Optimization of lipase production from yeasts strains isolated from olive mil wastewater

Dissertação submetida à Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências para a obtenção do Grau de Mestre em Microbiologia Aplicada.

Otimização da produção biotecnológica de lipases e correlação com a produção de biossurfactantes

As lipases e os biossurfactantes são compostos produzidos por microrganismos através de fermentações em estado sólido (FES) ou sumberso (FSm), os quais são aplicáveis nas indústrias alimentícia e farmacêutica, na bioenergia e na biorremediação, entre outras. O objetivo geral deste trabalho foi otimizar a produção de lipases através de fermentação em estado sólido e fermentação submersa. Os fungos foram selecionados quanto à habilidade de produção de lipases através de FES e FSm e aqueles que apresentaram as maiores atividades lipolíticas foram utilizados na seleção de variáveis significativas e na otimização da produção de lipases nos dois modos de cultivo. Foram empregadas técnicas seqüenciais de planejamento experimental, incluindo planejamentos fracionários, completos e a metodologia de superfície de resposta para a otimização da produção de lipases. As variáveis estudadas na FES foram o pH, o tipo de farelo como fonte de carbono, a fonte de nitrogênio, o indutor, a concentração da fonte de nitrogênio, a concentração do indutor e a cepa do fungo. Na FSm, além das variáveis estudadas na FES, estudaram-se as variáveis concentração inicial de inóculo e agitação. As enzimas produzidas foram caracterizadas quanto à temperatura e pH ótimos e quanto à estabilidade a temperatura e pH. Nas condições otimizadas de produção de lipases, foi avaliada a correlação entre a produção de lipases e bioemulsificantes. Inicialmente foram isolados 28 fungos. Os fungos Aspergillus O- 4 e Aspergillus E-6 foram selecionados como bons produtores de lipases no processo de fermentação em estado sólido e os fungos Penicillium E-3, Trichoderma E-19 e Aspergillus O-8 como bons produtores de lipases através da fermentação submersa. As condições otimizadas para a produção de lipases através de fermentação em estado sólido foram obtidas utilizando-se o fungo Aspergillus O-4, farelo de soja, 2% de nitrato de sódio, 2% de azeite de oliva e pHs inferiores a 5, obtendo-se atividades lipolíticas máximas de 57 U. As condições otimizadas para a produção de lipases na fermentação submersa foram obtidas utilizando-se o fungo Aspergillus O-8, farelo de trigo, 4,5% de extrato de levedura, 2% de óleo de soja e pH 7,15. A máxima atividade obtida durante a etapa de otimização foi 6 U. As lipases obtidas por FES apresentaram atividades máximas a 35ºC e pH 6,0, enquanto que as obtidas por FSm apresentaram ótimos a 37ºC e pH 7,2. A estabilidade térmica das lipases produzidas via FSm foi superior a das lipases obtidas via FES, com atividades residuais de 72% e 26,8% após 1h de exposição a 90ºC e 60ºC, respectivamente. As lipases obtidas via FES foram mais estáveis em pH´s alcalinos, com atividades residuais superiores a 60% após 24 h de exposição, enquanto as lipases produzidas via FSm foram mais estáveis em pH´s ácidos, com 80% de atividade residual na faixa de pH entre 3,5 e 6,5. Na fermentação submersa a correlação entre a produção de lipases e a atividade emulsificante óleo em água (O/A) e água em óleo (A/O) dos extratos foi 95,4% e 86,8%, respectivamente, obtendo-se atividades emulsificantes máximas O/A e A/O de 2,95 UE e 42,7 UE. Embora a maior produção de lipases tenha sido obtida na fermentação em estado sólido, não houve produção concomitante de biossurfactantes. Os extratos da fermentação submersa apresentaram redução da tensão superficial de 50 mN m -1 para 28 mN m -1 e atividade antimicrobiana frente ao microrganismo S. aureus ATCC 25923, com potenciais antimicrobianos de 36 a 43% nos três primeiros dias de fermentação. A fermentação submersa foi a técnica que apresentou os melhores resultados de otimização da produção de lipases, bem como de produção simultânea de biossurfactantes.

Desenvolvimento de um iogurte suplementado com Spirulina platensis: aaracterização físico-química, microbiológica e sensorial

O iogurte é um produto lácteo que é obtido a partir da acidificação controlada ou espontânea do leite, sendo o seu processo de fermentação desencadeado pela ação de culturas láticas. Este produto apresenta propriedades benéficas para a saúde, como é o caso da regulação do balanço da microflora intestinal, melhoramento da resposta imunitária, redução dos sintomas alérgicos, redução do colesterol sérico e níveis séricos de glicose. Em relação à alga S. platensis, esta apresenta benefícios cardiovasculares, é eficaz no tratamento de certas alergias, cancro, doenças virais, hiperglicemia, imunodeficiência e processos inflamatórios. Esta dissertação teve como objetivo desenvolver um iogurte suplementado com a microalga Spirulina platensis, com posterior caracterização do produto final, em termos físico-químicos, microbiológicos e sensoriais. Foram efetuadas várias experiências de receitas de iogurte até chegar à formulação final, tendo sido testadas diversas variantes. Na avaliação da qualidade físico-química, o iogurte produzido com Spirulina apresentou ao longo do tempo sempre valores mais elevados nos seguintes parâmetros: teor de proteína bruta, teor de lactose, teor de fibras e hidratos de carbono. Foram detetadas diferenças estatisticamente significativas entre os parâmetros e o tipo de iogurte nos seguintes casos: teor de matéria gorda, teor de proteína bruta, teor de humidade, hidratos de carbono, valor energético e pH. Foram detetadas diferenças estatisticamente significativas entre os parâmetros e o tempo de produção apenas no teor de cinzas. Na avaliação da qualidade microbiológica, o iogurte produzido com Spirulina não se destacou por apresentar valores mais elevados. Quando avaliados os fatores tipo de iogurte e tempo de produção, não foram detetadas diferenças estatisticamente significativas em nenhum dos parâmetros microbiológicos. Na avaliação da qualidade sensorial, no iogurte produzido com leite meio gordo com lactose, foi possível verificar que todos os parâmetros sensoriais analisados e as amostras de iogurte são independentes. Em relação ao iogurte produzido com leite meio gordo sem lactose, verificou-se que os parâmetros doce e ácido não são independentes das amostras de iogurte. Em termos de preferência, 71% dos provadores escolheram o iogurte com agar. Relativamente à prova afetiva, não foram detetadas diferenças estatisticamente significativas entre a amostra preferida e qualquer um dos fatores avaliados (idade e género do provador). Em termos de preferência, 66% dos provadores escolheram o iogurte sem lactose. No que diz respeito à prova triangular, não foram detetadas diferenças estatisticamente significativas entre as escolhas da amostra diferente e amostra preferida em relação ao género do provador. Apesar de 63% dos provadores terem preferido a amostra com 0 dias, apenas 44% conseguiram distinguir entre o iogurte com 0 dias e com 30 dias, o que sugere que mesmo ao fim de 1 mês, o iogurte continua agradável. Com base em todos os resultados obtidos, conclui-se que o iogurte produzido com S. platensis é um produto inovador e saudável, pelos inúmeros benefícios presentes no iogurte, conjugados com os benefícios da microalga.

Produção enzimática de biodiesel a partir de resíduos agro-industriais usando a lipase imobilizada de origem microbiana

Trabalho Final de Mestrado para obtenção do grau de Mestre em Engenharia Química e Biológica

Improvement of the yeast slide culture technique

Este trabalho tem como objetivo melhorar a técnica de cultura em lâmina para ser usada na avaliação da viabilidade de leveduras sob diferentes condições fisiológicas. Inicialmente, foram otimizadas as condições ideais para o cultivo em lâmina de uma estirpe laboratorial (BY4741) e de uma estirpe industrial (NCYC 1214) da levedura Saccharomyces cerevisiae. O melhor protocolo foi obtido utilizando: YEPD agar com uma espessura de cerca de 2 mm; 20 μL de uma suspensão de 1 x 105 células/mL para a estirpe BY4741 ou de 5 x 104 células/mL para a estirpe NCYC 1214; uma câmara de humedecimento com 100 μL de água desionizada e um tempo de incubação de 24 h, a 25 ° C. Com o objetivo de facilitar a contagem das microcolónias, foi adicionado um corante (calcofluor white, CFW) ao meio YEPD agar. Ensaios preliminares, em YEPD líquido, contendo diferentes concentrações de CFW, permitiram verificar que o corante, até 5,0 μg/L, não inibe o crescimento da levedura. Uma concentração de 2,5 μg/L de CFW permitiu a coloração da parede das leveduras, não se observando células com morfologia alterada, sendo esta a concentração de CFW selecionado nos estudos subsequentes. A técnica de cultura em lâmina, com ou sem CFW, foi aplicada para avaliar a viabilidade de células saudáveis (células em fase exponencial de crescimento), células submetidas a stress de etanol [células expostas a 20% (v/v) de etanol, a 25 ºC, durante 2 h] e células envelhecidas (células incubadas em água, a 25 ° C, durante 48 h), da estirpe laboratorial. A percentagem de células viáveis não foi significativamente diferente entre as duas técnicas (com ou sem CFW), após uma incubação de 24 horas. Finalmente, a técnica de cultura de lâmina, contendo CFW, foi comparada com duas técnicas habitualmente usadas na indústria cervejeira: fermentação de curta duração e determinação da percentagem de células gemuladas. Os resultados obtidos através da técnica de cultura de lâmina, desenvolvida, seguem um padrão similar aos obtidos nos ensaios de fermentação de curta duração e aos da determinação da percentagem de células gemuladas. Os resultados obtidos sugerem que a técnica de cultura em lâmina, combinada com CFW, parece ser uma alternativa, fácil, rápida (em 24 h) e reprodutível, relativamente ao método convencional (técnica de plaqueamento), para a avaliação da viabilidade de células de levedura. Deverá ser realizado trabalho adicional a fim de validar o método com estirpes industriais.

Conversão da lactose e síntese de galacto-oligossacarídeos: uma abordagem experimental e teórica

O presente trabalho avaliou, na etapa experimental, um processo simultâneo de catálise e fermentação láctica visando obter um iogurte com potenciais características nutracêuticas e, na sua etapa teórica, estabeleceu uma interlocução entre a vivência experimentalista e a teoria da cinética enzimática, no que se refere à conversão da lactose e à síntese de galactooligossacarídeos (GOS). Na abordagem experimental, para um substrato específico, avaliouse biocatálise conduzida simultaneamente à fermentação, defasando a adição da enzima em relação ao início do processo fermentativo. A fermentação foi realizada a partir de cultura láctica liofilizada comercial contendo dois micro-organismos probióticos, Bifidobacterium animalis e Lactobacillus acidophilus, associados aos micro-organismos característicos do iogurte, Lactobacillus bulgaricus e Streptococcus thermophilus. Foi utilizado um preparado enzimático contendo -galactosidases obtidas de duas origens distintas: Kluyveromyces lactis e Aspergillus niger. Foram avaliados os efeitos da concentração da enzima e do tempo de adição da enzima em um planejamento experimental 2 2 . As respostas foram às concentrações, ao final do processo, de lactose, de GOS, de glicose e de galactose e a hidrólise dos galactooligossacarídeos ao longo do tempo. No que se refere à abordagem teórica, o presente trabalho considerou modelos matemáticos de hidrólise de dissacarídeos e conversão da lactose, em que a inibição foi representada a partir do incremento da concentração dos produtos da reação. No que se refere à conversão da lactose e síntese de GOS, o presente trabalho buscou estabelecer um modelo matemático em que a inibição ocorreu por efeito do incremento das concentrações de glicose e de galactose, comparando-o com os modelos conhecidos na literatura. Verificou-se que o desempenho do modelo obtido no presente trabalho foi robusto em relação às premissas estabelecidas. Na comparação com resultados experimentais de conversão enzimática, o modelo mostrou-se capaz de minimizar o erro e de ajustar-se aos dados experimentais.

Desenvolvimento e caracterização do queijo Santo Giorno, típico do sudoeste do Paraná, produzido com leite cru e fermento endógeno

Two cheese formulations made from raw milk and endogenous yeasts with 30, 60 and 180 days of maturation in two dairy Paraná Southwest were studied to evaluate their quality through physical, physical-chemical, microbiological and sensorial characteristics, as one of the stages of development of a typical regional cheese. The production was accompanied from designing the flowchart processing, where the samples were collected to perform the analysis of proteins, lipids, moisture, ash, carbohydrates, total solids, fat in dry matter, calories; water activity, instrumental texture (hardness, adhesiveness, springiness, cohesiveness, resiliency and chewiness), instrumental color (CIE Lab); microbiological quality was assessed searching for total and thermotolerant coliforms, coagulase positive staphylococci and Salmonella spp.; the acceptance related to sensory characteristics of color, appearance, flavor, texture, taste and purchase intent was evaluated through the structured hedonic scale. This research contributed information relevant to the production process, such as the realization of the viability in freeze-drying lactic acid bacteria yeast isolated from milk in the Southwestern Mesoregion of Parana and the results of the analysis of the cheese showed similarity between formulations, regarding the physical, physical-chemical characterization, moreover good microbiological quality, where the differences between samples of dairy products were not perceived by sensory panelists. Adjustments in standardization related to technological quality control is an extremely important factor for the success of dairy companies and small producers involved in the project and that they have the option of producing the Santo Giorno, a fine cheese, with the great advantage of adding features of region, with high standard of sanitary conditions and with great consumer acceptance of indicative.

Síntese de carboidratos por microalgas e produção de bioetanol

A maior parte da energia hoje consumida no mundo é derivada de fontes como petróleo, carvão e gás natural. Essas fontes, no entanto, não são renováveis e podem se esgotar em data futura. Nas últimas décadas, as fontes renováveis de combustíveis de base biológica, em especial o bioetanol, têm sido consideradas como alternativa à matriz energética convencional. Porém, existe a necessidade de ampliação da oferta de matérias-primas para produção de etanol, sem pressionar a área plantada para produção de alimentos, o que tem levado empresas e países a investirem em pesquisas para maior utilização de outras matériasprimas. As microalgas surgem como uma das alternativas mais promissoras para a produção de bioetanol, sendo que modificações nas condições de cultivo podem propiciar incremento na concentração de carboidratos destas. Neste contexto, o objetivo deste trabalho foi avaliar a influência da concentração de nutrientes na concentração de carboidratos de microalgas e produzir bioetanol a partir destas. Avaliou-se a síntese de carboidratos das microalgas Chlorella homosphaera e Spirulina platensis LEB 52 em cultivos mixotróficos com diferentes concentrações do componente nitrogenado e cloreto de sódio adicionados aos meios de cultivo. Para a microalga Chlorella minutissima, foram avaliados os efeitos do meio de cultivo e das concentrações dos componentes nitrogenado e fosfatados utilizados no meio de cultivo da microalga sobre a concentração de carboidratos desta. Foram realizadas fermentações alcoólicas utilizando como substrato biomassa das microalgas Chlorella pyrenoidosa e Spirulina sp. LEB 18 acrescidos de glicose e sacarose. Para a microalga Chlorella homosphaera, a maior produtividade em carboidratos foi obtida nos ensaios realizados com a maior concentração de KNO3 com menor concentração de NaCl e menor concentração de KNO3 com maior concentração de NaCl (0,014±0,001 g.L-1 .d-1 e 0,015±0,002 g.L-1 .d-1 , respectivamente). A maior produtividade em carboidratos nos cultivos de Spirulina platensis LEB 52 (0,116±0,002 g.L-1 .d-1 ) foi verificada no experimento no qual a microalga foi cultivada nas menores concentrações de NaNO3 e NaCl. A microalga Spirulina platensis LEB 52 apresentou maior produtividade em carboidratos quando comparada à microalga Chlorella homosphaera. A microalga Chlorella minutissima cultivada em meio Basal, com adição de 0,125 g.L-1 do componente nitrogenado (KNO3) e sem adição dos componentes fosfatados (K2HPO4 e KH2PO4) apresentou a maior produtividade em carboidratos nos cultivos (0,030±0,002 g.L-1 .d-1 ). O ensaio com biomassa de Spirulina sp. LEB 18 com adição de glicose apresentou eficiência superior na formação de etanol e produtividade em etanol (68,487±2,592% e 1,182±0,051g.L-1 .h-1 , respectivamente).

Avaliação do potencial probiótico de leveduras isoladas de azeitonas de mesa da cultivar Negrinha de Freixo

Probióticos são definidos como microrganismos vivos, que quando administrados em quantidades adequadas, conferem benefícios à saúde do hospedeiro. Atualmente a pesquisa de microrganismos probióticos a partir da fermentação da azeitona tem-se centrado nas bactérias ácido-lácticas, sendo escassos os estudos envolvendo leveduras. No presente trabalho avaliou-se o potencial probiótico de estirpes de leveduras previamente isoladas durante o processo de fermentação natural de azeitona de mesada cultivar Negrinha de Freixo. Foram avaliadas 16 estirpes em relação à atividade enzimática (catalase, amilase, xilanase, protease e β-glucosidase); ao crescimento a 37ºC; ação inibitória frente a microrganismos patogénicos; capacidade de autoagregação; atividade antioxidante (utilizando o método de DPPH); e resistência ao aparelho digestivo humano, a partir de uma simulação in vitro da digestão gástrica e pancreática. Os resultados apresentados para a atividade enzimática indicaram que em alguns isolados foi detetado fraca atividade das enzimas protease, xilanase e amilase. Já uma atividade forte de lipase foi observada nas estirpes Pichia manshurica e Saccharomyces cerevisiae (15A e 15B). Para a enzima β-glucosidase, identificou-se atividade forte em Rhodotorula graminis, Rhodotorula glutinis, Candida norvegica, Pichia guilliermondii e Galactomyces reessii. Relativamente à capacidade de crescimento à temperatura corporal (37ºC), três estirpes (Saccharomyces cerevisiae 15B; Candida tropicalis 1A; e Pichia membranifaciens 29A) destacaram-se por apresentar maior taxa específica de crescimento. A capacidade bloqueadora dos radicais livres DPPH foi verificada em 10 estirpes, sendo as estirpes de S. cerevisiae as que mais se destacaram dentre as outras. As estirpes C. norvegica e G. reessii (34A) apresentaram capacidade antifúngica frente ao microrganismo patogénico Cryptococcus neoformans. Em relação à capacidade de autoagregação avaliada, as estirpes S. cerevisiae (15A), Candida tropicalis (1A) e C. norvegica (7A) apresentaram ao fim de 24 horas percentagens superiores a 80%. Relativamenteà resistência frente às condições presentes no trato gastrointestinal in vitro, a estirpe P. guilliermondii (25A), destacou-se dentre as demais, por apresentar maior capacidade de sobrevivência em todo o processo digestivo simulado. As estirpes Candida boidinii (37A) e S. cerevisiae (15A) apresentaram menor capacidade de sobrevivência nestas condições. Contudo, serão necessários testes adicionais para complementar estes resultados.

Effect of commercial starter cultures and native yeasts on ochratoxin a production by aspergillus westerdijkiae and penicillium nordicum in meat products

Processed meat products are of worldwide importance and, because of their intrinsic factors as well as the processing methods, they are highly prone to fungal and mycotoxin contamination. Ochratoxin A (OTA) is the most significant mycotoxin in processed meat products. Penicillium nordicum is considered to be responsible for OTA contamination of meat products, as it is highly adapted to salt and protein-rich matrices and is moderately psycrotrophic. However, another OTA-producing fungus, Aspergillus westerdijkiae, adapted to carbon-rich matrices such as cereals and coffee beans, has been recently associated with high levels of OTA in meat products. Several Lactic Acid Bacteria (LAB) and yeasts have been tested as biocontrol agents against P. nordicum growth and OTA production in meat products, with promising results, but none of the studies have considered A. westerdijkiae. The aim of this work was to evaluate in vitro the effect of a commercial starter culture used in sausage fermentation and four yeasts isolated from dry-cured sausage on these two OTA-producing fungi, both in terms of fungal growth and of OTA production, using different meat-based culture media as model systems. The mechanisms underlying the observed effect were also studied. For this purpose, C. krusei, C. zeylanoides, R. mucilaginosa, R. glutinis, a mix of these yeasts and the starter culture were co-inoculated with P. nordicum and A. westerdijkiae in industrial sausage, traditional sausage, and ham-based media, under conditions of water activity, salt concentration and temperature that mimic real conditions at beginning and end of sausage curing process. Fungal growth was determined by measuring colony diameter, and OTA production was quantified by HPLC-FLD after extraction with methanol. Yeasts where found to inhibit significantly the growth of both fungi. P. nordicum was unable to produce detectable OTA in both sausage-based media under any condition. In ham, yeasts reduced OTA production, while the starter culture significantly increased it. Unexpectedly, OTA production by A. westerdijkiae was significantly stimulated in all media tested by all microorganisms. Matrix has a significant effect on OTA production by P. nordicum, but not by A. westerdijkiae, for which only temperature showed to have effect. By testing the mechanisms of action by which starter culture and C. zeylanoides influenced fungal responses, we were able to determine that direct contact and simultaneous growth of test organisms were the mechanisms more significantly involved in the responses. In conclusion, ochratoxigenic fungi do not all respond to antagonistic microorganisms in the same way. The use of biocontrol agents with the intent of reducing fungal growth and mycotoxin production by one fungus can have unexpected effects on others, thus leading to unforeseen safety problems. Further experiments are recommended to properly understand the reasons behind the different effects of microorganisms, to ensure their safe as biocontrol agents.

Aditivos químicos e biológicos na ensilagem de cana-de-açúcar: 1. composição química das silagens, ingestão, digestibilidade e comportamento ingestivo

Avaliou-se o efeito da inclusão de aditivos na ensilagem de cana-de-açúcar (Saccharum officinarum L.) sobre a composição químico-bromatológica das silagens, o comportamento ingestivo, o consumo voluntário e a digestibilidade em bovinos de corte. Utilizaram-se cinco novilhos da raça Nelore providos de cânula ruminal, alocados em delineamento quadrado latino 5 ´ 5 e alimentados com dietas com 65% de volumoso na MS. Foram avaliadas cinco silagens (base úmida): controle - cana-de-açúcar sem aditivos; uréia - cana-de-açúcar + 0,5% uréia; benzoato - cana-de-açúcar + 0,1% de benzoato de sódio; LP - cana-de-açúcar inoculada com Lactobacillus plantarum (1 ´ 10(6) ufc/g MV); LB - cana-de-açúcar inoculada com L. buchneri (3,6 ´ 10(5) ufc/g forragem). A forragem foi armazenada em silos do tipo poço por 90 dias antes do fornecimento aos animais. A composição químico-bromatológica da cana-de-açúcar foi alterada após a ensilagem, em relação à cana-de-açúcar original, com redução no teor de carboidratos solúveis e na digestibilidade in vitro e elevação relativa nos teores de FDN e FDA. Os teores de etanol (0,30% da MS) e ácidos orgânicos (0,99% de ácido lático e 2,31% de acético) foram baixos e semelhantes entre as silagens. Os aditivos aplicados na ensilagem não promoveram alterações no consumo e na digestibilidade aparente da MS (7,2 kg/dia e 63,6%, respectivamente). O comportamento ingestivo dos animais também não foi alterado, com tempos médios de 230,6; 519,6 e 672,8 minutos/dia despendidos com ingestão de ração, ruminação e ócio, respectivamente. Os aditivos acrescidos à cana-de-açúcar promoveram pequenas alterações na maioria das variáveis avaliadas.

Quantificação do ião cálcio nas uvas e vinhos brancos por espectroscopia de infravermelho

Com o objetivo de diminuir a incidência das leveduras encapsulas em alginato se aglomerarem na segunda fermentação em garrafa e reduzir custos associados à sua eliminação, pretendeu-se utilizar a metodologia NIR para determinar a quantidade de cálcio no vinho. Foram quantificados outros minerais para avaliar hipotéticos antagonismos iónicos. Observou-se também que este controlo de qualidade poderá ser efetuado no mosto. Atualmente este controlo é realizado por metodologias de análise de referência bastante morosas como EAA. Contudo a metodologia NIR demonstrou ser uma boa alternativa no controlo dos parâ-metros de qualidade na produção de vinho espumante, permitindo a diminuição do tempo de análise e de resíduos. No desenvolvimento dos modelos matemáticos para a calibração do NIR utilizaram-se 79 vinhos brancos e 60 amostras de mosto. Foram desenvolvidos 11 modelos de calibração onde o coeficiente de correlação foi, em aproximadamente 58% dos casos, maior que 0,99; ABSTRACT: In order to reduce the incidence of alginate beads aggregation during the second fermentation in the bottle and to reduce costs associated with their disposal, it was used the NIR technology to quantify calcium content in the wine. Other minerals were also quantified in order to evaluate possible ionic antagonisms. Quality control is usually done in the base wine but it can also be evaluated in the must. Currently this control was carried out by reference analysis methodologies generally rather slow as AAS. However NIR proved to be a good alternative technique in the control of quality parameters of wine production, allowing the reduction of the analysis time and waste. In order to develop mathematical models for the calibration of NIR it was used 79 white wine samples and 60 must samples. Eleven calibration models have been developed, where the correlation coeffi-cient was, in approximately 58% of cases, greater than 0,99.

Proteomic analysis of Rhizobium freirei PRF 81 responses to low pH.

Rhizobium freirei PRF 81 is employed in common bean commercial inoculants in Brazil, due to its outstanding efficiency in fixing nitrogen, competitiveness and tolerance to abiotic stresses. Among the environmental conditions faced by rhizobia in soils, acidity is perhaps the encountered most, especially in Brazil. So, we used proteomics based approaches to study the responses of PRF 81 to a low pH condition. R. freirei PRF 81 was grown in TY medium until exponential phase in two treatments: pH 6,8 and pH 4,8. Whole-cell proteins were extracted and separated by two-dimensional gel electrophoresis, using IPG-strips with pH range 4-7 and 12% polyacrilamide gels. The experiment was performed in triplicate. Protein spots were detected in the high-resolution digitized gel images and analyzed by Image Master 2D Platinum v 5.0 software. Relative volumes (%vol) of compared between the two conditions tested and were statistically evaluated (p ≤ 0.05). Even knowing that R. freirei PRF 81 can still grow in more acid conditions, pH 4.8 was chosen because didn´t affect significantly the bacterial growth kinetics, a factor that could compromise the analysis. Using a narrow pH range, the gel profiles displayed a better resolution and reprodutibility than using broader pH range. Spots were mostly concentrated between pH 5-7 and molecular masses between 17-95 kDa. From the six hundred well-defined spots analyzed, one hundred and sixty-three spots presented a significant change in % vol, indicating that the pH led to expressive changes in the proteome of R. freirei PRF 81. Of these, sixty-one were up-regulated and one hundred two was downregulated in pH 4.8 condition. Also, fourteen spots were only identified in the acid condition, while seven spots was exclusively detected in pH 6.8. Ninety-five differentially expressed spots and two exclusively detected in pH 4,8 were selected for Maldi-Tof identification. Together with the genome sequencing and the proteome analysis of heat stress, we will search for molecular determinants of PRF 81 related to capacity to adapt to stressful tropical conditions.