Proteômica diferencial da Chromobacterium violaceum em resposta ao estresse oxidativo induzido por peróxido de hidrogênio

The β-proteobacterium Chromobacterium violaceum is a Gram-negative, free-living, saprophytic and opportunistic pathogen that inhabits tropical and subtropical ecosystems among them, in soil and water of the Amazon. It has great biotechnological potential, and because of this potential, its genome was completely sequenced in 2003. Genome analysis showed that this bacterium has several genes with functions related to the ability to survive under different kinds of environmental stresses. In order to understand the physiological response of C. violaceum under oxidative stress, we applied the tool of shotgun proteomics. Thus, colonies of C. violaceum ATCC 12472 were grown in the presence and absence of 8 mM H2O2 for two hours, total proteins were extracted from bacteria, subjected to SDS-PAGE, stained and hydrolysed. The tryptic peptides generated were subjected to a linear-liquid chromatography (LC) followed by mass spectrometer (LTQ-XL-Orbitrap) to obtain quantitative and qualitative data. A shotgun proteomics allows to compare directly in complex samples, differential expression of proteins and found that in C. Violaceum, 131 proteins are expressed exclusively in the control condition, 177 proteins began to be expressed under oxidative stress and 1175 proteins have expression in both conditions. The results showed that, under the condition of oxidative stress, this bacterium changes its metabolism by increasing the expression of proteins capable of combating oxidative stress and decreasing the expression of proteins related processes bacterial growth and catabolism (transcription, translation, carbon metabolism and fatty acids). A tool with of proteomics as an approach of integrative biology provided an overview of the metabolic pathways involved in the response of C. violaceum to oxidative stress, as well as significantly amplified understanding physiological response to environmental stress. Biochemical and "in silico" assays with the hypothetical ORF CV_0868 found that this is part of an operon. Phylogenetic analysis of superoxide dismutase, protein belonging to the operon also showed that the gene is duplicated in genome of C. violaceum and the second copy was acquired through a horizontal transfer event. Possibly, not only the SOD gene but also all genes comprising this operon were obtained in the same manner. It was concluded that C. violaceum has complex, efficient and versatile mechanisms in oxidative stress response

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico

A β-proteobactéria Chromobacterium violaceum é um bacilo Gram-negativo, de vida livre,saprófito e patógeno oportunista que habita em ecossistemas tropicais e subtropicais dentre eles no solo e na água da Amazônia. Possui grande potencial biotecnológico e, devido a esse potencial, seu genoma foi totalmente sequenciado em 2003. A análise do genoma mostrou que essa bactéria possui vários genes com funções relacionadas à capacidade de sobreviver sob diferentes tipos de estresse ambiental. Objetivando entender a resposta fisiológica de C. violaceum sob condição de estresse oxidativo, foi aplicada a ferramenta de proteômica de shotgun. Sendo assim, colônias de C. violaceum ATCC 12472 foram cultivadas na presença e na ausência de 8 mM de H2O2 por duas horas, as proteínas totais da bactéria foram extraídas, submetidas à SDS-PAGE, coradas e hidrolisadas. Os peptídeos trípticos gerados foram submetidos a uma cromatografia líquida (LC)-linear seguido de espectrômetro de massa (LTQ-XL-Orbitrap) para a obtenção de dados quantitativos e qualitativos. A proteômica de shotgun permite comparar diretamente, em amostras complexas, expressão diferencial de proteínas e revelou que, em C. violaceum, 131 proteínas são expressas exclusivamente na condição controle, 177 proteínas passaram a ser expressas sob estresse oxidativo e 1175 proteínas possuem expressão em ambas condições. A análise dos resultados mostrou que, na condição de estresse oxidativo, essa bactéria muda seu metabolismo, aumentando a expressão de proteínas capazes de combater o estresse oxidativo e diminuindo a expressão de proteínas de processos relacionados com o crescimento bacteriano e catabolismo (transcrição, tradução, metabolismo de carbono e de ácidos graxos). A ferramenta de proteômica com uma abordagem de biologia integrativa forneceu uma visão geral das vias metabólicas envolvidas na resposta de C. violaceum ao estresse oxidativo, bem como amplificou significativamente a compreensão resposta fisiológica ao estresse ambiental. Ensaios bioquímicos e in silico com a ORF hipotética CV_0868 constataram que esta faz parte de um operon. A análise filogenética de superóxidos dismutase, proteína pertencente tambémb ao operon, mostrou que esse gene está duplicado no genona de C. violaceum e que a segunda cópia foi aquirida através de um evento de transferência horizontal. Possivelmente, não só o gene sod, mas também todos os genes que compõem este operon foram adquiridos da mesma maneira. Concluiu-se que C. violaceum possui mecanismos complexos, eficientes e versáteis em resposta estresse oxidativo