Funktionelle Charakterisierung der Protein-Kinase CK2 in der Suppression Th2-vermittelter Immunantworten durch regulatorische T-Zellen

Regulatorische T-Zellen (Tregs) leisten durch ihre suppressiven Eigenschaften einen essenziellen Beitrag zur Aufrechterhaltung der immunologischen Toleranz. Sie verhindern schädliche Immunreaktionen gegen Autoantigene, kommensale Bakterien, sowie harmlose Nahrungsmittel-bestandteile. Gleichzeitig gewährleisten sie die Entwicklung effektiver Immunantworten gegen eindringende Pathogene, wie z.B. Parasiten, Bakterien und Viren. Damit haben Tregs direkten Einfluss auf das Gleichgewicht zwischen Immunität und Toleranz. Fehler in der suppressiven Funktionsweise von Tregs begünstigen daher auf der einen Seite die Entstehung zahlreicher autoimmuner Erkrankungen und Allergien. Auf der anderen Seite können Tregs Immunreaktionen bei chronischen Infektionen reduzieren, sowie die Entstehung effektiver Immunantworten gegen Tumore hemmen. Ihre Beteiligung an der Ätiologie all dieser Krankheiten macht Tregs zu einem bedeutenden potenziellen Zielobjekt, um diese Krankheiten effektiv zu therapieren. Die Erweiterung des Grundwissens um die molekularen Mechanismen der Treg-vermittelten Suppression ist daher ein notwendiger Schritt bei der Entwicklung Treg-basierter Theraphieansätze. 2003 konnte mit Foxp3 ein Transkriptionsfaktor identifiziert werden, der maßgeblich die suppressiven Funktionen von Tregs steuert. Um weiteren Einblick in die der Suppression zugrundeliegenden Signalwege zu erhalten, wurde im Institut für Immunologie ein komparativer Kinomarray durchgeführt, anhand dessen die Casein Kinase 2 (CK2) als eine der aktivsten Kinasen in Tregs identifiziert wurde (Daten freundlicherweise von Prof. Dr. Tobias Bopp bereitgestellt). rnBasierend auf den Ergebnissen des Kinomarrays wurde in dieser Arbeit die Funktion der CK2 in Tregs untersucht. Dabei konnte in in vitro Experimenten die Treg-vermittelte Suppression durch den pharmakologische CK2 Inhibitor DMAT aufgehoben werden. Weil derartige Inhibitoren jedoch nicht absolut spezifisch die Aktivität nur einer Kinase supprimieren, wurden außerdem Mäuse mit konditionalem „knockout“ der CK2β Untereinheit spezifisch in Tregs gekreuzt (CK2βTreg-/- Mäuse). Die Analyse dieser Tiere offenbarte eine essenzielle Beteiligung der CK2 an den suppressiven Funktionen von Tregs. So entwickeln CK2βTreg-/- Mäuse mit zunehmendem Alter Splenomegalien und Lymphadenopathien, von denen in besonderem Maße die Mukosa-assoziierten Lymphknoten betroffen sind. Eine Analyse des Aktivierungsstatus der T-Zellen in den Tieren konnte zudem einen erhöhten Anteil sogenannter Effektor-Gedächtnis T-Zellen aufdecken, die charakteristische Merkmale eines Th2 Phänotyps zeigten. Erhöhte Titer des Antikörperisotyps IgE in den Seren von CK2βTreg-/- Mäusen suggerieren zusätzlich eine fehlerhafte Suppression speziell Th2-vermittelter Immunantworten durch CK2β-defiziente Tregs. In Th2-vermittelten Asthma Experimenten in vivo konnte der Verdacht der fehlerhaften Kontrolle von Th2-Antwort bestätigt werden, wobei zusätzlich aufgedeckt wurde, dass bereits unbehandelte CK2βTreg-/- Mäuse Zeichen einer Entzündungsreaktion in der Lunge aufweisen. Bei der Suche nach den molekularen Ursachen der fehlerhaften Suppression Th2-vermittelter Immunantworten durch CK2β-defiziente Tregs konnten zwei mögliche Erklärungsansätze gefunden werden. Zum einen zeigen CK2β-defiziente Tregs eine verringerte Expression von Foxp3, was, in Analogie zu Ergebnissen der Gruppe von R. Flavell (Wang Y.Y. Nature. 445, 766-770 (2007)), zu einer Konversion von Tregs zu Th2 Zellen und damit zur Entstehung eines Th2-basierten, autoimmunen Phänotyps führt. Des Weiteren weisen CK2β-defiziente Tregs eine reduzierte Expression des Transkriptionsfaktors IRF4 auf, der in Tregs entscheidend für die Kontrolle Th2-basierter Immunreaktionen ist (Zheng Y. Nature. 19; 351-356 (2009)). Die dargelegten Ergebnisse identifizieren die CK2 damit als Kinase, die entscheidend an der Treg-vermittelten Suppression speziell Th2-basierter Immunantworten beteiligt ist. Demnach könnten pharmakologische CK2 Inhibitoren beispielsweise dazu eingesetzt werden, um die Treg-vermittelte Suppression im Rahmen chronischer Parasiten-Infektionen aufzuheben. Die in CK2βTreg-/- Mäusen beobachtete Prävalenz der Funktion der CK2 für Mukosa-assoziierte Organe stellt dabei einen zusätzlichen Vorteil dar, weil systemische Nebenwirkungen, die durch die Blockade der Treg-vermittelte Suppression entstehen, zumindest in nicht-Mukosa-assoziierten Geweben nicht zu erwarten sind.rn

Regulatory T cells (Treg) play a pivotal role in the maintenance of peripheral, immunological tolerance. With their suppressive capacities they control harmfull immune responses against self-antigens, commensal bacteria as well as food- and environmental-antigens. Furthermore they ensure the development of an effective immune response against pathogens, e.g. parasites, bakteria and viruses. To this end Tregs directly influence the balance between tolerance and immunity. Defects in Treg-mediated suppression favor the development of autoimmune diseases as well as allergy. On the other hand, Tregs can protect tumors from the detection by the immune system. All together this makes Tregs promising targets in order to develop Treg-based strategies to treat all of these diseases. Hence, the knowledge of the underlying molecular mechanisms of Treg-mediated suppression is of great importance. To get further insights into Treg cell biology we performed kinome arrays comparing the activity of several kinases in Tregs and conventional T cells (Tcon). In this kinome array we identified the Casein Kinase 2 (CK2) as one of the most abundantly active kinases in Tregs (data were kindly provided by Prof. T. Bopp).rnBased on the results of this kinome array the aim of this thesis was to characterize the function of the CK2 in Tregs. Using classical in vitro suppression assays we were able to abolish Treg-mediated suppression using the pharmacological CK2 inhibitor DMAT. Since these kinase inhibitors are not absolutely specific, we crossed conditional knockout mice, with Treg-specific deletion of the regulatory CK2β subunit (CK2βTreg-/- mice). Analysis of these animals revealed an essential role of the CK2 in the suppressive functions of Tregs. During growing up CK2βTreg-/- mice develop spontaneous splenomegalie and lymphadenopathie, mostly affecting the mucosal lymph nodes. T-cells from these mice show a massive increased proportion of effector memory T-cells, with strong characteristics of an T helper cell type 2 (Th2) phenotype. Furthermore we were able to detect increased titers of IgE antibodies in the sera of CK2βTreg-/- mice, indicating for a defective control of Th2 mediated immune response by CK2β deficient Tregs. Using experimental, murine asthma models we were able to confirm this defect in a Th2 based disease model in vivo. Additionally we detected strong lung-inflammation even in untreated CK2βTreg-/- mice. rnFinally we were able to find two possible molecular causes for the observed Th2-mediated autoimmune pathology. First, we detected a reduced expression of the Treg-specific master transcription factor Foxp3 in CK2β deficient Tregs. In accordance to the results from Richard Flavells group (Wang Y.Y. Nature. 445, 766-770 (2007)) this reduced Foxp3 expression could result in the conversion of these Tregs to Th2 cells and subsequently to the development of a Th2 mediated autoimmune phenotype. Second, we observed a reduced expression of the transcription factor IRF4 in CK2β deficient Tregs. IRF4 was shown to play a crucial role in the Treg-mediated control of Th2 responses (Zheng Y. Nature. 19; 351-356 (2009)).rnAll together in this thesis I could identify the CK2 as a kinase, crucially involved in the Treg-mediated suppression of Th2-based immune responses. Hence pharmacological CK2 inhibitors could by potentially useful for treatment of chronic parasitic infections. The prevalence for the function of CK2 in Tregs towards mucosal tissues might be an additional advantage, because harmful, systemic side effects should be reduced.rn