Optimization of lipase production from yeasts strains isolated from olive mil wastewater

Dissertação submetida à Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências para a obtenção do Grau de Mestre em Microbiologia Aplicada.

Nas regiões da bacia mediterrânica, o processo de extração de azeite por três fases produz aproximadamente 7 a 30 milhões de metros cúbicos de efluente por ano. O descarte deste efluente, denominado por águas ruças devido à cor escura que apresenta, é um sério problema ambiental. Várias soluções têm sido apresentadas através de propostas para tecnologias de tratamento, no entanto nenhuma delas obteve uma eficácia completa. A maioria dos problemas associados com a poluição das águas ruças é atribuída à sua elevada fração orgânica, composta essencialmente por polissacáridos, açúcares simples, compostos fenólicos, taninos, poliálcoois, proteínas, ácidos orgânicos e lípidos. Parte da toxicidade das águas ruças provém dos seus compostos fenólicos, sendo estes responsáveis por sérios danos biológicos, incluindo a fitotoxicidade. Ragazzi e Veronese (1989) descrevem que os compostos fenólicos tirosol e hidroxitirosol são os principais contribuidores para a atividade antimicrobiana deste efluente. Estas águas têm sido usadas como fertilizante para o crescimento vegetal através de sistemas de espalhamento no solo, contundo o elevado teor em sais minerais e em matéria orgânica (ácidos gordos e polifenóis) é um fator desfavorável para a fertilidade do solo. Apesar das características antimicrobianas apresentadas por este efluente, várias espécies de microrganismos são capazes de sobreviver neste meio, apresentando até uma microbiota moderadamente diversa. Esta microbiota apresenta alguma tolerância, e por vezes resistência, à toxicidade fenólica presente nas águas ruças. Certas espécies, tais como Yarrowia lipolytica, Candida rugosa e Candida cylindracea, conseguem crescer em meios de cultura que contém águas ruças e produzir compostos com interesse comercial como enzimas e ácidos orgânicos. Recentemente, devido ao seu conteúdo lipídico, as águas ruças têm sido propostas como uma fonte alternativa de triacilgliceróis para reduzir o custo da produção de éster metílico de ácido gordo (biodiesel, designado pelo acrónimo inglês FAME - fatty acid methyl ester). Tem sido dedicada especial atenção ao uso de lipases como biocatalizadores no processo de produção de biodiesel, sendo considerado um método mais ecológico. As lipases (triacilglicerol hidrolases, EC 3.1.1.3) são um grupo importante de enzimas com aplicações nas indústrias alimentar, de lacticínios, dos detergentes e farmacêuticas. Podem ser produzidas por animais, plantas ou por microrganismos. As lipases microbianas apresentam certas características, tais como a estabilidade e a seletividade, que fazem com que sejam bastante procuradas e utilizadas pela área industrial. Os microrganismos que as produzem encontram-se geralmente em ambientes lipidicos. As águas ruças demonstram potencialidade, não só como fonte de microrganismos produtores de lipases, mas também como meio complexo de crescimento indicado para a produção de lipases que, devido ao seu conteúdo residual lipídico, funciona como um indutor destas enzimas. O objetivo deste estudo foi isolar, a partir de águas ruças, novas estirpes de leveduras com capacidade de produzir lipases extracelulares e avaliar a adequabilidade das águas ruças para a produção de lipases. Para tal propósito, trinta e duas estirpes de leveduras foram isoladas de amostras de águas ruças, provenientes de lagares de azeite de Tavira, Portugal e da Jordânia, através dos meios Yeast Malt Agar (YMA), Potato Dextrose Agar (PDA) e Cooke-Rose Bengal Agar (CRBA) e a sua capacidade de produção de lipases foi investigada. Através do cultivo em meios de Tributirina, Tween 20 e Vermelho de Fenol Agar, usando três métodos de deteção rápida em caixas de Petri. Os microrganismos Yarrowia lipolytica (LNEG 263F, NRRL Y-323) e Candida sp. (LNEG 356F, INETI), duas estirpes de leveduras lipolíticas, foram utilizados como controlos positivos. Após 72 a 96 horas de incubação a 30ºC, selecionaram-se seis estirpes de leveduras que conseguiram produzir halos lipolíticos em, pelo menos, 2 métodos de deteção. A atividade lipolítica extracelular foi determinada através do crescimento em meio líquido sintético: 0,5% (m/v) extrato de levedura, 0,1% (m/v) sulfato de magnésio, 0,1% (m/v) cloreto de potássio e 0,5% (v/v) azeite. Os seis isolados e o controlo Yarrowia lipolytica foram incubados a 30ºC com uma agitação de 180 rpm durante 144 horas e posteriormente avaliados pelo método Gomes et al. (2011). O melhor produtor de lipase extracelular foi o isolado designado por “JOR TR 5”, tendo-se obtido uma produção de 0,8 U mL-1 às 96h de incubação. Para a sua identificação, o ADN foi extraído e as regiões D1/D2 do rDNA 28S foram amplificadas por PCR, usando os primers NL1 e NL4. Os fragmentos genómicos amplificados foram enviados para sequenciação (StabVida®). O isolado foi identificado como Magnusiomyces capitatus (gene parcial 28S rRNA, estirpe Kw-230) com 99% de similaridade, usando o programa BLAST. M. capitatus é uma levedura filamentosa com uma distribuição cosmopolita. Tem uma maior incidência em zonas geográficas com elevada humidade e temperatura. Pode ser encontrada no solo, em frutas e em produtos lácteos (queijos, por exemplo). Também pode ser encontrada no trato digestivo e respiratório de animais e humanos. O efeito da toxicidade dos compostos fenólicos sobre o crescimento de M.capitatus foi avaliado pelo crescimento desta levedura em diferentes diluições do efluente de águas ruças (10, 25, 50 e 100%). Ao meio de cultura natural foi adicionado extrato de levedura com e sem azeite como suplementos nutricionais. Para avaliar o aumento da biomassa nas experiências com suplemento nutricional, foi elaborada uma reta de correlação entre os valores da densidade ótica a 640 nm que o meio de cultura apresentava e o peso seco da biomassa (g.L-1). Desta forma, foi possível converter nos restantes ensaios os valores de densidade ótica em unidades de peso seco. No ensaio da toxicidade, as várias diluições com réplicas foram incubadas a 30ºC com uma agitação de 180 rpm durante 36 horas. Foram retiradas amostras de 1 mL às 0, 12, 22horas e a todas as horas até às 36 horas. No ensaio de suplemento nutricional, os meios e as suas respetivas réplicas foram postos a incubar a 30ºC com uma agitação de 180 rpm durante 120 horas com recolha de amostras de 24 em 24 horas. Relativamente à influência da toxicidade fenólica no crescimento da biomassa, concluiu-se que o crescimento de M. capitatus apresenta alguma inibição devido à toxicidade pelo teor em fenóis presente nas águas ruças. Não houve produção de lipase em nenhuma das diluições nem no efluente bruto. No entanto, com o suplemento nutricional, observou-se que 2 g.L-1 de extrato de levedura e 1 g.L-1 de azeite obteve os melhores resultados, tanto na produção de lipase (0,33 U.mL-1) como na quantidade da biomassa produzida (13,24 g.L-1). Com o objetivo de melhorar a produção de lipase da estirpe M. capitatus, foi estudada a influência da variação de NH4Cl e da oxigenação. Com esse objetivo foi delineado um ensaio de acordo com um planeamento experimental que segue a distribuição de Doehlert. Sete ensaios com réplicas foram incubados a 30ºC com uma agitação de 200 rpm durante 48h. A concentração de NH4Cl variou entre 0,2 e 2,8 g.L-1 num meio de cultura constituído por águas ruças não diluídas e suplementadas com 2 g.L-1 de extrato de levedura e com 1 g.L-1 de azeite. A disponibilidade de oxigénio foi estudada através da variação do volume de meio (desde 100 até 400 mL) em erlenmeyers de 1L com anteparas. Estes valores de oxigenação foram convertidos para kLa (coeficiente volumétrico de transferência de oxigénio em min-1), variando desde 0,2 até 1,88 min-1. Em todos os ensaios testados, o crescimento da levedura atinge um valor médio de concentração de biomassa de 4,56 g.L-1. A integridade da membrana celular da levedura foi analisada por citometria de fluxo, e observou-se que, na sua grande maioria, em todos os testes, as membranas celulares estavam intactas, indicando que as células não sofreram stress fisiológico. A atividade máxima de lipase foi de 1,16 U.mL-1, com uma suplemento de NH4Cl de 1,5 g.L-1 e um valor de kLa de 1,880, em meio de água ruça não diluída. Com a realização deste trabalho foi possível isolar uma estirpe de levedura com características lipolíticas a partir de um efluente recalcitrante. Esta estirpe foi identificada como Magnusiomyces capitatus e, através de um método de otimização das condições de cultura em água ruça não diluída e suplementada com NH4Cl e oxigénio, foi possível aumentar a produção de lipase por esta estirpe. Estes resultados vêm contribuir com uma nova estirpe produtora de lipases e reforçar o potencial da valorização das águas ruças como meio de fermentação para a indução da produção de lipases e fonte de isolamento de estirpes de leveduras produtoras de lipases.

Olive mill wastewaters (OMW) are effluents originated from olive oil extraction. It consists of a great variety of compounds, including polysaccharides, sugars, phenolic compounds, tannins, polyalcohols, proteins, organic acids and lipids. Due to its olive oil residue (an inducer of lipase) OMW is a potential source of lipase-producing microorganisms and a complex medium potentially suitable for lipase production. The aim of the present study is to isolate lipolytic yeasts with the ability to produce extracellular lipases from OMW samples, test their phenolic resistance and optimize their lipase production. For this purpose, thirty-two yeast strains were isolated from OMW samples. Screening for lipase activity using rapid plate detection methods allowed the selection of six isolates. Subsequently, extracellular lipolytic activity was determined in shake-flasks, and the best producer was the isolate “JOR TR 5” with an activity of 0.8 U.mL-1. This strain was identified as Magnusiomyces capitatus through DNA sequencing. The growth of M. capitatus with OMW as culture medium was assessed using several OMW dilutions and supplementation with yeast extract and olive oil. The culture growth did show some inhibition due to the phenol toxicity present in OMW. Nutrient supplementation improved both lipase production and biomass growth. The influence of ammonium chloride (NH4Cl) and oxygen availability was shown to improve lipase production, according to a statistical design following the Doehlert distribution. The highest lipase activity obtained was 1.16 U.mL-1, with 1.5 g.L-1 of NH4Cl supplementation and with Kla value of 1.880 min-1. The integrity of the yeast cell membrane was detected by flow cytometry and did not showed any signs of physiological stress. With this work, it was possible to obtain one yeast strain with lipolytic activity isolated from OMW, tolerant to this type of recalcitrant medium and able to produce lipase in undiluted OMW with reduced nutrient supplementation. These results confirm the valorisation of OMW as fermentation medium to induce the production of lipases and as source for isolation of lipase-producing yeasts strains.