Neuronale Netzwerke des Zentralkomplexes und ein räumliches Arbeitsgedächtnis von Drosophila melanogaster

Zielgerichtete Orientierung ermöglicht es Lebewesen, überlebenswichtige Aufgaben, wie die Suche nach Ressourcen, Fortpflanzungspartnern und sicheren Plätzen zu bewältigen. Dafür ist es essentiell, die Umgebung sensorisch wahrzunehmen, frühere Erfahrungen zu speichern und wiederabzurufen und diese Informationen zu integrieren und in motorische Aktionen umzusetzen.rnWelche Neuronengruppen vermitteln zielgerichtete Orientierung im Gehirn einer Fliege? Welche sensorischen Informationen sind in einem gegebenen Kontext relevant und wie werden diese Informationen sowie gespeichertes Vorwissen in motorische Aktionen übersetzt? Wo findet im Gehirn der Übergang von der sensorischen Verarbeitung zur motorischen Kontrolle statt? rnDer Zentralkomplex, ein Verbund von vier Neuropilen des Zentralhirns von Drosophila melanogaster, fungiert als Übergang zwischen in den optischen Loben vorverarbeiteten visuellen Informationen und prämotorischem Ausgang. Die Neuropile sind die Protocerebralbrücke, der Fächerförmige Körper, der Ellipsoidkörper und die Noduli. rnIn der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass Fruchtfliegen ein räumliches Arbeitsgedächtnis besitzen. Dieses Gedächtnis kann aktuelle visuelle Information ersetzen, wenn die Sicht auf das Zielobjekt verloren geht. Dies erfordert die sensorische Wahrnehmung von Zielobjekten, die Speicherung der Position, die kontinuierliche Integration von Eigen-und Objektposition, sowie die Umsetzung der sensorischen Information in zielgerichtete Bewegung. Durch konditionale Expression von Tetanus Toxin mittels des GAL4/UAS/GAL80ts Systems konnte gezeigt werden, dass die Ringneurone, welche in den Ellipsoidkörper projizieren, für das Orientierungsgedächtnis notwendig sind. Außerdem konnte gezeigt werden, dass Fliegen, denen die ribosomale Serinkinase S6KII fehlt, die Richtung verlieren, sobald keine Objekte mehr sichtbar sind und, dass die partielle Rettung dieser Kinase ausschließlich in den Ringneuronenklassen R3 und R4d hinreichend ist, um das Gedächtnis wieder herzustellen. Bei dieser Gedächtnisleistung scheint es sich um eine idiothetische Form der Orientierung zu handeln. rn Während das räumliche Arbeitsgedächtnis nach Verschwinden von Objekten relevant ist, wurde in der vorliegende Arbeit auch die Vermittlung zielgerichteter Bewegung auf sichtbare Objekte untersucht. Dabei wurde die zentrale Frage bearbeitet, welche Neuronengruppen visuelle Orientierung vermitteln. Anhand von Gehirnstrukturmutanten konnte gezeigt werden, dass eine intakte Protocerebralbrücke notwendig ist, um Laufgeschwindigkeit, Laufaktivität und Zielgenauigkeit bei der Ansteuerung visueller Stimuli korrekt zu vermitteln. Dabei scheint das Horizontale Fasersystem, welches von der Protocerebralbrücke über den Fächerförmigen Körper auf den Zentralkomplex assoziierte Neuropile, die Ventralkörper, projiziert, notwendig für die lokomotorische Kontrolle und die zielgenaue Bewegung zu sein. Letzeres konnte zum einen durch Blockade der synaptischen Transmission anhand konditionaler Tetanus Toxin Expression mittels des GAL4/UAS/GAL80ts Systems im Horizontalen Fasersystem gezeigt werden;. zum anderen auch durch partielle Rettung der in den Strukturmutanten betroffenen Gene. rn Den aktuellen Ergebnissen und früheren Studien folgend, ergibt sich dabei ein Modell, wie zielgerichtete Bewegung auf visuelle Stimuli neuronal vermittelt werden könnte. Nach diesem Modell bildet die Protocerebralbrücke die Azimuthpositionen von Objekten ab und das Horizontale Fasersystem vermittelt die entsprechende lokomotorische Wo-Information für zielgerichtete Bewegungen. Die Eigenposition in Relation zum Zielobjekt wird über die Ringneurone und den Ellipsoidkörper vermittelt. Wenn das Objekt aus der Sicht verschwindet, kann die Relativposition ideothetisch ermittelt werden und integriert werden mit Vorinformation über das Zielobjekt, die im Fächerförmigen Körper abgelegt ist (Was-Information). Die resultierenden Informationen könnten dann über das Horizontale Fasersystem in den Ventralkörpern auf absteigende Neurone gelangen und in den Thorax zu den motorischen Zentren weitergeleitet werden.rn

Rupture forces of split aptamers

Rupture forces of ligand-receptor interactions, such as proteins-proteins, proteins-cells, and cells-tissues, have been successfully measured by atomic force spectroscopy (AFS). For these measurements, the ligands and receptors were chemically modified so that they can be immobilized on the tip and on a substrate, respectively. The ligand interact the receptor when the tip approaches the substrate. This interaction can be studied by measuring rupture force upon retraction. However, this technique is not feasible for measurements involving small molecules, since they form only few H-bonds with their corresponding receptors. Modifying small molecules for immobilization on surfaces may block or change binding sites. Thus, recorded rupture forces might not reflect the full scope of the involved small ligand-receptor interactions.rnIn my thesis, a novel concept that allows measuring the rupture force of small involved ligand-receptor interactions and does not require molecular modification for immobilization was introduced. The rupture force of small ligand-receptor interaction is not directly measured but it can be determined from measurements in the presence and in the absence of the ligand. As a model system, the adenosine mono phosphate (AMP) and the aptamer that binds AMP were selected. The aptamer (receptor) is a single stranded DNA that can partially self-hybridize and form binding pockets for AMP molecules (ligands). The bonds between AMP and aptamer are provided by several H-bonds and pair stacking.rnIn the novel concept, the aptamer was split into two parts (oligo a and oligo b). One part was immobilized on the tip and the other one on the substrate. Approaching the tip to the substrate, oligo a and oligo b partially hybridized and the binding pockets were formed. After adding AMP into the buffer solution, the AMP bound in the pockets and additional H-bonds were formed. Upon retraction of the tip, the rupture force of the AMP-split aptamer complex was measured. In the presence of excess AMP, the rupture force increased by about 10 pN. rnThe dissociation constant of the AMP-split aptamer complex was measured on a single molecular level (~ 4 µM) by varying the AMP concentrations and measuring the rupture force at each concentration. Furthermore, the rupture force was amplified when more pockets were added to the split aptamer. rnIn the absence of AMP, the thermal off-rate was slightly reduced compared to that in the presence of AMP, indicating that the AMP stabilized the aptamer. The rupture forces at different loading rates did not follow the logarithmic fit which was usually used to describe the dependence of rupture forces at different loading rates of oligonucleotides. Two distinguished regimes at low and high loading rates were obtained. The two regimes were explained by a model in which the oligos located at the pockets were stretched at high loading rates. rnThe contribution of a single H-bond formed between the AMP molecule and the split aptamer was measured by reducing the binding groups of the AMP. The rupture forces reduce corresponding to the reduction of the binding groups. The phosphate group played the most important role in the formation of H-bond network between the AMP molecule and the split aptamer. rn

Long-term potentiation and neural network activity in the neonatal rat cerebral cortex in vivo

Long-term potentiation in the neonatal rat rnbarrel cortex in vivo rnLong-term potentiation (LTP) is important for the activity-dependent formation of early cortical circuits. In the neonatal rodent barrel cortex LTP has been so far only studied in vitro. I combined voltage-sensitive dye imaging with extracellular multi-electrode recordings to study whisker stimulation-induced LTP for both the slope of field potential and the number of multi-unit activity in the whisker-to-barrel cortex pathway of the neonatal rat barrel cortex in vivo. Single whisker stimulation at 2 Hz for 10 min induced an age-dependent expression of LTP in postnatal day (P) 0 to P14 rats with the strongest expression of LTP at P3-P5. The magnitude of LTP was largest in the stimulated barrel-related column, smaller in the surrounding septal region and no LTP could be observed in the neighboring barrel. Current source density analyses revealed an LTP-associated increase of synaptic current sinks in layer IV / lower layer II/III at P3-P5 and in the cortical plate / upper layer V at P0-P1. This study demonstrates for the first time an age-dependent and spatially confined LTP in the barrel cortex of the newborn rat in vivo. These activity-dependent modifications during the critical period may play an important role in the development and refinement of the topographic map in the barrel cortex. (An et al., 2012)rnEarly motor activity triggered by gamma and spindle bursts in neonatal rat motor cortexrnSelf-generated neuronal activity generated in subcortical regions drives early spontaneous motor activity, which is a hallmark of the developing sensorimotor system. However, the neuronal activity patterns and functions of neonatal primary motor cortex (M1) in the early movements are still unknown. I combined voltage-sensitive dye imaging with simultaneous extracellular multi-electrode recordings in the neonatal rat S1 and M1 in vivo. At P3-P5, gamma and spindle bursts observed in M1 could trigger early paw movements. Furthermore, the paw movements could be also elicited by the focal electrical stimulation of M1 at layer V. Local inactivation of M1 could significantly attenuate paw movements, suggesting that the neonatal M1 operates in motor mode. In contrast, the neonatal M1 can also operate in sensory mode. Early spontaneous movements and sensory stimulations of paw trigger gamma and spindle bursts in M1. Blockade of peripheral sensory input from the paw completely abolished sensory evoked gamma and spindle bursts. Moreover, both sensory evoked and spontaneously occurring gamma and spindle bursts mediated interactions between S1 and M1. Accordingly, local inactivation of the S1 profoundly reduced paw stimulation-induced and spontaneously occurring gamma and spindle bursts in M1, indicating that S1 plays a critical role in generation of the activity patterns in M1. This study proposes that both self-generated and sensory evoked gamma and spindle bursts in M1 may contribute to the refinement and maturation of corticospinal and sensorimotor networks required for sensorimotor coordination.rn

Folic acid derivatives for PET imaging and therapy addressing folate receptor positive tumors

Folic acid, also known as vitamin B9, is the oxidized form of 5,6,7,8-tetrahydrofolate, which serves as methyl- or methylene donor (C1-building blocks) during DNA synthesis. Under physiological conditions the required amount of 5,6,7,8-tetrahydrofolate for survival of the cell is accomplished through the reduced folate carrier (RFC). In contrast, the supply of 5,6,7,8-tetrahydrofolate is insufficient under pathophysiological conditions of tumors due to an increased proliferation rate. Consequently, many tumor cells exhibit an (over)expression of the folate receptor. This phenomenon has been applied to diagnostics (PET, SPECT, MR) to image FR-positive tumors and on the other hand to treat malignancies related to a FR (over)expression. Based on this concept, a new 18F-labeled folate for PET imaging has been developed and was evaluated in vivo using tumor-bearing mice. The incorporation of oligoethylene spacers into the molecular structure led to a significant enhancement of the pharmacokinetics in comparison to previously developed 18F-folates. The liver uptake could be reduced by one sixth by remaining a tumor uptake of 3%ID/g leading to better contrast ratios. Encouraged by these results, a clickable 18F-labeled serine-based prosthetic group has been synthesized, again with the idea to improve the metabolic and pharmacokinetic profile of hydrophilic radiotracers. Therefore, an alkyne-carrying azido-functionalized serine derivative for coupling to biomolecules was synthesized and a chlorine leaving group for 18F-labeling, which could be accomplished using a microwave-assisted synthesis, a [K⊂2.2.2]+/carbonate system in DMSO. Radiochemical yields of 77±6% could be achieved.rnThe promising results obtained from the FR-targeting concept in the diagnostic field have been transferred to the boron neutron capture therapy. Therefore, a folate derivative was coupled to different boron clusters and cell uptake studies were conducted. The synthesis of the folate-boron clusters was straightforward. At first, a linker molecule based on maleic acid was synthesized, which was coupled to the boron cluster via Michael Addition of a thiol and alkene and subsequently coupled to the targeting moiety using CuAAC. The new conjugates of folate and boron clusters led to a significant increase of boron concentration in the cell of about 5-times compared to currently used and approved boron pharmaceuticals. rnMoreover, azido-folate derivatives were coupled to macromolecular carrier systems (pHPMA), which showed an enhanced and specific accumulation at target sites (up to 2.5-times) during in vivo experiments. A specific blockade could be observed up to 30% indicating an efficient targeting effect. A new kind of nanoparticles consisting of a PDLLA core and p((HPMA)-b-LMA)) as surfactants were developed and successfully radiolabeled via 18F-click chemistry in good RCYs of 8±3%rnThe nanoparticles were obtained via the miniemulsion technique in combination with solvent evaporation. The 18F-labeled nanoparticles were applied to in vivo testing using a mouse model. PET imaging showed a “mixed” biodistribution of low molecular weight as well as high molecular weight systems, indicating a partial loss of the 18F-labeled surfactant.rnIn conclusion, the presented work successfully utilized the FR-targeting concept in both, the diagnostic field (PET imaging) and for therapeutic approaches (BNCT, drug delivery systems). As a result, the high potential of FR-targeting in oncological applications has been shown and was confirmed by small animal PET imaging.rn

Untersuchungen zur Regulation von T-Effektorzellen im peripheren Blut von MS-Patienten und humanisierten Mäusen mit einer induzierten autoimmunen Enzephalitis

Die Multiple Sklerose (MS) ist eine Autoimmunkrankheit des zentralen Nervensystems, bei der sich autoreaktive T-Effektorzellen der Kontrolle durch regulatorische T-Zellen (Treg) entziehen. Innerhalb dieser Arbeit wurde gezeigt, dass T-Effektorzellen von MS-Patienten insensitiv gegenüber der Suppression durch Treg sind. Hervorgerufen wird diese Treg-Resistenz durch Interleukin-6 (IL-6). Die Inhibition des IL-6-Signalweges stellt die Treg-vermittelte Suppression der T-Effektorzellen wieder her. Es zeigte sich, dass die Bildung von IL-6 und die Expression des IL-6-Rezeptors in MS-Patienten in einer positiven Rückkopplungsschleife von IL-6 selbst induziert werden.rnZur Analyse humaner Immunantworten in vivo und deren Modulation durch humanspezifische Therapeutika wurden humanisierte Mausmodelle etabliert. Der adoptive Transfer humaner Immunzellen in immundefiziente Mäuse erlaubte die Untersuchung von T-Lymphozyten, die aus dem Blut von MS-Patienten isoliert wurden. Es zeigte sich, dass Treg-resistente T-Effektorzellen aus den MS-Patienten in den Tieren eine letale Graft-versus-Host-Erkrankung auslösten, die nicht durch aktivierte Treg therapiert werden konnte. Erst eine Behandlung mit dem humanspezifischen anti-IL-6-Antikörper Tocilizumab in vivo konnte die Erkrankung der Tiere deutlich abmildern.rnIm zweiten Modell wurden immundefiziente Mäuse mit humanen CD34+ Blutstammzellen immunologisch rekonstituiert. Diese Tiere entwickelten ein nahezu vollständig humanes Immunsystem. Die Immunisierung mit dem murinen Myelin-Oligodenrozyten-Glykoprotein löste in den humanisierten Mäusen eine MS-ähnliche Autoimmunität aus. Die Neuroinflammation wurde durch humane T- und B-Zellen vermittelt, korrelierte mit erhöhter IL-17-Produktion und führte zu einer IL-6-abhängigen Treg-Resistenz der T-Effektorzellen. Somit eignen sich die etablierten Modelle, um zukünftig die Wirksamkeit neuer Therapeutika zur Behandlung der MS präklinisch zu testen.rn

The role of SENP1 in B cell development and differentiation

SUMOylation is a highly dynamic and reversible posttranslational protein modification closely related to ubiquitination. SUMOylation regulates a vast array of different cellular functions, such as cell cycle, nuclear transport, DNA damage response, proliferation and transcriptional activation. Several groups have shown in in vitro studies how important SUMOylation is for early B cell development and survival as well as for later plasma cell differentiation. This thesis focuses on the deSUMOylation protease SENP1 and its in vivo effects on B cell development and differentiation. For this a conditional SENP1 knockout mouse model was crossed to the CD19-Cre mouse strain to generate a B cell specific SENP1 knockout mouse.rnIn our conditional SENP1ff CD19-Cre mouse model we observed normal numbers of all B cell subsets in the bone marrow. However in the spleen we observed an impairment of B cell survival, based on a 50% reduction of the follicular B cell compartment, whereas the marginal zone B cell compartment was unchanged. T cell numbers were comparable to control mice. rnFurther, impairments of B cell survival in SENP1ff CD19-Cre mice were analysed after in vivo blocking of IL7R signalling. The αIL7R treatment in mature mice blocked new B cell formation in the bone marrow and increased apoptosis rates could be observed in splenic SENP1 KO B cells. Additionally, a higher turnover rate of B cells was measured by in vivo BrdU incorporation.rnSince it is known that the majority of transcription factors that are important for the maintenance of the germinal centre reaction or for induction of plasma cell development are SUMOylated, the question arose, how defective deSUMOylation will manifest itself in these processes. The majority of in vitro cultured splenic B cells, stimulated to undergo class switch recombination and plasma cell differentiation underwent activation induced cell death. However, the surviving cells increasingly differentiated into IgM expressing plasma cells. Class switch recombination to IgG1 was reduced. These observations stood in line with observation made in in vivo sheep red blood cell immunization experiments, which showed increased amounts of germinal centres and germinal centre B cells, as well as increased amounts of plasma cells differentiation in combination with decreased class switch to IgG1.rnThese results lead to the conclusion that SENP1 KO B cells increasingly undergo apoptosis, however, B cells that survive SENP1 deficiency are more prone to undergo plasma cell differentiation. Further, the precursors of these plasma cells either are not as capable of undergoing class switch recombination or they do switch to IgG1 and succumb to activation induced cell death. One possible explanation for both scenarios could be a defective DNA damage response mechanisms during class switch recombination, caused by impaired deSUMOylation. rn

Generation and characterisation of acute myeloid leukaemia-reactive CD4 + T cells and their potential to eliminate human leukaemia blasts in NSG mice

Acute myeloid leukaemia (AML) is a cancer of the haematopoietic system, which can in many cases only be cured by haematopoietic stem cell transplantation (HSCT) and donor lymphocyte infusion (DLI) (Burnett et al., 2011). This therapy is associated with the beneficial graft-versus-leukaemia (GvL) effect mediated by transplanted donor T and NK cells that either recognise mismatch HLA molecules or polymorphic peptides, so-called minor histocompatibility antigens, leukaemia-associated or leukaemia-specific antigens in the patient and thus eliminate remaining leukaemic blasts. Nevertheless, the mature donor-derived cells often trigger graft-versus-host disease (GvHD), leading to severe damages in patients’ epithelial tissue, mainly skin, liver and intestine (Bleakley & Riddell, 2004). Therefore, approaches for the selective mediation of strong GvL effects are needed, also in order to prevent relapse after transplantation. One promising opportunity is the in vitro generation of AML-reactive CD4+ T cells for adoptive transfer. CD4+ T cells are advantageous compared to CD8+ T cells, as HLA class II molecules are under non-inflammatory conditions only expressed on haematopoietic cells; a fact that would minimise GvHD (Klein & Sato, 2000). In this study, naive CD4+ T cells were isolated from healthy donors and were successfully stimulated against primary AML blasts in mini-mixed lymphocyte/leukaemia cell cultures (mini-MLLC) in eight patient/donor pairs. After three to seven weekly restimulations, T cells were shown to produce TH1 type cytokines and to be partially of monoclonal origin according to their TCR Vβ chain usage. Furthermore, they exhibited lytic activity towards AML blasts, which was mediated by the release of granzymes A and B and perforin. The patient/donor pairs used in this study were fully HLA-class I matched, except for one pair, and also matched for HLA-DR and -DQ, whereas -DP was mismatched in one or both alleles, reflecting the actual donor selection procedure in the clinic (Begovich et al., 1992). Antibody blocking experiments suggested that the generated CD4+ T cells were directed against the HLA-DP mismatches, which could be confirmed by the recognition of donor-derived lymphoblastoid cell lines (LCLs) electroporated with the mismatched DP alleles. Under non-inflammatory conditions primary fibroblasts did not express HLA-DP and were thus not recognised, supporting the idea of a safer application of CD4+ T cells regarding induction of GvHD. For the assessment of the biological significance of these T cells, they were adoptively transferred into NSG mice engrafted with human AML blasts, where they migrated to the bone marrow and lymphoid tissue and succeeded in eliminating the leukaemic burden after only one week. Therefore, AML-reactive CD4+ T cells expanded from the naive compartment by in vitro stimulation with primary leukaemia blasts appear to be a potent tool for DLI in HSCT patients and promise to mediate specific GvL effects without causing GvHD.

Evaluation zellulärer Mechanismen der allergen-spezifischen Immuntherapie in einem chronischen Modell der allergischen Atemwegsentzündung

Klinische Studien haben gezeigt, dass die allergenspezifische Immuntherapie (SIT) eine effektive Therapieoption für allergische Erkrankungen ist. Obwohl dieses Therapieverfahren seit über 100 Jahren existiert, sind die zugrunde liegenden Suppressionsmechanismen jedoch nicht vollständig verstanden. Bisher wird angenommen, dass der Behandlungserfolg der SIT auf einer Blockade durch allergenspezifische Antikörper, einer Verschiebung des Th1-Th2-Gleichgewichtes und/oder auf einer Suppression durch regulatorische T-Zellen (Tregs) basiert. Um die Effekte der SIT in einer chronischen Erkrankung in vivo untersuchen zu können, wurde in dieser Doktorarbeit ein Mausmodell für chronisches Asthma entwickelt, das die Situation im Menschen nach einer SIT nachahmt. rnDurch eine SIT war es möglich, allergeninduzierte Asthmasymptome wie Atemwegshyperreagibilität (AHR), Eosinophilie in der Lunge, IgE-Produktion und Atemwegsentzündung im Modell zu unterdrücken. Bemerkenswert ist, dass durch OVA-spezifische Immuntherapie (OVA-IT) ebenfalls eine Verringerung der strukturellen Veränderungen im Lungengewebe im chronischen Krankheitsverlauf erreicht wurde.rnDes Weiteren wurde in diesem Modell nach den Prozessen gesucht, die für die toleranzinduzierende Wirkung der SIT verantwortlich sein können. Dabei wurde im Vergleich zur Placebo-behandelten Gruppe eine erhöhte Antwort spezifischer IgG1-Antikörper, eine verstärkte Th1-Antwort, sowie eine erhöhte Frequenz von FoxP3+ Tregs und von IL-10-produzierenden T-Zellen (Tr1-Zellen) nach OVA-IT festge-stellt. Zur weiteren Untersuchung der von SIT-induzierten T-Zellantworten wurden Mausmodelle des allergischen Asthmas mit einem akuten Verlauf gewählt.rnDie Bedeutung der Th1-Zellen für die SIT wurde in T-bet-/- Mäusen untersucht, welche aufgrund des Fehlens des Transkriptionsfaktors T-bet keine stabile Th1-Antwort induzieren können. Durch SIT war es möglich, allergeninduzierte Asthmasymptome wie AHR, eosinophile Granulozyten in der Lunge, IgE-Produktion und Atemwegsentzündung in den T-bet-/- Tieren im gleichen Maße wie in den Wildtyptieren zu unterdrücken. Diese Untersuchung zeigte, dass die SIT auch ohne funktionelle Th1-Zellen die allergische Entzündung unterdrücken kann. rnDie Rolle der Tregs für die SIT wurde in DO11.10 Mäusen und DO11.10 RAG-/- Mäusen untersucht. In beiden Stämmen konnte nach SIT eine Induktion OVA-spezifischer Tregs nachgewiesen werden. In DO11.10 RAG-/- Mäusen können durch den Knockout im rag2-Gen keine natürlichen, d.h. im Thymus gereiften, Tregs entstehen. Im Blut von DO11.10 RAG-/- Mäusen war direkt nach Durchführung der OVA-IT eine FoxP3+ Treg-Population detektierbar. Demnach wird durch die OVA-IT eine de-novo-Induktion von FoxP3+ Tregs in Gang gesetzt. In Abwesenheit der natürlichen Tregs zeigte sich weiterhin, dass diese Zellen zur Produktion von IL-10 in T-Zellen und somit zum Erfolg der SIT beitragen.rnDie Rolle der FoxP3+ Tregs bei der SIT wurde in DEREG Mäusen untersucht. Eine Depletion der FoxP3+ Tregs in DEREG Mäusen während der Durchführung der OVA-IT hob die protektiven Effekte der Therapie jedoch nur teilweise auf. rnUm die Rolle des regulatorischen Zytokins IL-10 bei der SIT zu untersuchen, wurde ein blockierender Antikörper gegen den IL-10-Rezeptor (anti-IL-10R) im chronischen Modell des allergischen Asthmas mit SIT angewendet. Anti-IL-10R hob die protektive Wirkung der SIT auf die AHR, die Atemwegsentzündung und die strukturellen Veränderungen im Lungengewebe auf. Somit ist die protektive Wirkung der SIT abhängig vom IL-10-Signalweg.rnZusammenfassend stellt diese Arbeit die Bedeutung der SIT für allergische Erkrankungen heraus. SIT kann durch die positive Beeinflussung der allergiebedingten, strukturellen Veränderungen in der Lunge auch für Asthmapatienten große Vorteile bringen. Die aus Studien bekannten Mechanismen konnten im Modell bestätigt werden und wurden im weiteren Verlauf untersucht. Die Arbeit stellt im Besonderen die Bedeutung der IL-10-produzierenden und FoxP3+ Tregs für die Effektivität der SIT in den Vordergrund. Zudem ist durch die Etablierung eines neuen Mausmodells der SIT für chronisches allergisches Asthma ein Mittel zur weiteren Erforschung der zugrunde liegenden Prozesse dieser erfolgreichen Therapie geschaffen worden. rn

Die Rolle von gamma2-Adaptin im endo-lysosomalen Proteintransport von Säuger-Zellen

Ziel der Arbeit war es, die physiologische Funktion von 2-Adaptin zu charakterisieren. 2 Adaptin wurde 1998 erstmals von Takatsu et al. und Lewin et al. als mögliches Mitglied der Clathrin-Adapter-Proteinfamilie beschrieben. Seine genaue physiologische Funktion ist aber bis heute noch unklar. Bisherige Ergebnisse deuten darauf hin, das 2-Adaptin unabhängig von den AP-Komplexen wirkt. rnIn der HBV-Morphogenese ist eine spezielle Funktion von 2-Adaptin bekannt, da es dort nach seiner Ubiquitinierung durch Nedd4 als Adapter zwischen dem HBV L- und Core-Protein fungiert und Änderungen in der 2 Konzentration die HBV-Freisetzung blockieren.rn2-Adaptin besitzt neben den für die Clathrin-Adapter Proteine typischen Clathrin-bindenden Eigenschaften auch die Fähigkeit, Ubiquitin über sein UIM zu binden. Darüberhinaus wird 2-Adaptin durch seine Interaktion mit der Ubiquitin-Ligase Nedd4 selbst ubiquitiniert. Damit besitzt 2-Adaptin typische Eigenschaften eines Ubiquitin-Adapters. 2-Adaptin ist an MVBs lokalisiert und Abweichungen in der 2 Konzentration verändern die MVB-Morphologie. Zudem führt die Überexpression von 2-Adaptin zur Blockade der Freisetzung retroviraler VLPs und die 2 Depletion blockiert den lysosomalen Abbau von EGF, einem Substrat des endo-lysosomalen Proteintransports. Dies alles deutet auf eine mögliche Funktion von 2-Adaptin in diesem Transportsystem hin, welche in dieser Arbeit näher untersucht wurde.rnEs konnte gezeigt werden, dass die Depletion von 2-Adaptin den Abbau von endogenen (z.B. EGF, ubiquitinierte Proteine) und exogenen (z.B. das retrovirale MLV.gag-Polyprotein) Substraten des endo-lysosomalen Weges inhibiert, während sie bei 2 Überexpression verstärkt abgebaut werden. Alle bisher identifizierten „Substrate“ von 2 Adaptin, also Proteine, die durch überschüssiges 2-Adaptin abgebaut werden, besitzen eine Verbindung zum endo-lysosomalen System und / oder zur Ubiquitin-Maschinerie der Zelle. Weitere Hinweise auf eine Rolle von 2 Adaptin im MVB-Weg lieferte die Identifikation von Vps28 und Chmp2A als spezifische Interaktionspartner von 2-Adaptin. Über Vps28 erhält -Adaptin direkten Zugang zum ESCRT-I- und über Chmp2A zum ESCRT-III-Komplex. rnZudem konnte neben dem UIM eine PH-Domäne in 2-Adaptin als wichtige funktionelle Domäne identifiziert werden. Sie stellt das Modul für die Interaktion mit Rab7 dar, welche erstmals gezeigt werden konnte. Auch die Interaktion mit Rab7 deutet auf eine Rolle von 2 Adaptin im endo-lysosomalen Transportsystem hin, da Rab7 an späten Endosomen lokalisiert ist und u.a. die Fusion der MVBs mit den Lysosomen vermittelt. Da die Auswirkungen der Rab7-Überexpression und Depletion auf MLV.gag denen der 2 Überexpression bzw. Depletion entsprechen, liegt die Vermutung nahe, dass 2-Adaptin an einem ähnlich späten Schritt im endo-lysosomalen Transportsystem wirkt wie Rab7. Jedoch blockiert überschüssiges 2 Adaptin die ESCRT-abhängige VLP-Ausschleusung an der Plasmamembran und fungiert daher möglicherweise als negativer Regulator der ESCRT-Kaskade. Da die Überexpression von -Adaptin aber gleichzeitig zum vermehrten lysosomalen Abbau führt, ist eine Funktion von 2-Adaptin bei der MVB-Lysosomen-Fusion wenig wahrscheinlich. Einer solchen Funktion widerspricht auch, dass die intrazelluläre Konzentration von Rab7 und Vps28 durch überschüssiges 2-Adaptin reduziert werden. rnAls dritte funktionell wichtige Domäne in 2-Adaptin konnte ein LIR-Motiv identifiziert werden, über welches -Adaptin mit dem Autophagie-Markerprotein LC3 interagieren kann. Die Interaktion mit LC3, und damit die Verbindung zur Autophagie-Machinerie, liefert eine mögliche Erklärung für den vermehrten Abbau bei 2-Überexpression und den Abbau von Proteinen auf der MVB-Oberfläche. Dabei induziert 2-Adaptin nicht die Autophagie per se, sondern scheint als Autophagie-Adapter zu wirken, der seine Substrate, z.B. MVBs, selektiv dem Abbau durch Autophagie zuführt. rnrnEine mögliche Rolle von 2-Adaptin im zum Lysosom hin gerichteten zellulären Transport konnte bestätigt werden, wobei 2-Adaptin dabei verschiedene Funktionen übernimmt: rn als Ubiquitin-Adapter im endo-lysosomalen System, rn als negativer Regulator der ESCRT-Kaskadern und / oder als Autophagie-Adapter.rn

Funktionelle Charakterisierung der Protein-Kinase CK2 in der Suppression Th2-vermittelter Immunantworten durch regulatorische T-Zellen

Regulatorische T-Zellen (Tregs) leisten durch ihre suppressiven Eigenschaften einen essenziellen Beitrag zur Aufrechterhaltung der immunologischen Toleranz. Sie verhindern schädliche Immunreaktionen gegen Autoantigene, kommensale Bakterien, sowie harmlose Nahrungsmittel-bestandteile. Gleichzeitig gewährleisten sie die Entwicklung effektiver Immunantworten gegen eindringende Pathogene, wie z.B. Parasiten, Bakterien und Viren. Damit haben Tregs direkten Einfluss auf das Gleichgewicht zwischen Immunität und Toleranz. Fehler in der suppressiven Funktionsweise von Tregs begünstigen daher auf der einen Seite die Entstehung zahlreicher autoimmuner Erkrankungen und Allergien. Auf der anderen Seite können Tregs Immunreaktionen bei chronischen Infektionen reduzieren, sowie die Entstehung effektiver Immunantworten gegen Tumore hemmen. Ihre Beteiligung an der Ätiologie all dieser Krankheiten macht Tregs zu einem bedeutenden potenziellen Zielobjekt, um diese Krankheiten effektiv zu therapieren. Die Erweiterung des Grundwissens um die molekularen Mechanismen der Treg-vermittelten Suppression ist daher ein notwendiger Schritt bei der Entwicklung Treg-basierter Theraphieansätze. 2003 konnte mit Foxp3 ein Transkriptionsfaktor identifiziert werden, der maßgeblich die suppressiven Funktionen von Tregs steuert. Um weiteren Einblick in die der Suppression zugrundeliegenden Signalwege zu erhalten, wurde im Institut für Immunologie ein komparativer Kinomarray durchgeführt, anhand dessen die Casein Kinase 2 (CK2) als eine der aktivsten Kinasen in Tregs identifiziert wurde (Daten freundlicherweise von Prof. Dr. Tobias Bopp bereitgestellt). rnBasierend auf den Ergebnissen des Kinomarrays wurde in dieser Arbeit die Funktion der CK2 in Tregs untersucht. Dabei konnte in in vitro Experimenten die Treg-vermittelte Suppression durch den pharmakologische CK2 Inhibitor DMAT aufgehoben werden. Weil derartige Inhibitoren jedoch nicht absolut spezifisch die Aktivität nur einer Kinase supprimieren, wurden außerdem Mäuse mit konditionalem „knockout“ der CK2β Untereinheit spezifisch in Tregs gekreuzt (CK2βTreg-/- Mäuse). Die Analyse dieser Tiere offenbarte eine essenzielle Beteiligung der CK2 an den suppressiven Funktionen von Tregs. So entwickeln CK2βTreg-/- Mäuse mit zunehmendem Alter Splenomegalien und Lymphadenopathien, von denen in besonderem Maße die Mukosa-assoziierten Lymphknoten betroffen sind. Eine Analyse des Aktivierungsstatus der T-Zellen in den Tieren konnte zudem einen erhöhten Anteil sogenannter Effektor-Gedächtnis T-Zellen aufdecken, die charakteristische Merkmale eines Th2 Phänotyps zeigten. Erhöhte Titer des Antikörperisotyps IgE in den Seren von CK2βTreg-/- Mäusen suggerieren zusätzlich eine fehlerhafte Suppression speziell Th2-vermittelter Immunantworten durch CK2β-defiziente Tregs. In Th2-vermittelten Asthma Experimenten in vivo konnte der Verdacht der fehlerhaften Kontrolle von Th2-Antwort bestätigt werden, wobei zusätzlich aufgedeckt wurde, dass bereits unbehandelte CK2βTreg-/- Mäuse Zeichen einer Entzündungsreaktion in der Lunge aufweisen. Bei der Suche nach den molekularen Ursachen der fehlerhaften Suppression Th2-vermittelter Immunantworten durch CK2β-defiziente Tregs konnten zwei mögliche Erklärungsansätze gefunden werden. Zum einen zeigen CK2β-defiziente Tregs eine verringerte Expression von Foxp3, was, in Analogie zu Ergebnissen der Gruppe von R. Flavell (Wang Y.Y. Nature. 445, 766-770 (2007)), zu einer Konversion von Tregs zu Th2 Zellen und damit zur Entstehung eines Th2-basierten, autoimmunen Phänotyps führt. Des Weiteren weisen CK2β-defiziente Tregs eine reduzierte Expression des Transkriptionsfaktors IRF4 auf, der in Tregs entscheidend für die Kontrolle Th2-basierter Immunreaktionen ist (Zheng Y. Nature. 19; 351-356 (2009)). Die dargelegten Ergebnisse identifizieren die CK2 damit als Kinase, die entscheidend an der Treg-vermittelten Suppression speziell Th2-basierter Immunantworten beteiligt ist. Demnach könnten pharmakologische CK2 Inhibitoren beispielsweise dazu eingesetzt werden, um die Treg-vermittelte Suppression im Rahmen chronischer Parasiten-Infektionen aufzuheben. Die in CK2βTreg-/- Mäusen beobachtete Prävalenz der Funktion der CK2 für Mukosa-assoziierte Organe stellt dabei einen zusätzlichen Vorteil dar, weil systemische Nebenwirkungen, die durch die Blockade der Treg-vermittelte Suppression entstehen, zumindest in nicht-Mukosa-assoziierten Geweben nicht zu erwarten sind.rn