Methods of genetic diversity creation and functional display for directed evolution experiments

Protein engineering aims to improve the properties of enzymes and affinity reagents by genetic changes. Typical engineered properties are affinity, specificity, stability, expression, and solubility. Because proteins are complex biomolecules, the effects of specific genetic changes are seldom predictable. Consequently, a popular strategy in protein engineering is to create a library of genetic variants of the target molecule, and render the population in a selection process to sort the variants by the desired property. This technique, called directed evolution, is a central tool for trimming protein-based products used in a wide range of applications from laundry detergents to anti-cancer drugs. New methods are continuously needed to generate larger gene repertoires and compatible selection platforms to shorten the development timeline for new biochemicals. In the first study of this thesis, primer extension mutagenesis was revisited to establish higher quality gene variant libraries in Escherichia coli cells. In the second study, recombination was explored as a method to expand the number of screenable enzyme variants. A selection platform was developed to improve antigen binding fragment (Fab) display on filamentous phages in the third article and, in the fourth study, novel design concepts were tested by two differentially randomized recombinant antibody libraries. Finally, in the last study, the performance of the same antibody repertoire was compared in phage display selections as a genetic fusion to different phage capsid proteins and in different antibody formats, Fab vs. single chain variable fragment (ScFv), in order to find out the most suitable display platform for the library at hand. As a result of the studies, a novel gene library construction method, termed selective rolling circle amplification (sRCA), was developed. The method increases mutagenesis frequency close to 100% in the final library and the number of transformants over 100-fold compared to traditional primer extension mutagenesis. In the second study, Cre/loxP recombination was found to be an appropriate tool to resolve the DNA concatemer resulting from error-prone RCA (epRCA) mutagenesis into monomeric circular DNA units for higher efficiency transformation into E. coli. Library selections against antigens of various size in the fourth study demonstrated that diversity placed closer to the antigen binding site of antibodies supports generation of antibodies against haptens and peptides, whereas diversity at more peripheral locations is better suited for targeting proteins. The conclusion from a comparison of the display formats was that truncated capsid protein three (p3Δ) of filamentous phage was superior to the full-length p3 and protein nine (p9) in obtaining a high number of uniquely specific clones. Especially for digoxigenin, a difficult hapten target, the antibody repertoire as ScFv-p3Δ provided the clones with the highest affinity for binding. This thesis on the construction, design, and selection of gene variant libraries contributes to the practical know-how in directed evolution and contains useful information for scientists in the field to support their undertakings.

Proteiinien muokkauksella tähdätään entsyymien ja sitojareagenssien ominaisuuksien parantamiseen geneettisten muutosten avulla. Tyypillisiä parannettavia ominaisuuksia ovat sitomisvoimakkuus, spesifisyys, kestävyys, tuotto-ominaisuudet ja liukoisuus. Koska proteiinit ovat monimutkaisia biomolekyylejä, geneettisten muutosten vaikutukset ovat vain harvoin tarkkaan ennustettavissa. Siksi suosittu proteiinien muokkausstrategia on luoda kohdemolekyylistä lukuisia geenivariantteja ja asettaa luotu joukko valintakokeeseen, jonka perusteella variantit erottuvat toisistaan tavoitellun ominaisuuden perusteella. Tämä suunnattuna evoluutiona tunnettu tekniikka on keskeinen työkalu kehitettäessä proteiinituotteita, joita käytetään monenlaisissa sovelluksissa vaatteiden pesuaineista syöpälääkkeisiin. Proteiinituotteiden kehitystyön nopeuttaminen edellyttää jatkuvasti uusia menetelmiä, joilla voidaan rakentaa aiempaa laajempia geenikirjastoja ja niille yhteensopivia valintatyökaluja. Tässä työssä tutkittiin alukepidennysmutageneesitekniikan mahdollisuuksia korkealaatuisempien geenivarianttikirjastojen rakentamiseksi Escherichia coli-bakteerin soluihin. Toisessa osajulkaisussa tutkittiin rekombinaatiota menetelmänä, jolla voitaisiin lisätä seulottavissa olevien entsyymivarianttien lukumäärää. Kolmannessa osajulkaisussa kehitettiin valintaprosessi, jonka tarkoituksena oli parantaa vastaainefragmenttien ilmentymistä filamenttifaagin pinnalla näyttötekniikkaa varten. Neljännessä osajulkaisussa testattiin geenikirjaston suunnittelustrategioita käytännössä kahdella eri periaatteiden mukaan monimuotoistetulla vasta-ainekirjastolla. Viimeisessä osajulkaisussa vertailtiin faagin eri pintaproteiineihin fuusioidun vasta-ainekirjaston toimintaa valintakokeiden avulla. Samalla tutkittiin vasta-ainefragmenttien Fab (engl. antigen binding fragment) ja ScFv (engl. single-chain fragment of antibody variable domains) vaikutusta valintakokeen onnistumiseen, jotta selviäisi, mikä on käyttökelpoisin näyttötekniikka käytössä olevan kirjaston hyödyntämiseksi. Tutkimuksen tuloksena kehitettiin uusi geenivarianttikirjaston rakennusmenetelmä nimeltään sRCA (engl. selective rolling circle amplification), joka lisää merkittävästi mutageneesitehokkuutta ja jopa yli satakertaistaa kirjaston muodostavien transformanttien määrän verrattuna tavanomaiseen alukepidennysmutageneesiin. Toisessa osajulkaisussa havaittiin Cre-loxP-rekombinaation olevan sovelias työkalu RCA-satunnaismutageneesin tuloksena syntyvän DNA-vyyhdin pilkkomiseen kehämäisiksi plasmidiyksiköiksi. Uusi menetelmä lisäsikin DNA:n transformaatiotehokkuutta E. coli-bakteeriin. Kirjastoseulontojen avulla osoitettiin, että kirjastosta, jossa aminohappojen vaihtelua esiintyi lähempänä vasta-aineen sitomiskohdan keskustaa, löytyi enemmän pienmolekyylejä ja peptidejä tunnistavia vasta-aineita. Ulompana keskustasta sijaitsevien aminohappojen vaihtelu puolestaan tuki proteiineja tunnistavien vasta-aineiden kehitystyötä. Vasta-ainekirjaston faaginäyttötekniikkavertailun johtopäätökset olivat, että käyttämällä filamenttifaagin vasta-aineiden fuusiokumppanina lyhennettyä proteiini kolmea (p3Δ) pystyttiin eristämään runsaammin erilaisia kohdetta tunnistavia vasta-ainemolekyylejä kuin käyttämällä kokopitkää proteiini kolmea tai proteiini yhdeksää (p9). Erityisesti ScFvp3Δ- formaatissa oleva kirjasto tarjosi sitomisvoimakkuudeltaan parhaita vasta-aineita molekyylikooltaan pienen digoksigeniinin tunnistukseen. Tutkimus geenivarianttikirjastojen suunnittelusta, rakentamisesta ja seulontaan soveltuvista valintatyökaluista lisää käytännön tietoa suunnattujen evoluutiokokeiden toteuttamiseksi ja on arvokasta tietoa alan tutkijoille heidän tulevissa hankkeissaan.