer Immunantworten nach intranodaler Immunisierung mit RNA im murinen Modell

Die Wirksamkeit einer Vakzine ist von vielen Parametern abhängig. Dazu gehören unter anderen: das ausgewählte Antigen, die Formulation in der das Antigen benutzt wird sowie die Applikationsroute. Antigen-kodierende Ribonukleinsäuren (RNA) gilt heutzutage als eine sichere und effiziente Alternative zu traditionellen Impfstoff-Formulierungen, wie Peptiden, rekombinanten Proteinen, viralen Systemen oder DNA basierten Impfstoffen. Bezüglich des Applikationsortes repräsentiert der Lymphknoten ein optimales Milieu für die Interaktion zwischen antigenpräsentierenden Zellen und T-Zellen. Vor diesem Hintergrund war die Zielsetzung dieser Arbeit, ein auf direktem in vivo Transfer von Antigen-kodierender in vitro transkribierter RNA (IVT-RNA) basierendes Impfverfahren zu entwickeln, zu charakterisieren und auf seine anti-tumorale Wirksamkeit zu testen. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass dendritische Zellen (DCs) in vitro hocheffizient mit IVT-RNA transfiziert werden können und eine hohe stimulatorische Kapazität besitzen. Durch Sequenzmodifikation der IVT-RNA konnten wir die Transkriptstabilität und Translationseffizienz erhöhen was zu einer Steigerung der stimulatorischen Kapazität in vivo führte. Darüber hinaus untersuchten wir die Auswirkung der Insertion eines Signalpeptides 5’ sowie einer C-terminalen transmembran- und zytosolischen-Domäne eines MHC-Klasse-I-Moleküls am 3’ der Antigen-kodierenden Sequenz auf die Effizienz der MHC-Klasse-I und -II Präsentation. Wir konnten in vitro und in vivo nachweisen, dass diese Modifikation zu einer gesteigerten, simultanen Stimulation von antigenspezifischen CD4+ und CD8+ T-Zellen führt. Auf der Basis der optimierten Vektorkassetten etablierten wir die intranodale (i.n.) Transfektion von antigenpräsentierenden Zellen in der Maus. Dazu nutzten wir verschiedene Reportersysteme (eGFP-RNA, fluoreszensmarkierte RNA) und konnten zeigen, dass die intranodale Applikation von IVT-RNA zu selektiven Transfektion und Maturation lymphknotenresidenter DCs führt. Zur Untersuchung der immunologischen Effekte wurden in erster Linie auf Influenza-Hemagglutinin-A und Ovalbumin basierende Modellantigensysteme verwendet. Beide Antigene wurden als Antigen-MHC-Fusionskonstrukte genutzt. Als Responderzellen wurden TCR-transgene Lymphozyten verwendet, die MHC-Klasse-I oder -Klasse-II restringierte Epitope des Influenza-Hemagglutinin-A bzw. des Ovalbumin-Proteins erkennen. Wir konnten in vivo zeigen, dass die intranodale Immunisierung mit IVT-RNA zu einer effizienten Stimulation und Expansion von antigenspezifischen CD4+ und CD8+ T-Zellen in einer dosisabhängigen Weise führt. Funktionell konnte gezeigt werden, dass diese T-Zellen Zytokine sezernieren und zur Zytolyse befähigt sind. Wir waren in der Lage durch repetitive i.n. RNA Immunisierung ein ‚Priming’ CD8+ T-Zellen in naiven Mäusen sowohl gegen virale als auch gegen Tumor assoziierte Antigene zu erreichen. Die geprimten T-Zellen waren befähigt eine zytolytische Aktivität gegen mit spezifischem Peptid beladene Targetzellen zu generieren. Darüber hinaus waren wir in der Lage Gedächtnisszellen expandieren zu können. Abschließend konnten wir in Tumormodellen sowohl in prophylaktischen als auch in therapeutischen Experimenten zeigen dass die i.n. RNA Vakzination die Potenz zur Induktion einer anti-tumoralen Immunität besitzt.

Expression der pronozizeptiven Vanilloidrezeptoren TRPV1 und TRPV2 und des antinozizeptiven Cannabinoidrezeptors CB1 in Spinalganglienneuronen der Ratte

Nozizeptive Spinalganglienneurone detektieren mit einer Vielzahl liganden- und spannungsgesteuerter Ionenkanäle noxische Reize, d.h. Reize, die eine Gewebeschädigung bewirken können, wandeln sie in Aktionspotenzialentladungen um und leiten sie über das Rückenmark zum Gehirn weiter, wo eine Schmerzempfindung ausgelöst wird. Die pronozizeptiven transienten Rezeptor-Potenzial-Kanäle der Vanilloidrezeptorfamilie, TRPV1 und TRPV2, sind die klassischen Transduktionsmoleküle für noxische Hitzereize in den Spinalganglien und werden von Reiztemperaturen über 43°C bzw. 52°C aktiviert. Daneben finden sich auch antinozizeptive Membranproteine, wie z.B. der metabotrope Cannabinoidrezeptor CB1. Er koppelt an spannungsgesteuerte Kaliumkanäle, die neben Natrium- und Kalziumkanälen ebenfalls an der neuronalen Erregbarkeit beteiligt sind. Von den spannungsgesteuerten Kaliumkanälen könnte der Kv1.4, der einen schnell inaktivierenden A-Strom vermittelt, an antinozizeptiven Signalwegen beteiligt sein. Um die molekulare Physiologie der Regulation von Nozizeption und Antinozizeption zu charakterisieren, wurde die Expression bzw. Ko-Expression dieser Membranproteine auf der einen als auch die funktionelle Charakterisierung von TRPV1 auf der anderen Seite im Soma der Spinalganglienneurone und im heterologen Expressionssystem untersucht. TRPV1 wurde in je einem Drittel und TRPV2 in je einem Zehntel aller Spinalganglienneurone nachgewiesen. Das Expressionsmuster veränderte sich nicht zwischen verschiedenen Präparationsmethoden, die zur Aufarbeitung der Zellen für unterschiedliche experimentelle Ansätze notwendig sind. Somit können die aus Expressionsanalysen und funktionellen Untersuchungen gewonnenen Ergebnisse miteinander verglichen werden. Obwohl TRPV1 und TRPV2 in unterschiedlich großen Zellen exprimiert werden, überlappen dennoch ihre Größenverteilungen. Durch Ko-Expressionsanalysen konnten hier erstmalig TRPV1-TRPV2-ko-exprimierende Neurone detektiert werden. Mit dem neu entwickelten N-terminalen Antikörper gegen TRPV1 (3C11) konnte gezeigt werden, dass für TRPV1 verschiedene Splice-Varianten existieren. Neben den bereits bekannten Splice-Varianten wurde hier die neue Variante Vr.3’sv isoliert. Diese besitzt zwischen Exon 15 und 16 eine Insertion aus 104 Basen und exprimiert daher einen veränderten C-Terminus. Trotz dieser Veränderung bildeten sich im heterologen Expressionssystem funktionelle Kanäle aus, die im Gegensatz zu den anderen Varianten immer noch durch Capsaicin aktivierbar waren. Vr.3’sv könnte als Homo- oder Heterotetramer die Eigenschaften TRPV1-positiver Neurone beeinflussen. Bei der Bestimmung der Häufigkeit von TRPV1 in einem Gewebe ist somit die Wahl des Antikörpers von entscheidender Bedeutung. Für TRPV2 dagegen gibt es hier keine Hinweise auf Splice-Varianten. TRPV1 wird durch das Vanilloid Capsaicin aktiviert, wobei diese Substanz neurotoxisch ist und eine Degeneration von Neuronen und epidermalen Nervenfasern bewirkt. Hier wurde nun gezeigt, dass unabhängig von den Splice-Varianten nicht alle TRPV1-positiven Neurone bei langer Inkubationszeit absterben. Funktionelle Untersuchungen belegten, dass auch Capsaicin-sensitive Zellen unter dem Einfluss des Agonisten überleben können. Dieser Schutzmechanismus wird möglicherweise von den verschiedenen Splice-Varianten vermittelt. Ko-Expressionsanalysen zeigten, dass der spannungsgesteuerte Kaliumkanal Kv1.4 in nahezu allen TRPV1- aber nicht TRPV2-positiven Neuronen exprimiert wird. Desweiteren ko-exprimierten nahezu alle TRPV1-positiven Neurone auch den Cannabinoidrezeptor CB1. Diese fast vollständige Ko-Lokalisation von CB1 und Kv1.4 in nozizeptiven Spinalganglienneuronen spricht für eine funktionell synergistische Aktivität. Der Kaliumkanal kann unter der regulativen Kontrolle von CB1 als Vermittler von A-Typ-Kaliumströmen an der Kontrolle der repetitiven Entladungen in der Peripherie und der Transmitterausschüttung zentral beteiligt sein. Es ergeben sich daraus Ansatzpunkte für die Entwicklung neuer Medikamente. Mit Kv1.4-Aktivatoren und/oder peripher wirkenden Cannabinoiden könnten die Nebenwirkungen der Cannabinoide im zentralen Nervensystem umgangen werden.

Induktion regulatorischer T-Zellen zur Inhibition allergenspezifischer Immunantworten im Mausmodell der Typ I-Allergie

Die Induktion regulatorischer T-Zellen (Treg) spielt im Zusammenhang mit der Kontrolle allergenspezifischer Reaktionen, insbesondere auch im Rahmen einer erfolgreichen Hyposensibilisierung mit hohen Allergendosen, eine zentrale Rolle. In der vorliegenden Arbeit wurden die Mechanismen der Rekrutierung allergenspezifischer Treg daher in einem Mausmodell untersucht, in dem analog zur spezifischen Immuntherapie (SIT) die repetitive Verabreichung von hohen Antigendosen einen IgE-spezifischen Suppressionsmechanismus aktiviert, während die Injektion niedriger Antigendosen eine potente IgE-Antwort induziert. Th1-Zellen sowie konventionelle CD4+CD25+ oder CD8+CD28- Treg konnten als Vermittlerpopulationen des suppressiven Effektes in hochdosig immunisierten Mäusen ausgeschlossen werden. Mittels Transferexperimenten wurden erstmals CD4-CD8- doppelt negative Treg als eine die IgE-Suppression vermittelnde Zellpopulation identifiziert. Desweiteren wurden DNA-Transferexperimente durchgeführt, mit dem Ziel, adaptive Treg zum Zwecke der Inhibition allergenspezifischer Immunreaktionen zu induzieren. Dazu wurden IL-10- bzw. TGF-ß-kodierende Plasmide (pCMV-IL-10, pCMV-TGF-ß) hergestellt und in Kombination mit einem Plasmid, welches das Modellallergen ß-Galaktosidase (ßGal) unter der Kontrolle des DC-spezifischen Fascin-Promotors (pFascin-ßGal) kodierte, Mäusen mit der Genpistole appliziert. Die Expression des Modellallergens in Verbindung mit der konstitutiven Produktion von immunsuppressiven Zytokinen sollte bei den mit den transfizierten DC interagierenden antigenspezifischen T-Zellen zu einer verstärkten Differenzierung von Treg führen. Die Experimente zeigten, dass die Koapplikation von IL-10-kodierenden Plasmiden eine Immunsuppression induziert, die sich in einer verminderten antigenspezifischen Antikörperproduktion, Zytokinproduktion und CTL-Induktion zeigt, die jedoch bei nachfolgender Sensibilisierung mit ßGal-Protein nicht aufrechterhalten werden kann. Dahingegen führte die Koapplikation von TGF-ß-kodierenden Plasmiden verbunden mit einer nachfolgenden Sensibilisierung zu einer leichten Inhibition der IgG1- und IgG2a-Produktion verglichen mit der Vakzinierung mit pFascin-ßGal allein. Dieser inhibitorische Effekt von pCMV-TGF-ß wurde interessanterweise nicht bereits nach der DNA-Immunisierung, sondern erst nach Sensibilisierung mit dem Protein beobachtet.