Identificação de genes em Chromobacterium violaceum relacionados à resposta ao estresse

The sequencing of the genome of Chromobacterium violaceum identified one single circular chromosome of 4.8 Mb, in which approximately 40% of the founded ORFs are classified as hypothetical conserved or hypothetical. Some genic regions of biotechnological and biological interest had been characterized, e. g., environmental detoxification and DNA repair genes, respectively. Given this fact, the aim of this work was to identify genes of C. violaceum related to stress response, as the ones involved with mechanisms of DNA repair and/or genomic integrity maintenance. For this, a genomic library of C. violaceum was built in Escherichia coli strain DH10B (RecA-), in which clones were tested to UVC resistance, resulting in five candidates clones. In the PLH6A clone were identified four ORFs (CV_3721 to 3724). Two ORFs, CV_3722 and CV_3724, were subcloned and a synergic complementation activity was observed. The occurrence of an operon was confirmed using cDNA from C. violaceum in a RT-PCR assay. Further, it was observed the induction of the operon after the treatment with UVC. Thus, this operon was related to the stress response in C. violaceum. The mutagenesis assay with rifampicin after the treatment with UVC light showed high frequency of mutagenicity for the ORF CV_3722 (Pol III δ subunit). In this way, we propose that the C. violaceum δ subunit can act in DH10B in the translesion synthesis using Pol IV in a RecA independent-manner pathway. In growth curve assays other four clones (PLE1G, PLE7B, PLE10B and PLE12H) were able to complement the function at the dose 5 J/m2 and in mutagenicity assays PLE7B, PLE10B and PLE12H showed frequencies of mutation with significant differences upon the control (DH10B), demonstrating that in some way they are involved with the stress response in C. violaceum. These clones appear to be interrelated, probably regulated by a messenger molecule (eg., nucleotide c-di-GMP) and/or global regulatory molecule (eg., σS subunit of RNA polymerase).The results obtained contribute for a better genetic knowledge of this specie and its response mechanisms to environmental stress.

Proteômica diferencial da Chromobacterium violaceum em resposta ao estresse oxidativo induzido por peróxido de hidrogênio

The β-proteobacterium Chromobacterium violaceum is a Gram-negative, free-living, saprophytic and opportunistic pathogen that inhabits tropical and subtropical ecosystems among them, in soil and water of the Amazon. It has great biotechnological potential, and because of this potential, its genome was completely sequenced in 2003. Genome analysis showed that this bacterium has several genes with functions related to the ability to survive under different kinds of environmental stresses. In order to understand the physiological response of C. violaceum under oxidative stress, we applied the tool of shotgun proteomics. Thus, colonies of C. violaceum ATCC 12472 were grown in the presence and absence of 8 mM H2O2 for two hours, total proteins were extracted from bacteria, subjected to SDS-PAGE, stained and hydrolysed. The tryptic peptides generated were subjected to a linear-liquid chromatography (LC) followed by mass spectrometer (LTQ-XL-Orbitrap) to obtain quantitative and qualitative data. A shotgun proteomics allows to compare directly in complex samples, differential expression of proteins and found that in C. Violaceum, 131 proteins are expressed exclusively in the control condition, 177 proteins began to be expressed under oxidative stress and 1175 proteins have expression in both conditions. The results showed that, under the condition of oxidative stress, this bacterium changes its metabolism by increasing the expression of proteins capable of combating oxidative stress and decreasing the expression of proteins related processes bacterial growth and catabolism (transcription, translation, carbon metabolism and fatty acids). A tool with of proteomics as an approach of integrative biology provided an overview of the metabolic pathways involved in the response of C. violaceum to oxidative stress, as well as significantly amplified understanding physiological response to environmental stress. Biochemical and "in silico" assays with the hypothetical ORF CV_0868 found that this is part of an operon. Phylogenetic analysis of superoxide dismutase, protein belonging to the operon also showed that the gene is duplicated in genome of C. violaceum and the second copy was acquired through a horizontal transfer event. Possibly, not only the SOD gene but also all genes comprising this operon were obtained in the same manner. It was concluded that C. violaceum has complex, efficient and versatile mechanisms in oxidative stress response

Estudo do papel da proteína multifuncional APE1/Ref-1 sobre a resposta inflamatória na meningite bacteriana

Despite advances in antibiotic therapy, bacterial meningitis (BM) remains with high mortality and morbidity rates in worldwide. One important mechanism associated to sequels during disease is the intense inflammatory response which promotes an oxidative burst and release of reactive oxygen species, consequently leading to cell death. Activation of DNA repair enzymes during oxidative stress has been demonstrated in several neurological disorders. APE1/Ref-1 is a multifunctional protein involved in DNA repair and plays a redox function on transcription factors such as NFkB and AP-1.The aim of this study was assess the role of APE1/Ref-1 on inflammatory response and the possibility of its modulation to reduce the sequels of the disease. Firstly it was performed an assay to measure cytokine in cerebrospinal fluid of patients with BM due to Streptococcus pneumoniae and Neisseriae meningitides. Further, a cellular model of inflammation was used to observe the effect of the inhibition of the endonuclease and redox activity of APE1/Ref-1 on cytokine levels. Additionally, APE1/Ref-1 expression in cortex and hippocampus of rat with MB after vitamin B6 treatment was evaluated. Altogether, results showed a similar profile of cytokines in the cerebrospinal fluid of patients from both pathogens, although IFNy showed higher expression in patients with BM caused by S. pneumoniae. On the other hand, inhibitors of APE1/Ref-1 reduced cytokine levels, mainly TNF-α. Reduction of oxidative stress markers was also observed after introduction of inhibitors in the LPS-stimulated cell. In the animal model, BM increased the expression of the protein APE1/Ref-1, while vitamin B6 promoted reduction. Thereby, this data rise important factors to be considered in pathogenesis of BM, e.g., IFNy can be used as prognostic factor during corticosteroid therapy, APE1/Ref-1 can be an important target to modulate the level of inflammation and VIII oxidative stress, and vitamin B6 seems modulates several proteins related to cell death. So, this study highlights a new understanding on the role of APE1/Ref-1 on the inflammation and the oxidative stress during inflammation condition

Análise do efeito de polimorfismos não-sinônimos em genes de reparo de DNA da via BER na resposta inflamatória da meningite

In vitro and in animal models, APE1, OGG1, and PARP-1 have been proposed as being involved with inflammatory response. In this work, we have investigated if the SNPs APE1 Asn148Glu, OGG1 Ser326Cys, and PARP-1 Val762Ala are associated to meningitis and also developed a system to enable the functional analysis of polymorphic proteins. Patients with bacterial meningitis (BM), aseptic meningitis (AM) and controls (non-infected) genotypes were investigated by PIRA-PCR or PCR-RFLP. DNA damages were detected in genomic DNA by Fpg treatment. IgG and IgA were measured from plasma and the cytokines and chemokines were measured from cerebrospinal fluid samples using Bio-Plex assays. The levels of NF-κB and c-Jun were measured in CSF by dot blot assays. A significant (P<0.05) increase in the frequency of APE1 148Glu allele in BM and AM patients was observed. A significant increase in the genotypes Asn/Asn in control group and Asn/Glu in BM group was also found. For the SNP OGG1 Ser326Cys, the genotype Cys/Cys was more frequent (P<0.05) in BM group. The frequency of PARP-1 Val/Val genotype was higher in control group (P<0.05). The occurrence of combined SNPs increased significantly in BM patients, indicating that these SNPs may be associated to the disease. Increasing in sensitive sites to Fpg was observed in carriers of APE1 148Glu allele or OGG1 326Cys allele, suggesting that SNPs affect DNA repair activity. Alterations in IgG production were observed in the presence of SNPs APE1Asn148Glu, OGG1Ser326Cys or PARP-1Val762Ala. Reductions in the levels ofIL-6, IL-1Ra, MCP-1/CCL2and IL-8/CXCL8 were observed in the presence of APE1148Glu allele in BM patients, however no differences were observed in the levels of NF-κB and c-Jun considering genotypes and analyzed groups. Using APE1 as model, a system to enable the analysis of cellular effects and functional characterization of polymorphic proteins was developed using strategies of cloning APE1 cDNA in pIRES2-EGFP vector, cellular transfection of the construction obtained, siRNA for endogenous APE1 and cellular cultures genotyping. In conclusion, we obtained evidences of an effect of SNPs in DNA repair genes on the regulation of immune response. This is a pioneering work in the field that shows association of BER variant enzymes with an infectious disease in human patients, suggesting that the SNPs analyzed may affect immune response and damage by oxidative stress level during brain infection. Considering these data, new approaches of functional characterization must be developed to better analysis and interactions of polymorphic proteins in response to this context

Protótipo de um sistema de apoio à decisão clínica em anestesiologia

A saúde é uma das áreas mais sensíveis da sociedade, senão mesmo a mais sensível. Os doentes deslocam-se às instituições de saúde por necessidade, com a finalidade de receberem tratamento de modo a atingir o bem-estar físico e psíquico. O doente pode dar entrada numa instituição de saúde por diferentes motivos, designadamente, por um episódio de urgência, consulta externa ou reencaminhado por outra instituição. Após a primeira admissão no hospital o doente pode ser sujeito a exames médicos, encaminhado para consultas externas, internamentos, tratamentos (fisioterapia ou hospital de dia) ou para o Bloco Operatório. Após a primeira entrada de um doente numa instituição de saúde o volume de dados clínicos relacionados com esse doente aumenta consecutivamente. Esses dados são extremamente importantes tanto a curto, médio ou a longo prazo. Os dados ajudam na definição do diagnóstico e do tratamento do problema de saúde atual e podem vir a ser cruciais em avaliações futuras, melhorando diagnósticos, tratamentos, utilização de recursos e tempos de resposta. Gerir este volume de informação é um grande desafio. Ao longo dos últimos anos assistiu-se a um aumento do número de doentes inscritos a aguardar por uma cirurgia. Neste sentido foram tomadas medidas para reduzir as listas de inscritos. A redução das listas de inscritos para cirurgia levou a um aumento do número de intervenções cirúrgicas realizadas e consequentemente a um aumento do número de dados clínicos dos doentes. Com o elevado aumento dos dados houve a necessidade de recorrer aos Sistemas de Informação (SI) para a automatização e tratamento dos dados. Os SI têm um papel preponderante para garantir a fiabilidade, a integridade e a disponibilidade dos dados. Os Sistemas de Apoio à Decisão (SAD) são sistemas que prestam um contributo fundamental na tomada de decisão. Estes sistemas aplicados à área da saúde têm revelado ser uma ajuda importante para o clínico, uma vez que vão dotar o profissional de saúde de uma maior quantidade e qualidade de informação relacionada com o doente, o que pode ajudar a melhorar na diminuição do erro. O presente trabalho tem como principal objetivo modelar e desenvolver um protótipo de um Sistema de Apoio à Decisão Clínica (SADC) para a área da Anestesiologia. Inicialmente foram analisados alguns SI orientados para a área da saúde. Três dos sistemas analisados são orientados para a área de Anestesiologia/Bloco Operatório. Do estudo verificou-se que estes sistemas são uma importante mais valia, no entanto identificou-se a possibilidade de acrescentar e otimizar protocolos pós anestésicos e de sugerir níveis de condições de alta. Com o objetivo de apresentar uma solução mais completa foi proposto o desenvolvimento de um sistema que, para além de apresentar as soluções existentes nos sistemas estudados, permitisse a otimização de protocolos e a emissão de alertas e sugestões. No desenvolvimento deste projeto foi seguida uma metodologia de prototipagem onde o modelo utilizado foi o Modelo de Desenvolvimento Evolucionário. Foi desenvolvido um protótipo que reúne informação proveniente da consulta de anestesiologia, do bloco operatório e do recobro anestésico. Com base nestes registos o sistema vai emitir alertas, sugerir níveis de condições de alta e protocolos pós anestésicos a executar. Por fim foi realizado um pequeno questionário com o objetivo de verificar e validar a qualidade das decisões sugeridas pelo sistema. O questionário foi respondido por três especialistas em Anestesiologia com mais de dez anos de experiência. Desse questionário obteve-se bons resultados. Os utilizadores indicaram bons graus de satisfação relativamente à facilidade de utilização, ao tempo de resposta para cada tarefa, às funcionalidades e à terminologia, considerando mesmo que o SADCA pode vir a melhorar a qualidade da informação clínica. Com base nos resultados obtidos foram identificadas propostas de melhorias futuras na área dos alertas e da otimização dos protocolos pós-anestésicos.

Avaliação da instabilidade femoropatelar por ressonância magnética: estudo comparativo com a tomografia computorizada

A instabilidade rotuliana é uma patologia ortopédica que se apresenta na decorrência de um defeito anatómico da articulação femoropatelar e do aparelho extensor músculo-tendinoso do joelho. Caraterizada por dor retropatelar ou peripatelar resultante de alterações físicas e bioquímicas da articulação, surge como dor anterior do joelho envolvendo a rótula e retináculos. Com maior incidência em adolescentes e adultos (2ª e 3ª décadas de vida), prevalece em indivíduos do sexo feminino (2:1), sendo pouco frequente em crianças com menos de 8 anos de idade. Um diagnóstico preciso desta patologia assume enorme relevância na otimização do tratamento, pois o seu objetivo é reduzir a dor e melhorar o alinhamento rotuliano e, consequentemente, a função articular. O sucesso do tratamento adotado reside na execução correta da técnica terapêutica, seja conservadora ou cirúrgica. Nesse sentido, a conjugação dos dados da avaliação clínica com os achados imagiológicos figura-se essencial no diagnóstico diferencial e planeamento terapêutico da instabilidade femoropatelar. A Tomografia Computorizada (TC) é a técnica de imagem gold standard no estudo das relações femoropatelares, sendo mais precisa e eficaz do que a avaliação por Radiologia Convencional em incidências axiais. Contudo, a sua limitação na visualização dos tecidos moles circundantes e, em particular, no diagnóstico de possíveis defeitos da cartilagem articular, tem potenciado o recurso à técnica de Ressonância Magnética (RM) para uma análise mais aprofundada da instabilidade. O recurso a este método de imagem para mensuração das distâncias e ângulos padronizados e definição do diagnóstico diferencial não é consensual no seio da comunidade científica. De facto, após alguma pesquisa bibliográfica sobre o tema, constata-se que alguns autores primam a TC pela sua eficácia cientificamente comprovada, bem como o menor custo associado, maior facilidade de acesso e elevada tolerância pelo paciente a este tipo de exames, contrariamente ao exame de RM. Apesar da RM ser um método imagiológico tecnologicamente mais avançado que a TC, sem recorrer à emissão de radiação ionizante, apresenta contra-indicações absolutas para a sua realização, limitando o número de pacientes a usufruírem desta tecnologia, de menor acessibilidade e custos associados superiores. Deste modo, o problema de investigação que serviu de orientação a este projeto foi saber qual a eficácia da RM na definição de diagnóstico e orientação terapêutica de instabilidades femoropatelares comparativamente com a TC. No sentido de dar resposta a esta problemática, propõe-se a elaboração de um estudo quantitativo, realizado numa amostra de 40 pacientes de ambos os sexos, com suspeita clínica de instabilidade rotuliana corroborada por exame prévio de TC. O mesmo decorrerá na Unidade de Ressonância Magnética do Serviço de Imagiologia do Centro Hospitalar de São João - E.P.E., no Porto. Este trabalho surge no âmbito da unidade curricular Projeto em Radiologia do 2º ano do Curso de Mestrado em Radiologia – Especialização em Osteo-articular, lecionado pela Escola Superior de Tecnologia da Saúde de Coimbra, e destina-se à avaliação da disciplina. Para a elaboração do mesmo, procedeu-se a uma extensa revisão bibliográfica sob a forma de livros, artigos científicos e elementos em suporte digital, que posteriormente foi selecionada e resumida, procurando sempre documentar-se tudo em fontes fidedignas e atuais. O projeto está descrito de modo a facilitar a compreensão de cada assunto. Inicialmente será efetuado o enquadramento teórico da problemática em estudo, procedendo-se, em seguida, à fase metodológica da investigação, onde descrevemos e apresentamos a metodologia a utilizar no decorrer da investigação, definindo objetivos, tipo de estudo, as variáveis envolvidas, estratégia de recolha e tratamento de dados, resultados esperados e possíveis limitações para a realização do mesmo. Por último, fazemos referência à organização da nossa pesquisa, elucidando o local e período de estudo assim como a sua calendarização, recursos envolvidos e aspetos ético-legais relevantes.

Resposta de soja transgênica ao uso de glifosate em duas safras agrícolas e seu relacionamento com o ácido chiquímico.

O controle químico das plantas daninhas na cultura da soja RR com glifosate vem se destacando nos últimos anos no Brasil, necessitando de pesquisas com essa biotecnologia. O objetivo do trabalho foi avaliar a eficácia do glifosate aplicado de forma isolada e seqüencial na produção e no teor de ácido chiquímico na cultura de soja RR. Os tratamentos foram: glifosate a 720 e 960 g i.a.ha-1 e chlorimuron-ethyl a 20 g i.a.ha-1; glifosate em mistura com chlorimuronethyl: 720+2,5 e 960+2,5 g i.a.ha-1 e glifosate aplicado seqüencialmente: 720/720; 960/720 e 960/720/720 g i.a.ha-1 com intervalos de 15 dias entre as aplicações, além de testemunhas capinada e não capinada. O delineamento experimental empregado foi em blocos casualizados com quatro repetições. Os tratamentos não causaram fitotoxidade à cultura, apresentaram eficácia no controle de Bidens pilosa, Euphorbia heterophyla e Raphanus raphanistrum, exceto o chlorimuron-ethyl a 20 g i.a. ha-1 no controle de E. heterophyla e R. raphanistrum. Ipomoea nil foi eficientemente controlada apenas pelas aplicações seqüenciais de glifosate (720/720;960/720 e 960/720/720 g i.a.ha-1). Não se verificou acúmulo do ácido chiquímico nas plantas de soja tratadas com glifosate. O manejo das espécies de plantas daninhas na cultura de soja RR, com aplicações isoladas ou seqüenciais de glifosate, pode ser uma alternativa de controle químico a ser recomendada aos sojicultores.

Unidade na diversidade? A resposta da União Europeia à Rússia durante a crise ucraniana

Mestrado em Economia Internacional e Estudos Europeus

Resposta metabólica da ostra Crassostrea gigas na presença do parasita Amyloodinium ocellatum

Dissertação de Mestrado, Aquacultura e Pescas, Especialização em Aquacultura, Faculdade de Ciências e Tecnologia, Universidade do Algarve, 2015

Viver no campo ou na cidade? resposta dos morcegos (Mammalia, Chiroptera) à antropização da paisagem

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Ecologia, Programa de Pós-Graduação em Ecologia, 2015.

Saúde e remédios caseiros

Inserido no âmbito do Projeto Europeu “My Food My Medicine” (Meu Alimento Meu Medicamento), que tem como ideia base o conselho de Hipócrates de que a nossa alimentação deve ser o nosso medicamento, realizou-se um Trabalho de Projeto de formação sobre a manutenção da saúde através da promoção de uma alimentação saudável e pela recuperação do uso de receitas tradicionais/caseiras de medicamentos naturais usados ancestralmente na resposta aos distúrbios de saúde mais comuns. Objetivos Gerais: O principal objetivo do projeto é levar os participantes a compreender os princípios e receitas da medicina tradicional e natural, as características dos ingredientes e os seus benefícios para a saúde. Metodologia: Elaboração de um projeto de formação com materiais educativos, testados pela sua aplicação, e realização de questionários a formadores e formandos. Resultados: Verificou-se algum conhecimento por parte dos formandos de grande parte das receitas de remédios caseiros, embora por vezes com alguma desconfiança da sua eficácia, acreditamos terem ficado com intenção de usar a maior parte das receitas expostas pela sua facilidade de elaboração e pela valorização crescente da tradicionalidade e ancestralidade, julgamos desta forma poder ter contribuído para a promoção e manutenção da saúde; Abstract: As part of the European Project "My Food My Medicine” which has as its central idea the Board of Hippocrates that our food should be our medicine i.e., a healthy diet is the foundation of a healthy life, this report presents an educational project about the maintenance of health through the promotion of healthy eating that is reflected also by the use of natural medicines based on homemade/traditional recipes used ancestrally that respond to the most common health disorders. Objectives: Take the participants to understand the basic principles and the recipes of traditional medicine, the characteristics of the ingredients and their health benefits. Methodology: Development of an educational project and educational materials, tested trough out its implementation, and conducting questionnaires to trainers and trainees. Results: The objective was accomplished. It was found some familiarity on the part of the graduates of most recipes for home remedies although sometimes with some distrust of their validity. The schooling contributed to health promotion. The trainees demonstrated the intention to use the recipes exposed as a way to maintain a healthy life.

Do livro ao fantoche, reciclando palavras. Desenvolvimento da comunicação oral

Dissertação de Mestrado, Educação Pré-Escolar, Escola Superior de Educação e Comunicação, Universidade do Algarve, 2016

Operações Anfíbias em ambiente A2/AD

Com o fim da Guerra Fria e a dissolução do Pacto Militar de Varsóvia, a Rússia deixou de ser uma ameaça à hegemonia militar norte-americana e da NATO. Assim, desde esse momento para cá que se tem assistido a um quase total acesso, livre de verdadeira oposição, a qualquer teatro de operações. Durante a Guerra do Golfo, em 1990-91, e posteriormente no Afeganistão e Iraque a partir de 2001, no que constituem os dois grandes conflitos armados pós-Guerra Fria, os EUA em conjunto com a NATO, conseguiram alcançar a vitória através de um total acesso operacional aos teatros de operações, e com um grau de ameaça bastante reduzido. Contudo, este cenário de ameaça reduzida e acesso global está claramente comprometido. Isto porque um sem número de meios e tecnologias têm sido desenvolvidas e aplicadas exatamente com este propósito. Assim, em 2003 surgiu o acrónimo A2/AD – “Anti-Access/Area Denial”, para qualificar estes meios e estratégias para os empregar, por forma a negar o acesso ao cenário de conflito, ou limitar a facilidade de movimentação no teatro de operações. Estas estratégias de A2/AD diminuem a capacidade de projeção de poder, negando a facilidade de movimentação e capacidade de ação, permitindo ainda uma miríade de abordagens operacionais. Os inúmeros adversários dos EUA/NATO não irão cometer os mesmos erros que Saddam Hussein cometeu na primeira Guerra do Golfo. Em particular, a China tem desenvolvido grande parte da sua capacidade de A2/AD com base em exemplos retirados deste conflito. A proliferação deste tipo de capacidades e meios ao longo de um espectro bastante significativo de atores estatais e não-estatais obriga a que tanto os EUA como a NATO desenvolvam formas inovadoras de lhes fazer face. As operações anfíbias poderão ser uma resposta bastante capaz a este cenário de A2/AD. A capacidade única de operar transversalmente em diversos domínios, com um custo relativamente baixo e juntando forças dos vários ramos, respondendo de forma rápida a qualquer situação e providenciando uma presença avançada num cenário de conflito tornam as Operações Anfíbias numa resposta bastante válida à questão estratégica do A2/AD.

Avaliação da resposta ao stress de gatas hospitalizadas no período pós-cirúrgico em distintas condições de macroambiente

Dissertação de Mestrado Integrado em Medicina Veterinária