Generation and characterisation of acute myeloid leukaemia-reactive CD4 + T cells and their potential to eliminate human leukaemia blasts in NSG mice

Acute myeloid leukaemia (AML) is a cancer of the haematopoietic system, which can in many cases only be cured by haematopoietic stem cell transplantation (HSCT) and donor lymphocyte infusion (DLI) (Burnett et al., 2011). This therapy is associated with the beneficial graft-versus-leukaemia (GvL) effect mediated by transplanted donor T and NK cells that either recognise mismatch HLA molecules or polymorphic peptides, so-called minor histocompatibility antigens, leukaemia-associated or leukaemia-specific antigens in the patient and thus eliminate remaining leukaemic blasts. Nevertheless, the mature donor-derived cells often trigger graft-versus-host disease (GvHD), leading to severe damages in patients’ epithelial tissue, mainly skin, liver and intestine (Bleakley & Riddell, 2004). Therefore, approaches for the selective mediation of strong GvL effects are needed, also in order to prevent relapse after transplantation. One promising opportunity is the in vitro generation of AML-reactive CD4+ T cells for adoptive transfer. CD4+ T cells are advantageous compared to CD8+ T cells, as HLA class II molecules are under non-inflammatory conditions only expressed on haematopoietic cells; a fact that would minimise GvHD (Klein & Sato, 2000). In this study, naive CD4+ T cells were isolated from healthy donors and were successfully stimulated against primary AML blasts in mini-mixed lymphocyte/leukaemia cell cultures (mini-MLLC) in eight patient/donor pairs. After three to seven weekly restimulations, T cells were shown to produce TH1 type cytokines and to be partially of monoclonal origin according to their TCR Vβ chain usage. Furthermore, they exhibited lytic activity towards AML blasts, which was mediated by the release of granzymes A and B and perforin. The patient/donor pairs used in this study were fully HLA-class I matched, except for one pair, and also matched for HLA-DR and -DQ, whereas -DP was mismatched in one or both alleles, reflecting the actual donor selection procedure in the clinic (Begovich et al., 1992). Antibody blocking experiments suggested that the generated CD4+ T cells were directed against the HLA-DP mismatches, which could be confirmed by the recognition of donor-derived lymphoblastoid cell lines (LCLs) electroporated with the mismatched DP alleles. Under non-inflammatory conditions primary fibroblasts did not express HLA-DP and were thus not recognised, supporting the idea of a safer application of CD4+ T cells regarding induction of GvHD. For the assessment of the biological significance of these T cells, they were adoptively transferred into NSG mice engrafted with human AML blasts, where they migrated to the bone marrow and lymphoid tissue and succeeded in eliminating the leukaemic burden after only one week. Therefore, AML-reactive CD4+ T cells expanded from the naive compartment by in vitro stimulation with primary leukaemia blasts appear to be a potent tool for DLI in HSCT patients and promise to mediate specific GvL effects without causing GvHD.

Bei der akuten myeloischen Leukämie (AML) handelt es sich um eine Krebserkrankung des blutbildenden Systems, welche in vielen Fällen nur mit Hilfe einer hämatopoetischen Stammzelltransplantation (HSZT) und einer Donor-Lymphozyten-Infusion (DLI) geheilt werden kann. Diese Art der Therapie ist mit dem nützlichen Transplantat-gegen-Leukämie-Effekt (graft-versus-leukaemia, GvL) assoziiert, der durch transplantierte T- und NK-Zellen vermittelt wird. Diese Zellen erkennen mismatch HLA-Moleküle oder polymorphe Peptide, sogenannte Minor-Histokompatibilitätsantigene, Leukämie-assoziierte oder -spezifische Antigene im Patienten und eliminieren verbleibende Leukämie-Blasten. Nichtsdestotrotz lösen die ausgereiften, vom Donor stammenden Zellen oft eine Transplantat-gegen-Wirt-Erkrankung (graft-versus-host disease, GvHD) aus, was zu schweren Schäden von Leber, Haut und Gastrointestinaltrakt des Patienten führen kann. Daher werden dringend neue Therapien benötigt, die einen starken, selektiven GvL-Effekt vermitteln, auch um ein Rezidiv nach einer Transplantation zu vermeiden. Eine erfolgversprechende Möglichkeit stellen dabei in vitro-generierte AML-reaktive CD4+ T Zellen dar, welche im Vergleich zu CD8+ T-Zellen von Vorteil sind, da HLA-Klasse-II-Moleküle unter nicht-entzündlichen Bedingungen nur auf hämatopoetischen Zellen exprimiert werden; eine Tatsache, die das GvHD-Risiko minimiert. In dieser Arbeit wurden CD4+ T-Zellen von gesunden Spendern isoliert und erfolgreich gegen primäre AML-Blasten in acht Patienten/Spender-Paaren stimuliert. Nach drei bis sieben wöchentlichen Restimulationen konnte gezeigt werden, dass die T-Zellen TH1-Zytokine produzieren und teilweise monoklonalen Ursprungs waren, was anhand ihrer TCR-Vβ-Ketten gezeigt werden konnte. Darüber hinaus lysierten sie AML-Blasten durch die Freisetzung von GranzymA und B und Perforin. Die in dieser Arbeit verwendeten Patienten/Spender-Paare stimmten, mit einer Ausnahme, sowohl in ihren HLA-Klasse-I-Molekülen überein als auch in HLA-DR und -DQ, wohingegen sich -DP in einem oder beiden Allelen unterschied. Dies spiegelt den tatsächlichen Donor-Selektionsprozess in der Klinik wider. Blockade-Experimente mit Hilfe von Antikörpern zeigten, dass die CD4+ T-Zellen vermutlich gegen diese Unterschiede in HLA-DP gerichtet waren, was bestätigt werden konnte, da lymphoblastoide Zelllinien des Spenders, welche mit den jeweiligen DP-Allelen elektroporiert wurden, erkannt wurden. Unter nicht-entzündlichen Bedingungen exprimierten primäre Fibroblasten kein HLA-DP und wurden daher nicht erkannt, was die Hypothese stärkt, dass CD4+ T-Zellen, im Hinblick auf das GvHD-Risiko, eine sichere Anwendung finden könnten. Um die biologische Signifikanz dieser T-Zellen zu beurteilen, wurden sie adoptiv in NSG-Mäuse transferiert, welchen vorher humanen AML-Blasten transplantiert wurden. Die T-Zellen wanderten in Knochenmark und Lymphgewebe und eliminierten die Leukämielast nach nur einer Woche. Zusammengefasst scheinen AML-reaktive CD4+ T-Zellen, welche durch in vitro-Stimulation mit primären Leukämie-Blasten expandiert wurden, eine vielversprechende Möglichkeit für DLI von HSZT-Patienten darzustellen, da sie einen spezifischen GvL-Effekt vermitteln ohne GvHD zu verursachen.