Methods of genetic diversity creation and functional display for directed evolution experiments

Protein engineering aims to improve the properties of enzymes and affinity reagents by genetic changes. Typical engineered properties are affinity, specificity, stability, expression, and solubility. Because proteins are complex biomolecules, the effects of specific genetic changes are seldom predictable. Consequently, a popular strategy in protein engineering is to create a library of genetic variants of the target molecule, and render the population in a selection process to sort the variants by the desired property. This technique, called directed evolution, is a central tool for trimming protein-based products used in a wide range of applications from laundry detergents to anti-cancer drugs. New methods are continuously needed to generate larger gene repertoires and compatible selection platforms to shorten the development timeline for new biochemicals. In the first study of this thesis, primer extension mutagenesis was revisited to establish higher quality gene variant libraries in Escherichia coli cells. In the second study, recombination was explored as a method to expand the number of screenable enzyme variants. A selection platform was developed to improve antigen binding fragment (Fab) display on filamentous phages in the third article and, in the fourth study, novel design concepts were tested by two differentially randomized recombinant antibody libraries. Finally, in the last study, the performance of the same antibody repertoire was compared in phage display selections as a genetic fusion to different phage capsid proteins and in different antibody formats, Fab vs. single chain variable fragment (ScFv), in order to find out the most suitable display platform for the library at hand. As a result of the studies, a novel gene library construction method, termed selective rolling circle amplification (sRCA), was developed. The method increases mutagenesis frequency close to 100% in the final library and the number of transformants over 100-fold compared to traditional primer extension mutagenesis. In the second study, Cre/loxP recombination was found to be an appropriate tool to resolve the DNA concatemer resulting from error-prone RCA (epRCA) mutagenesis into monomeric circular DNA units for higher efficiency transformation into E. coli. Library selections against antigens of various size in the fourth study demonstrated that diversity placed closer to the antigen binding site of antibodies supports generation of antibodies against haptens and peptides, whereas diversity at more peripheral locations is better suited for targeting proteins. The conclusion from a comparison of the display formats was that truncated capsid protein three (p3Δ) of filamentous phage was superior to the full-length p3 and protein nine (p9) in obtaining a high number of uniquely specific clones. Especially for digoxigenin, a difficult hapten target, the antibody repertoire as ScFv-p3Δ provided the clones with the highest affinity for binding. This thesis on the construction, design, and selection of gene variant libraries contributes to the practical know-how in directed evolution and contains useful information for scientists in the field to support their undertakings.

Porin seudun liikenneturvallisuussuunnitelma

Porin seudulle laadittiin liikenneturvallisuussuunnitelma Harjavallan, Huittisen, Kokemäen, Luvian, Merikarvian, Nakkilan, Pomarkun, Porin ja Ulvilan kuntien alueelle. Suunnitelmat laadittiin kuntien ja Varsinais-Suomen ELY-keskuksen yhteistyönä. Suunnitelma sisältää turvallisuuden parantamisen lisäksi kestävien liikkumismuotojen edistämistä. Seudun liikenneturvallisuuden ja liikkumisen ongelmia kartoitettiin kaikille kuntalaisille suunnatuilla kyselyillä, onnettomuusanalyysillä sekä maastokäynneillä. Onnettomuusanalyysin perusteella seudun liikenneturvallisuuden tila Porin seudulla on koko maan keskiarvoa heikompi. Vuosittain kuolee noin 10 henkilöä ja loukkaantuu noin 220 henkilöä. Seudulla tapahtuneista onnettomuuksista aiheutuu kustannuksia vuosittain keskimäärin noin 90 miljoonaa euroa, josta kuntien osuus on vuosittain noin 16 miljoonaa euroa. Kyselyn vastauksista ilmeni, että vastaajia huolestutti muun muassa jalankulku- ja pyöräväylien kunto ja esteettömyys sekä talvikunnossapidon taso. Autoilun olosuhteissa tyytymättömyyttä aiheutti teiden kunto ja kunnossapidon taso sekä kouluympäristöjen liikennejärjestelyt. Kyselyyn vastanneista 64 %:lla työ- tai koulumatkan pituus on korkeintaan 5 kilometriä, joten kävelyn ja pyöräilyn edistämisellä seudulla on hyvät edellytykset. Ongelma-analyysin sekä valtakunnallisten tavoitteiden pohjalta seudulle määritettiin liikenneturvallisuustavoitteet. Pitkän aikavälin liikenneturvallisuusvisioksi seudulle asetettiin, että kenenkään ei tarvitse kuolla tai loukkaantua vakavasti liikenteessä ja liikkuminen on vastuullista ja se koetaan turvalliseksi. Määrällisenä tavoitteena on, että nykyisestä 10 keskimäärin vuodessa kuolleesta seudulla kuolisi liikenteessä enintään 6 henkilöä (40 henkilöä / miljoona asukasta) vuonna 2014 ja enintään 3 henkilöä (24 henkilöä / miljoona asukasta) vuonna 2020. Loukkaantuneiden määrän tavoitteena on, että nykyisestä 218 henkilöstä vähennystä olisi 25 % (korkeintaan 163 henkilöä) vuoteen 2020 mennessä. Nuorten onnettomuusriskiä halutaan pienentää 25 % vuoteen 2020 mennessä siten, että heidän riskinsä lähenee muun väestön onnettomuusriskin tasoa. Liikenneympäristön parantamisehdotukset tehtiin noin 300 kohteeseen seudulla. Toimenpiteiden toteuttaminen vaiheistettiin kolmeen ohjeelliseen kiireellisyysluokkaan. Suunnitelmatyön aikana kuntien liikenneturvallisuustyötä aktivoitiin ja perustettiin uudet ryhmät niihin kuntiin, joista ryhmät puuttuivat. Hallintokuntatilaisuuksissa ideoitiin ja käsiteltiin eri liikkujaryhmille sopivia toimintamuotoja liikenneturvallisuuden ja kestävän liikkumisen edistämiseksi. Lisäksi muodostettiin seudullinen liikenneturvallisuusryhmä, joka seuraa ja koordinoi liikenneturvallisuustyötä tulevaisuudessa.

Itse tehty moderni. Gramofoni, polkupyörä ja valokuvaus suomalaisten elämässä 1880-luvulta 1940-luvulle

Tässä tutkimuksessa tarkastellaan aineellista modernia ja materiaalisen kulttuurin muutosta Suomessa 1880-luvulta 1940-luvulle tutkimalla sitä, miten kolme kansainvälistä teknologiaa, gramofoni, polkupyörä ja valokuvaus, otettiin Suomessa käyttöön ja millaisia paikallisia ilmiöitä niiden ympärille kehittyi. Tutkimus koostuu johdanto- ja yhteenveto-osan lisäksi kuudesta artikkelista, joissa käsitellään seuraavia alateemoja: itse tehtyjä polkupyöriä, käyntikorttikuvien käyttöä maalaiskodeissa, maaseudun pyöräilyä ja sen muistelemista, vuoden 1929 gramofonikuumetta, valokuvausta teknisenä harrastuksena sekä maalaisia gramofonin käytön tapoja. Tutkimuksen lähteinä on käytetty laajoja muistitietoaineistoja, sanoma- ja aikakauslehtiaineistoja, arkistoaineistoja, aikalaiskirjallisuutta ja museoesineitä. Lähteistä on etsitty mikrohistoriallista lukutapaa noudattaen johtolankoja gramofoniin, polkupyörään ja valokuvaukseen liittyneihin käytäntöihin. Esitän, että muistitietolähteet, muiden lähteiden kanssa ristiinluettuina, antavat hyvän mahdollisuuden sellaisten arjen käytäntöjen tarkasteluun, joiden tutkiminen muiden lähteiden perusteella olisi vaikeaa tai mahdotonta. Tutkimuksessa käytetyistä teoreettisista kehyksistä niin teknologian sosiaalinen rakentuminen, arjen historia, materiaaliseen kulttuuriin liittyvä teoriapohja, kulutuskulttuurin tutkimus kuin käytäntöteoriatkin kannustavat tarkastelemaan sitä, miten käyttäjien toiminta muokkaa ja määrittää teknologiaa. Näiden teoriasuuntausten pohjalta olen tätä tutkimusta varten kehittänyt itse tehdyn modernin ja kansankeksinnön käsitteet, jotka tarkentavat katseen ajallisesti ja paikallisesti tyypillisiin teknologian muokkauksen ja määrittelyn tapoihin sekä paikalliseen teknologiseen kekseliäisyyteen. Itse tehdyn modernin käsite auttaa hahmottamaan materiaalisia muutoksia ja pysyvyyksiä ajanjaksolla 1800-luvun lopulta toiseen maailmansotaan. Suomalaiset muovasivat omanlaisensa modernin, jossa uutuudet ja muutokset sulautuivat osaksi sitkeinä jatkuvia ja hitaasti muuttuvia maalaisyhteiskunnan toimintatapoja ja muokkasivat niitä vähitellen. Itse tehty moderni sekoitti omavaraisuutta ja kulutuskulttuuria, käsillä tekemiseen perustuvaa taitavuutta ja kursseilla sekä koulutuksessa saavutettua teknistä tietoa, paikallisia aineksia ja kansainvälisiä vaikutteita. Puhumalla kansanomaisista keksinnöistä olen halunnut korostaa tällaisten yhdistelmien mahdollisuutta ruohonjuuritasolla ja massatuotettujen laitteiden sovittamista osaksi pitkälti itse tehtyä ja omavaraista esinemaailmaa.

Cost-efficient virtual machine management : provisioning, admission control, and consolidation

One of the main challenges in Software Engineering is to cope with the transition from an industry based on software as a product to software as a service. The field of Software Engineering should provide the necessary methods and tools to develop and deploy new cost-efficient and scalable digital services. In this thesis, we focus on deployment platforms to ensure cost-efficient scalability of multi-tier web applications and on-demand video transcoding service for different types of load conditions. Infrastructure as a Service (IaaS) clouds provide Virtual Machines (VMs) under the pay-per-use business model. Dynamically provisioning VMs on demand allows service providers to cope with fluctuations on the number of service users. However, VM provisioning must be done carefully, because over-provisioning results in an increased operational cost, while underprovisioning leads to a subpar service. Therefore, our main focus in this thesis is on cost-efficient VM provisioning for multi-tier web applications and on-demand video transcoding. Moreover, to prevent provisioned VMs from becoming overloaded, we augment VM provisioning with an admission control mechanism. Similarly, to ensure efficient use of provisioned VMs, web applications on the under-utilized VMs are consolidated periodically. Thus, the main problem that we address is cost-efficient VM provisioning augmented with server consolidation and admission control on the provisioned VMs. We seek solutions for two types of applications: multi-tier web applications that follow the request-response paradigm and on-demand video transcoding that is based on video streams with soft realtime constraints. Our first contribution is a cost-efficient VM provisioning approach for multi-tier web applications. The proposed approach comprises two subapproaches: a reactive VM provisioning approach called ARVUE and a hybrid reactive-proactive VM provisioning approach called Cost-efficient Resource Allocation for Multiple web applications with Proactive scaling. Our second contribution is a prediction-based VM provisioning approach for on-demand video transcoding in the cloud. Moreover, to prevent virtualized servers from becoming overloaded, the proposed VM provisioning approaches are augmented with admission control approaches. Therefore, our third contribution is a session-based admission control approach for multi-tier web applications called adaptive Admission Control for Virtualized Application Servers. Similarly, the fourth contribution in this thesis is a stream-based admission control and scheduling approach for on-demand video transcoding called Stream-Based Admission Control and Scheduling. Our fifth contribution is a computation and storage trade-o strategy for cost-efficient video transcoding in cloud computing. Finally, the sixth and the last contribution is a web application consolidation approach, which uses Ant Colony System to minimize the under-utilization of the virtualized application servers.

Renkaiden ja tienpinnan välisen kitkakertoimen mittausjärjestelmän suunnittelu ja toteutus

Teiden liukkauden mittaaminen on herättänyt kiinnostusta viime vuosina. Liikenneturvallisuutta pystyttäisiin parantamaan ja teiden talvikunnossapitoa tehostamaan, mikäli kitkakerroin voitaisiin mitata tiestöä käyttävissä ajoneuvoissa. Tässä työssä suunnitellaan ja toteutetaan ajoneuvon pituussuuntaiseen dynamiikkaan perustuva kitkakertoimen mittausjärjestelmä. Pyörien luisto ja ajoneuvon nopeus, sekä pyöriin ja ajoneuvoon kohdistuvat voimat selvitetään CAN – väylästä luettavien ajoneuvon antureiden ja IMU:n avulla. Järjestelmää simuloidaan käyttämällä Matlab:ia ja testataan käytännössä VW Transporter pakettiautossa. Testitulokset osoittavat järjestelmän toimivan tarkasti ja että ajoneuvon dynamiikkaan perustuvan kitkakertoimen mittauksen on käyttökelpoinen ja kustannustehokas tapa teiden liukkauden valvomiseen.

Computational modeling of stented coronary arteries

The application of computational fluid dynamics (CFD) and finite element analysis (FEA) has been growing rapidly in the various fields of science and technology. One of the areas of interest is in biomedical engineering. The altered hemodynamics inside the blood vessels plays a key role in the development of the arterial disease called atherosclerosis, which is the major cause of human death worldwide. Atherosclerosis is often treated with the stenting procedure to restore the normal blood flow. A stent is a tubular, flexible structure, usually made of metals, which is driven and expanded in the blocked arteries. Despite the success rate of the stenting procedure, it is often associated with the restenosis (re-narrowing of the artery) process. The presence of non-biological device in the artery causes inflammation or re-growth of atherosclerotic lesions in the treated vessels. Several factors including the design of stents, type of stent expansion, expansion pressure, morphology and composition of vessel wall influence the restenosis process. Therefore, the role of computational studies is crucial in the investigation and optimisation of the factors that influence post-stenting complications. This thesis focuses on the stent-vessel wall interactions followed by the blood flow in the post-stenting stage of stenosed human coronary artery. Hemodynamic and mechanical stresses were analysed in three separate stent-plaque-artery models. Plaque was modeled as a multi-layer (fibrous cap (FC), necrotic core (NC), and fibrosis (F)) and the arterial wall as a single layer domain. CFD/FEA simulations were performed using commercial software packages in several models mimicking the various stages and morphologies of atherosclerosis. The tissue prolapse (TP) of stented vessel wall, the distribution of von Mises stress (VMS) inside various layers of vessel wall, and the wall shear stress (WSS) along the luminal surface of the deformed vessel wall were measured and evaluated. The results revealed the role of the stenosis size, thickness of each layer of atherosclerotic wall, thickness of stent strut, pressure applied for stenosis expansion, and the flow condition in the distribution of stresses. The thicknesses of FC, and NC and the total thickness of plaque are critical in controlling the stresses inside the tissue. A small change in morphology of artery wall can significantly affect the distribution of stresses. In particular, FC is the most sensitive layer to TP and stresses, which could determine plaque’s vulnerability to rupture. The WSS is highly influenced by the deflection of artery, which in turn is dependent on the structural composition of arterial wall layers. Together with the stenosis size, their roles could play a decisive role in controlling the low values of WSS (<0.5 Pa) prone to restenosis. Moreover, the time dependent flow altered the percentage of luminal area with WSS values less than 0.5 Pa at different time instants. The non- Newtonian viscosity model of the blood properties significantly affects the prediction of WSS magnitude. The outcomes of this investigation will help to better understand the roles of the individual layers of atherosclerotic vessels and their risk to provoke restenosis at the post-stenting stage. As a consequence, the implementation of such an approach to assess the post-stented stresses will assist the engineers and clinicians in optimizing the stenting techniques to minimize the occurrence of restenosis.

Konepajan hitsaustuotannon kehittäminen kattavien laatuvaatimusten mukaiseksi

TIIVISTELMÄ Lappeenrannan teknillinen yliopisto Konetekniikan koulutusohjelma Voitto Kettunen Konepajan hitsaustuotannon kehittäminen kattavien laatuvaatimusten mukaiseksi Diplomityö 2015 167 sivua, 39 kuvaa, 26 taulukkoa ja 3 liitettä Tarkastajat: Professori Jukka Martikainen DI Pertti Kaarre Hakusanat: hitsaus, hitsauksen laatu, konepajan laadunhallinta, kattavat laatuvaatimukset, ISO 9001, ISO 3834, EN 1090 Keywords: welding, quality of welding, engineering workshop quality management, comprehensive quality requirements, ISO 9001, ISO 3834, EN 1090 Hitsaamalla liitetyt teräksiset rakenteet muodostavat ylivoimaisesti suurimman osan konepajatuotannosta. Niihin kuuluu esimerkiksi ajoneuvoja, koneita, laitteita, säiliöitä, siiloja, siltoja, mastoja, piippuja, tukirakenteita ja rakennusten runkoja. Tämän diplomityön tavoitteena on kehittää konepajan laadunhallinta sellaiseksi, että se mahdollistaa kattavien laatuvaatimusten täyttämisen hitsaustuotannossa. Laatuvaatimusten täyttämiseen pyritään käyttämällä hitsaustoimintojen standardia EN ISO 3834-2 sekä kantavien teräsrakenteiden standardeja EN 1090-1 ja EN 1090-2. Teräsrakenteiden suunnittelua ohjaa EN 1993 ja niiden toiminnallisia ominaisuuksia tuotestandardit, kuten terässavupiippu- ja säiliöstandardit. Kantavien teräsrakenteiden suunnittelua ja tuotantoa ohjaa myös seuraamusluokan CC, käyttöluokan SC ja tuotantoluokan PC kautta määräytyvä toteutusluokka EXC. Aikaisempaa enemmän tullaan panostamaan esimerkiksi asiakirjojen sähköiseen hallintaan, raaka-aineiden jäljitettävyyteen tuotteeseen, särmien ja kulmien muotoiluun, pintojen käsittelyyn, hitsien tarkastukseen, hitsaushenkilöstön pätevyyteen ja hitsaustuotannon tehokkuuteen. Saarijärven Säiliövalmiste Oy:n hitsauksen laadunhallinta sertifioitiin standardin ISO 3834-2 mukaan ja kantavien teräsrakenteiden FPC-järjestelmä standardisarjaa EN 1090 noudattaen. Samalla tehtiin päivitys laadunhallintajärjestelmään ISO 9001. Toteutus, joka tehtiin sovitussa aikataulussa, haastaa jokaisen toimijan konepajassa toiminnan, tuotannon ja tuotteiden laadun kehittämiseen uusia käytänteitä ja menetelmiä soveltaen. Kehitystoimien tuloksena toiminta on selkeämpää, ennakoitavampaa ja hallitumpaa, mikä lisää yrityksen toiminnan tuottavuutta ja kannattavuutta. Sertifioidut laatujärjestelmät ovat myötävaikuttaneet tilausten lisääntymiseen yrityksen kaikkien tuotteiden osalta.