Produção enzimática de biodiesel a partir de resíduos agro-industriais usando a lipase imobilizada de origem microbiana

Trabalho Final de Mestrado para obtenção do grau de Mestre em Engenharia Química e Biológica

O presente trabalho teve como objectivo a optimização do cultivo de várias estirpes mutantes bacterianas Pseudomonas aeruginosa da estirpe AI3(P. aeruginosa AI3), estirpe Ph3B (P. aeruginosa Ph3B) e estirpe L10 (P. aeruginosa L10) e fúngicas (Phlebia rufa (PM), Ganoderma lucidum violeta(GV), Pleurotus ostreatus (PO) e Ganoderma carnosum (G)), para a produção da lipase a partir de resíduos agro-industriais com vista à produção de biodiesel. Em termos de optimização da produção da lipase de origem bacteriana, foi realizado um planeamento experimental organizado por um factorialcompleto de dois níveis em três factores, em duplicados, num total de oito experiências com o intuito de obter as melhores condições para a produção da lipase. Este planeamento foi concebido com dois níveis de temperatura (25ºC e 37ºC) e com dois níveis de meio de cultura (azeite e óleo usado) e de estirpe (AI3 e Ph3B) como variáveis categóricas. As melhores condições obtidas foram para o meio de cultura com azeite, a uma temperatura de 37ºC e utilizando a estirpe mutante Ph3B de P. aeruginosa. A actividade enzimática da lipase foi medida por espectrofotometria com base na hidrólise do p-nitrofenil palmitato (p-NPP) e o conteúdo de proteína no caldo de fermentação foi determinado pelo método de ligação do corante azul de Comassie. Posteriormente, foi realizado um estudo para a seleção das matrizes cromatográficas e das condições para optimização da purificação da lipase por cromatografia de afinidade com metal imobilizado (IMAC). Este estudo foi realizado em microplacas de 96 poços com diferentes resinas, diferentes quelatos de metal e lipases de várias estirpes microbianas. Foi verificado que os quelatos de cobre possuem uma maior afinidade pelas lipases, promovendo a sua retenção na matriz cromatográfica. De seguida, a lipase foi purificada por IMAC com diferentes resinascromatográficas. A lipase da estirpe mutante AI3 de P. aeruginosa foi purificada usando Sepharose 6B epoxi-activada com butanodiol-diglicidil éter- IDA-Cu (II), a pH 7 e com um gradiente de imidazole de 0 a 500 mM, obtendo-se uma actividade específica de 0.03 UI/mg, com um rendimento final de actividade de69% e um factor de purificação de 1.25. A mesma enzima foi purificada nas mesmas condições a pH 8, obtendose uma actividade específica de 0.0165 UI/mg, com um rendimento final de actividade de 265% e um factor de purificação de 2.66. Procedeu-se a uma electroferese em gel de poliacrilamida em condições desnaturantes com dodecilsulfato de sódio (SDS-PAGE) e a uma electroferese em gel de poliacrilamida em condições nativas (PAGE Nativa) da lipasepurificada da estirpe mutante AI3 de P. aeruginosa, obtendo-se uma massa molar de 42 kDa através da SDS-PAGE. Pela PAGE Nativa não se obteve bandas no gel de poliacrilamida. A lipase foi imobilizada em microplacas de 96 e de 24 poços com alginato de cálcio e com glutaraldeído (GA) tendo-se detectado actividade enzimática após a imobilização mas a sua perda de actividade enzimática foi significativa com o número de reutilizações. A produção de biodiesel foi realizada através da reacção de transesterificação de azeite ou óleos usados utilizando metanol (MeOH) na presença de um catalisador enzimático. Realizou-se o doseamento do glicerol e do biodiesel obtendo-se valores muito reduzidos de ambos. Para o doseamento do biodiesel utilizaram-se placas de cromatografia em camada fina (TLC) pois os métodos de fluorescência e os métodos colorimétricos não funcionaram e a cromatografia gasosa com detecção por espectrometria de massa (GC/MS) não estava disponível. Relativamente aos resultados da TLC, verifica-se que se obtêm melhores resultados, na produção de biodiesel, utilizando a suspensão celularcomo catalisador (em vez de se utilizar lipase livre ou imobilizada) na reação de transesterificação.

Abstract: This thesis aimed for the study of various bacterial and fungal mutant strains, Pseudomonas aeruginosa mutant strain AI3 (P. aeruginosa AI3), mutant strain Ph3B (P. aeruginosa Ph3B), mutant strain L10 (P. aeruginosa L10), Phlebia rufa (PM), Ganoderma lucidum violeta (GV), Pleurotus ostreatus(PO) and Ganoderma carnosum (G), respectively, for enzymatic biodiesel production from agro-industrial waste using immobilized lipase of microbial origin. In terms of bacterial lipase production optimization, we planned a fullfactorial of two levels of three factors, in duplicate, in a total of eightexperiments in order to understand what’s the best culture medium for determined strain, and the best temperature. This plan was designed with two temperature levels (25ºC and 37ºC) and two levels of medium (oil and used oil) and strain (AI3 and Ph3B) as categorical variables. The best conditions were obtained with a culture medium with oil at a temperature of 37ºC and using P. aeruginosa AI3. The enzymatic activity of the lipases was measured by spectrophotometry, based on the hydrolysis of p-nitrophenyl palmitate (p-NPP) producing p-nitrophenol and the protein assay in the fermentation broth was determined by protein assay methods with Coomassie blue. Subsequently, a study was conducted for the selection of chromatographic matrix and the conditions for lipase purification optimization by affinity chromatograpghy on immobilized metal (IMAC) in 96-well microplates. This study was performed with different resins, different metal chelates and lipases from various microbial strains. It was found that the copper chelate has a higher affinity for this lipases, promoting its retention on the chromatographic matrix. Then, the lipase was purified by IMAC in 5 ml columns with diferente chromatographic resins. Lipase AI3 mutant strain of P. aeruginosa was purified using the Sepharose 6B activated with epoxy-butanediol-diglycidyl ether- IDACu (II), at pH 7 and with an imidazole gradient of 0 to 500 mM, yielding a specific activity of 0.03 UI/mg with a final activity yield 69% and purification factor of 1.25. The same enzyme was purified in the same conditions at pH 8 to give a specific activity of 0.0165 UI/mg with a final yield of 265% activity, and a purification factor of 2.66. It proceeded to a polyacrylamide gel electrophoresis under denaturing conditions with sodium dodecyl sulfate (SDS-PAGE) and a polyacrylamide gel electrophoresis in native conditions (PAGE Native) with a purification lipase mutant strain AI3, yielding molecular mass of 42 kDa by SDS-PAGE. For Native PAGE we didn’t obtained bands in the polyacrylamide gel. Lipase was immobilized on microplate with 96wells and 24 wells with calcium alginate and glutaraldehyde (GA) having been detected a enzyme activity after the imobilization but its loss of activity is significantly with the number of reuses. The biodiesel production was performed by transesterification reaction using oil or used oils using methanol (MeOH) in the presence of an enzyme catalyst. The glycerol and biodiesel assay showed that we produced a small amount of biodiesel. We used chromatography plates in a thin layer (TLC) for the determination of biodiesel. We didn’t used difficult methods like gas chromatography with detection by mass spectrometry (GC / MS), fluorescence and colorimetric methods. For the TLC, the best results are obtained using cell suspension as catalyst in the transesterification reaction (instead of using a free or immobilized lipase).