Evaluation der Leukämie-Reaktivität von PRAME- und p53-spezifischen T-Zellen bei lymphohämatopoetischen Neoplasien im Rahmen einer adoptiven Immuntherapie

Der Transplantat-gegen-Leukämie (GVL) Effekt als immuntherapeutisches Mittel bei der allogenen hämatopoetischen Stammzell Transplantation (HSZT) ist hauptsächlich durch Spender Lymphozyten vermittelt, welche hämatopoetische Minor-Histokompatibilitäts Antigene bzw. Leukämie-assoziierte Antigene (z. B.: PRAME, p53) erkennen. Der adoptive Transfer von Leukämie-spezifischen T-Zellen kann den GVL-Effekt, ohne ein Auftreten einer Transplantat-gegen-Wirt Erkrankung (GVHD), steigern. Unter Verwendung von HLA-A2 und human CD8 transgenen Mäusen (CD8yCyA2Kb) konnten in dieser Arbeit PRAME spezifische CD8+ zytotoxischen T-Zellen generiert werden. Diese zytotoxischen CD8+ T-Zellen zeigten in Chromfreisetzungsuntersuchungen lytische Aktivität gegen eine Vielzahl von Zelllinien, die PRAME endogen prozessieren sowie gegen das spezifische PRAME-Peptid. Des Weiteren wurden die hier generierten T-Zellen auf ihre zytotoxische Aktivität gegen akute myeloische Leukämie Blasten hin untersucht, und diese Untersuchungen zeigten AML-Reaktivität der PRAME-spezifischen sowie der als Vergleich genutzten p53- und HLA-A2-spezifischen T-Zellen. Das Potenzial der PRAME-spezifischen ZTL die GVL-Immunität in vivo zu erhöhen ohne das Vorkommen einer GVHD wurde in einem Tumor-Protektions-Model unter der Nutzung von NOD/SCIDgcnull Mäusen untersucht. Die PRA100- bzw. p53-ZTL wurden adoptiv in NOD/SCIDgcnull Rezipienten transferiert und gleichzeitig wurden die Tiere mit PRAME-, oder p53-exprimierende Tumorzelllinien inokuliert. Die Reduktion des Tumorwachstums bestätigte die Spezifität der T-Zellen auch in vivo. In weiteren in vivo Experimenten wurden NOD/SCIDgcnull Mäuse mit AML-Blasten rekonstituiert. Durch die Applikation von nur CD34 positiven Zellen aus einer AML-Probe, oder einer CD56 depletierten Probe, konnten Rekonstitutionen in 95 % aller Versuche erfolgreich beendet werden. Wurde eine Rekonstitution mittels PCR- und FACS-Analysen diagnostiziert, so folgten mehrere Applikationen der PRAME- oder p53-spezifischen ZTL. In diesen Untersuchungen konnten wir in einem therapeutischen AML-in vivo-Modell zeigen, dass die in diesen Untersuchungen generierten/verwandten ZTL in der Lage sind AML-Blasten in vivo zu bekämpfen und so die leukämische Last der Tiere im Blut sowie in der Milz auf unter 1 % zu regulieren. Der prozentuale Anteil humaner AML Zellen im Knochenmark konnte deutlich gesenkt werden (< 10 %). Zusammenfassend sind die von uns generierten PRAME-spezifischen T-Zellen in der Lage, in vitro und auch in vivo, endogen prozessiertes Protein auf Zelllinien und AML-Blasten zu erkennen und zu lysieren. Auch die p53-ZTL, welche als eine weitere Antigen-spezifische ZTL-Population in vivo getestet wurden, zeigten GVL-Effekte. Die Kenntnis von Tumor- bzw. Leukämie assoziierten Antigenen und die daraus erwachsene Möglichkeit der Generierung krankheitsspezifischer ZTL bietet die Grundlage für eine spezifische Immuntherapie maligner Erkrankungen.

Die Synthese eines Sialyl-Lewis X-Mimetikums als Baustein zur Herstellung von Glycopeptid-Zelladhäsionsinhibitoren für Selektine

Zelladhäsionsphänomene spielen eine wichtige Rolle in vielen biologischen Vorgängen, wie z. B. in der Embryogenese, der Wundheilung, der Immunantwort und Entzündungsprozessen. So wird die inflammatorische Kaskade durch P- und E-Selektin vermittelte Adhäsion der im Blutstrom zirkulierenden Leukozyten an Endothelzellen eingeleitet. Übermäßige Zelladhäsion kann hingegen eine Vielzahl von Krankheiten bewirken. Nachgewiesen ist eine solche Beteiligung der Selektine u. a. bei rheumatoider Arthritis, Erkrankungen der Herzkranzgefäße und dem Reperfusionssyndrom. Ein Ansatz zur Therapie besteht in der Verabreichung löslicher Selektinliganden, die kompetitiv an die Selektine binden und deren Aktivität dadurch mindern. Die wichtigste Leitstruktur für pharmakologisch aktive Selektinliganden stellt hierbei das Tetrasaccharid-Epitop Sialyl-Lewisx (sLex) dar.rnrnIn dieser Arbeit wurde nach einer nicht enzymatischen Strategie ein auf der sLex Struktur basierender Baustein für die Festphasen-Peptidsynthese synthetisiert. Aus diesem sollen nach Schutzgruppen-Manipulationen durch Einsatz in automatisierten Festphasen-Peptidsynthesen, verschiedene Glycopeptide als Zelladhäsionsinhibitoren für Selektine gewonnen werden. Der rasche Abbau der sLex-Struktur im Organismus schränkt die pharmakologische Nutzung von sLex-Derivaten jedoch stark ein. Das synthetisierte Kohlenhydrat Epitop weist daher gegenüber der natürlichen sLex-Struktur mehrere Modifikationen auf, die zu einer erhöhten metabolischen Stabilität führen sollen, ohne die für eine effektive Bindung zum Rezeptor nötigen Wechselwirkungen zu beeinträchtigen. rnrnAus diesem Grund wurde der synthetisch anspruchsvolle Sialinsäure-Baustein durch die L-Cyclohexylmilchsäure substituiert. Die Anbindung des Kohlenhydrat-Epitops an das Peptid wird im Gegensatz zur natürlichen N-glycosidischen Verknüpfung hier über eine zusätzliche Glucosamin-Einheit O-glycosidisch an die Aminosäure L-Threonin bewirkt. Außerdem wird der labile Fucose-Rest durch die D-Arabinose ersetzt, die nicht im menschlichen Organismus vorkommt, jedoch die drei essentiellen pharmakophoren Hydroxylfunktionen in der gleichen dreidimensionalen Orientierung präsentiert wie die L-Fucose.

Die Rolle des Fibronektins bei der Entstehung und dem Wachstum von Tumoren

Diese Arbeit befasst sich mit der Rolle des Fibronektins für die Entstehung und des Wachstums von Knochenmetastasen. rnrnTumorzellspezifische Faktoren bereiten entfernte Gewebe auf die Besiedelung durch disseminierte Tumorzellen vor. Dabei wird Fibronektin im Bereich der prämetastatischen Nische vermehrt gebildet. Dies führte zu der Annahme, dass Fibronektin eine wichtige Rolle bei der Entstehung von Tumoren einnimmt. Um die Bedeutung des Fibronektins bezüglich des Metastasierungsprozesses näher zu charakterisieren, wurde dieses im Bereich der vaskulären Nische über das Cre/loxP-System ausgeschaltet. Die Inaktivierung von zirkulierendem Fibronektin und Knochenmarks-Fibronektin in vivo hatte ein verlangsamtes Tumorwachstum zur Folge, welches auf eine um 22% verminderte Angiogenese zurückzuführen war. Im Gegensatz dazu beeinträchtigte die Ausschaltung des Osteoblasten-Fibronektins lediglich die frühen Entwicklungsstadien der Tumore. Diese Beobachtungen könnten einerseits mit der eingeschränkten Funktionsweise der Osteoblasten in Abwesenheit von Fibronektin erklärt werden, andererseits könnte der Einfluss auf das Fehlen osteoblastenspezifischer Fibronektin-Isoformen zurückgeführt werden, die die Metastasierung, Zelladhäsion, Proliferation und Motilität von Tumorzellen erhöhen. rnrnDie Deletion des Tumorzell-Fibronektins hatte eine durchschnittlich um 60% reduzierte Anzahl gebildeter Metastasen, ein eingeschränktes Tumorwachstum, hervorgerufen durch eine um 37% verminderte Blutgefäßanzahl, und letztendlich eine dreifache Verlängerung der mittleren Überlebensraten zur Folge. Die kombinierte Ausschaltung von lokalem Fibronektin und Tumorzell-Fibronektin vermochte den Einfluss auf die Etablierung und das Wachstum der Tumore zu verstärken. rnrnEin Drittel der Tiere, denen Metastasen induziert wurden, zeigten eine spontane Rückbildung der Tumore, ohne dass eine medizinische Intervention erfolgte. Dabei wurde zwischen einer kompletten Regression, bei der eine vollständige Rückbildung aller Tumore beobachtet werden konnte, und einer partiellen Regression, von der nur einzelne Tumore betroffen waren, unterschieden. Die spontane Regression war altersabhängig und trat 8-17 Wochen im Anschluss an die Applikation der Tumorzellen auf. Die vollständige Rückbildung der osteolytischen Knochenläsionen war mit dem Heilungsprozess des Knochengewebes verbunden, der sich in einer Verdichtung der Knochensubstanz äußerte. Erste Ergebnisse lieferten Hinweise darauf, dass die spontane Tumorregression auf eine mögliche Beteiligung von Granulozyten zurückzuführen war.rnrnZusammenfassend zeigten unsere Untersuchungen, dass sowohl Fibronektin der Mikroumgebung als auch Tumorzell-Fibronektin die Entwicklung und das Wachstum von Tumoren beeinträchtigte. Diese Arbeit lieferte erste Hinweise auf die Existenz eines sehr effektiven Mechanismus, der in Zusammenhang mit Fibronektin steht und dazu in der Lage ist, Tumorzellen selbst bei fortgeschrittenen Krebserkrankungen zu beseitigen. rn

Einfluss von Resveratrol auf oxidative DNA-Schäden und Mutagenese in vivo

Oxidative DNA-Basenmodifikationen, wie 7,8-Dihydro-8-oxoguanin (8-oxoG), werden endogen in allen Zellen gebildet. Die beobachtbaren Spiegel ergeben sich aus dem Gleichgewicht zwischen der Bildung durch reaktive Sauerstoffspezies (ROS), sowie der gleichzeitigen Reparatur der DNA-Schäden. Durch ihr hohes mutagenes Potential, tragen oxidative DNA-Basenmodifikationen zur spontanen Mutationsrate bei. Der Ausfall wichtiger DNA-Reparaturmechanismen führt in Ogg1(-/-)Csb(-/-)-Knockout-Mäusen zu einem Anstieg von 8 oxoG und der spontanen Mutationsrate.rnIn dieser Arbeit sollte untersucht werden, ob die basalen Spiegel an oxidativen Basenmodifikationen und die spontanen Mutationsraten in vivo durch die orale Gabe von Resveratrol moduliert werden können. Resveratrol ist ein Pflanzeninhaltsstoff (u.a. aus Rotwein) mit einer Vielzahl von Wirkungen, der bereits in zahlreichen Studien ein chemopräventives Potential gezeigt hat und antioxidativ wirkt.rnAn verschiedenen Mausgenotypen wurden zum einen eine Kurzzeit-Behandlung (7 Tage mit 100 mg/kg per Gavage) und zum anderen eine Langzeit-Behandlung (3-9 Monate mit 0,04% ad libitum) mit Resveratrol durchgeführt. Die oxidativen DNA Schäden wurden in primären Maushepatozyten mit Hilfe einer modifizierten Alkalischen Elution, mit der bakteriellen Formamidopyrimidin-DNA Glykosylase als Sonde, bestimmt. Zur Analyse der Mutationsrate wurde der BigBlue® Mutationsassay mit anschließender Sequenzierung der Mutationen verwendet.rnDie Ergebnisse zeigen, dass die Kurzzeit- und die Langzeit-Behandlung mit Resveratrol die basalen Spiegel oxidativer DNA-Basenmodifikationen senken. Die Reduktion ist jeweils wesentlich ausgeprägter in den reparaturdefizienten Ogg1(-/-)Csb(-/-)-Mäusen zu erkennen. Auch die spontane Mutationsrate wird durch eine mehrmonatige Behandlung mit Resveratrol um ungefähr 20-30% reduziert.rnAnschließende mechanistische Untersuchungen zeigten, dass dieser Schutz wahrscheinlich auf einer Induktion der antioxidativen Schutzmechanismen begründet ist. So wurde gefunden, dass primäre Hepatozyten aus mit Resveratrol behandelten Mäusen wesentlich besser gegen exogen herbeigeführten oxidativen Stress geschützt sind, als Hepatozyten von unbehandelten Tieren. Ein weiterer Hinweis ist die Hochregulation der mRNA-Spiegel von verschiedenen antioxidativen Schutzenzymen, wie Superoxiddismutase 1 / 2, Hämoxygenase 1, Glutathionperoxidase 1, nach der Gabe von Resveratrol in Mäuselebern. Außerdem sind die oxidativen Markermutationen (GC->TA-Transversionen) stärker von der Reduktion der spontanen Mutationsrate betroffen, als andere Mutationen (z.B. GC->AT-Transitionen).rnDie Ergebnisse zeigen erstmalig, dass spontane Mutationen in vivo durch Fremdstoffe in der Nahrung reduziert werden können. Im Falle von Resveratrol wird diese Reduktion wahrscheinlich durch eine Stimulation der antioxidativen Schutzmechanismen ausgelöst.rn

Copper and zinc stable isotope ratios as tracers of biogeochemical processes, sources and transport of Cu and Zn in soils

Copper and Zn are essential micronutrients for plants, animals, and humans; however, they may also be pollutants if they occur at high concentrations in soil. Therefore, knowledge of Cu and Zn cycling in soils is required both for guaranteeing proper nutrition and to control possible risks arising from pollution.rnThe overall objective of my study was to test if Cu and Zn stable isotope ratios can be used to investigate into the biogeochemistry, source and transport of these metals in soils. The use of stable isotope ratios might be especially suitable to trace long-term processes occurring during soil genesis and transport of pollutants through the soil. In detail, I aimed to answer the questions, whether (1) Cu stable isotopes are fractionated during complexation with humic acid, (2) 65Cu values can be a tracer for soil genetic processes in redoximorphic soils (3) 65Cu values can help to understand soil genetic processes under oxic weathering conditions, and (4) 65Cu and 66Zn values can act as tracers of sources and transport of Cu and Zn in polluted soils.rnTo answer these questions, I ran adsorption experiments at different pH values in the laboratory and modelled Cu adsorption to humic acid. Furthermore, eight soils were sampled representing different redox and weathering regimes of which two were influenced by stagnic water, two by groundwater, two by oxic weathering (Cambisols), and two by podzolation. In all horizons of these soils, I determined selected basic soil properties, partitioned Cu into seven operationally defined fractions and determined Cu concentrations and Cu isotope ratios (65Cu values). Finally, three additional soils were sampled along a deposition gradient at different distances to a Cu smelter in Slovakia and analyzed together with bedrock and waste material from the smelter for selected basic soil properties, Cu and Zn concentrations and 65Cu and 66Zn values.rnMy results demonstrated that (1) Copper was fractionated during adsorption on humic acid resulting in an isotope fractionation between the immobilized humic acid and the solution (65CuIHA-solution) of 0.26 ± 0.11‰ (2SD) and that the extent of fractionation was independent of pH and involved functional groups of the humic acid. (2) Soil genesis and plant cycling causes measurable Cu isotope fractionation in hydromorphic soils. The results suggested that an increasing number of redox cycles depleted 63Cu with increasing depth resulting in heavier 65Cu values. (3) Organic horizons usually had isotopically lighter Cu than mineral soils presumably because of the preferred uptake and recycling of 63Cu by plants. (4) In a strongly developed Podzol, eluviation zones had lighter and illuviation zones heavier 65Cu values because of the higher stability of organo-65Cu complexes compared to organo-63Cu complexes. In the Cambisols and a little developed Podzol, oxic weathering caused increasingly lighter 65Cu values with increasing depth, resulting in the opposite depth trend as in redoximorphic soils, because of the preferential vertical transport of 63Cu. (5) The 66Zn values were fractionated during the smelting process and isotopically light Zn was emitted allowing source identification of Zn pollution while 65Cu values were unaffected by the smelting and Cu emissions isotopically indistinguishable from soil. The 65Cu values in polluted soils became lighter down to a depth of 0.4 m indicating isotope fractionation during transport and a transport depth of 0.4 m in 60 years. 66Zn values had an opposite depth trend becoming heavier with depth because of fractionation by plant cycling, speciation changes, and mixing of native and smelter-derived Zn. rnCopper showed measurable isotope fractionation of approximately 1‰ in unpolluted soils, allowing to draw conclusions on plant cycling, transport, and redox processes occurring during soil genesis and 65Cu and 66Zn values in contaminated soils allow for conclusions on sources (in my study only possible for Zn), biogeochemical behavior, and depth of dislocation of Cu and Zn pollution in soil. I conclude that stable Cu and Zn isotope ratios are a suitable novel tool to trace long-term processes in soils which are difficult to assess otherwise.rn

Gene expression analysis in ‘Candidatus Phytoplasma mali’-resistant and -susceptible Malus genotypes

Apple proliferation (AP) disease is the most important graft-transmissible and vector-borne disease of apple in Europe. ‘Candidatus Phytoplasma mali’ (Ca. P. mali) is the causal agent of AP. Apple (Malus x domestica) and other Malus species are the only known woody hosts. In European apple orchards, the cultivars are mainly grafted on one rootstock, M. x domestica cv. M9. M9 like all other M. x domestica cultivars is susceptible to ‘Ca. P. mali’. Resistance to AP was found in the wild genotype Malus sieboldii (MS) and in MS-derived hybrids but they were characterised by poor agronomic value. The breeding of a new rootstock carrying the resistant and the agronomic traits was the major aim of a project of which this work is a part. The objective was to shed light into the unknown resistance mechanism. The plant-phytoplasma interaction was studied by analysing differences between the ‘Ca. P. mali’-resistant and -susceptible genotypes related to constitutively expressed genes or to induced genes during infection. The cDNA-Amplified Fragment Length Polymorphism (cDNA-AFLP) technique was employed in both approaches. Differences related to constitutively expressed genes were identified between two ‘Ca. P. mali’-resistant hybrid genotypes (4551 and H0909) and the ‘Ca. P. mali’-susceptible M9. 232 cDNA-AFLP bands present in the two resistant genotypes but absent in the susceptible one were isolated but several different products associated to each band were found. Therefore, two different macroarray hybridisation experiments were performed with the cDNA-AFLP fragments yielding 40 sequences encoding for genes of unknown function or a wide array of functions including plant defence. In the second approach, individuation and analysis of the induced genes was carried out exploiting an in vitro system in which healthy and ‘Ca. P. mali’-infected micropropagated plants were maintained under controlled conditions. Infection trials using in vitro grafting of ‘Ca. P. mali’ showed that the resistance phenotype could be reproduced in this system. In addition, ex vitro plants were generated as an independent control of the genes differentially expressed in the in vitro plants. The cDNA-AFLP analysis in in vitro plants yielded 63 bands characterised by over-expression in the infected state of both the H0909 and MS genotypes. The major part (37 %) of the associated sequences showed homology with products of unknown function. The other genes were involved in plant defence, energy transport/oxidative stress response, protein metabolism and cellular growth. Real-time qPCR analysis was employed to validate the differential expression of the genes individuated in the cDNA-AFLP analysis. Since no internal controls were available for the study of the gene expression in Malus, an analysis on housekeeping genes was performed. The most stably expressed genes were the elongation factor-1 α (EF1) and the eukaryotic translation initiation factor 4-A (eIF4A). Twelve out of 20 genes investigated through qPCR were significantly differentially expressed in at least one genotype either in in vitro plants or in ex vitro plants. Overall, about 20% of the genes confirmed their cDNA-AFLP expression pattern in M. sieboldii or H0909. On the contrary, 30 % of the genes showed down-regulation or were not differentially expressed. For the remaining 50 % of the genes a contrasting behaviour was observed. The qPCR data could be interpreted as follows: the phytoplasma infection unbalance photosynthetic activity and photorespiration down-regulating genes involved in photosynthesis and in the electron transfer chain. As result, and in contrast to M. x domestica genotypes, an up-regulation of genes of the general response against pathogens was found in MS. These genes involved the pathway of H2O2 and the production of secondary metabolites leading to the hypothesis that a response based on the accumulation of H2O2 in MS would be at the base of its resistance. This resembles a phenomenon known as “recovery” where the spontaneous remission of the symptoms is observed in old susceptible plants but occurring in a stochastic way while the resistance in MS is an inducible but stable feature. As additional product of this work three cDNA-AFLP-derived markers were developed which showed independent distribution among the seedlings of two breeding progenies and were associated to a genomic region characteristic of MS. These markers will contribute to the development of molecular markers for the resistance as well as to map the resistance on the Malus genome.

Photochemie der Troposphäre in niedrigen und mittleren Breiten: Die Rolle von Konvektion

Ozon (O3) ist in der Atmosphäre ein wichtiges Oxidanz und Treibhausgas. Während die höchsten Konzentrationen in der Stratosphäre beobachtet werden und die vor der gefährlichen UV-Strahlung schützende Ozonschicht bilden, können sich signifikante Änderungen der Ozon-Konzentration in der Region der Tropopause auf das Klima der Erde auswirken. Des Weiteren ist Ozon eine der Hauptquellen für das Hydroxylradikal (OH) und nimmt damit entscheidend Einfluss auf die Oxidationskraft der Atmosphäre. Der konvektive Transport von Ozon und seinen Vorläufergasen aus Regionen nahe der Erdoberfläche in die freie Troposphäre beeinflusst das Budget dieser Spezies in der Tropopausenregion.rnDie Datengrundlage der Studie in der vorliegenden Arbeit basiert auf den flugzeuggetragenen Messkampagnen GABRIEL 2005 (Suriname, Südamerika) sowie HOOVER I 2006 und HOOVER II 2007 (beide in Europa). Mit dem zur Verfügung stehenden Datensatz wird das Ozonbudget in der freien, unbelasteten Hintergrundatmosphäre und in der durch hochreichende Konvektion gestörten, oberen Troposphäre untersucht. Anhand der auf in-situ Messungen von O3, NO, OH, HO2 und dem aktinischen Strahlungsfluss basierten Berechnung der Netto-Ozonproduktionsrate (NOPR) werden für das Messgebiet Ozontendenzen in der unbelasteten Troposphäre abgeleitet und mit Simulationen des globalen Chemie-Transport-Modells MATCH-MPIC verglichen. Mit Hilfe zweier Fallstudien in den Tropen in Südamerika und den mittleren Breiten in Europa werden die Auswirkungen von hochreichender Konvektion auf die obere Troposphäre quantifiziert.rnDie Ergebnisse zeigen für die Grenzschicht in niedrigen und mittleren Breiten eine eindeutige Tendenz zur Produktion von Ozon, was für den tropischen Regenwald in der Messregion nicht der allgemeinen Erwartung entsprach, nach der diese Region durch die Zerstörung von Ozon charakterisiert sein sollte. In der oberen Troposphäre ab etwa 7 km wird für die beiden Regionen eine leichte Tendenz zur Ozonproduktion beobachtet. Signifikante Unterschiede zeigen die Ergebnisse für die mittlere Troposphäre. Während die Tropen in dieser Region durch eine eindeutige Tendenz zur Zerstörung von Ozon charakterisiert sind, lässt sich über den mittleren Breiten zwar eine hohe photochemische Aktivität aber keine derart klare Tendenz feststellen. Die hohen Breiten zeichnen sich durch eine neutrale Troposphäre in Bezug auf die Ozontendenz aus und weisen kaum photochemische Aktivität auf. Der Vergleich dieser Ergebnisse mit dem MATCH-MPIC Modell zeigt in weiten Teilen der Messregionen eine grundlegende Übereinstimmung in der Tendenz zur Produktion oder Zerstörung von Ozon. Die absoluten Werte werden vom Modell aber generell unterschätzt. Signifikante Unterschiede zwischen in-situ Daten und Modellsimulationen werden in der Grenzschicht über dem tropischen Regenwald identifiziert.rnDer Einfluss der Konvektion ist durch eine signifikant erhöhte NOPR gekennzeichnet. In dieser Arbeit wird in den Tropen mit einem Median-Wert von 0.20 ppbv h−1 eine um den Faktor 3.6 erhöhte NOPR im Vergleich zur ungestörten oberen Troposphäre abgeschätzt. In den mittleren Breiten führt die um eine Größenordnung höhere NO-Konzentration zu einem Wert von 1.89 ppbv h−1, was einer Überhöhung um einen Faktor 6.5 im Vergleich zum ungestörten Zustand entspricht. Diese Ergebnisse zeigen für beide Regionen in der oberen Troposphäre eine erhöhte Ozonproduktion als Folge konvektiver Aktivität. rnrnHochreichende Konvektion ist zudem ein sehr effektiver Mechanismus für den Vertikaltransport aus der Grenzschicht in die obere Troposphäre. Die schnelle Hebung in konvektiven Wolken führt bei Spurengasen mit Quellen an der Erdoberfläche zu einer Erhöhung ihrer Konzentration in der oberen Troposphäre. Die hochgradig löslichen Spurenstoffe Formaldehyd (HCHO) und Wasserstoffperoxid (H2O2) sind wichtige Vorläufergase der HOx-Radikale. Es wird angenommen, dass sie aufgrund ihrer Löslichkeit in Gewitterwolken effektiv ausgewaschen werden.rnIn der vorliegenden Arbeit wird eine Fallstudie von hochreichender Konvektion im Rahmen des HOOVER II Projekts im Sommer 2007 analysiert. Am 19.07.2007 entwickelten sich am Nachmittag am Südostrand eines in nordöstlicher Richtung ziehenden mesoskaligen konvektiven Systems drei zunächst isolierte konvektive Zellen. Flugzeuggetragene Messungen in der Aus- und der Einströmregion einer dieser Gewitterzellen stellen einen exzellenten Datensatz bereit, um die Auswirkungen von hochreichender Konvektion auf die Verteilung verschiedener Spurengase in der oberen Troposphäre zu untersuchen. Der Vergleich der Konzentrationen von Kohlenstoffmonoxid (CO) und Methan (CH4) zwischen der oberen Troposphäre und der Grenzschicht deutet auf einen nahezu unverdünnten Transport dieser langlebigen Spezies in der konvektiven Zelle hin. Die Verhältnisse betragen (0.94±0.04) für CO und (0.99±0.01) für CH4. Für die löslichen Spezies HCHO und H2O2 beträgt dieses Verhältnis in der Ausströmregion (0.55±0.09) bzw. (0.61±0.08). Dies ist ein Indiz dafür, dass diese Spezies nicht so effektiv ausgewaschen werden wie angenommen. Zum besseren Verständnis des Einflusses der Konvektion auf die Budgets dieser Spezies in der oberen Troposphäre wurden im Rahmen dieser Arbeit Boxmodell-Studien für den Beitrag der photochemischen Produktion in der Ausströmregion durchgeführt, wobei die gemessenen Spezies und Photolysefrequenzen als Randbedingungen dienten. Aus den Budgetbetrachtungen für HCHO und H2O2 wird eine Auswascheffizienz von (67±24) % für HCHO und (41±18) % für H2O2 abgeschätzt. Das für H2O2 überraschende Ergebnis lässt darauf schließen, dass dieses Molekül in einer Gewitterwolke deutlich effektiver transportiert werden kann, als aufgrund seiner hohen Löslichkeit aus der Henry-Konstanten zu erwarten wäre. Das Ausgasen von gelöstem H2O2 beim Gefrieren eines Wolkentropfens, d.h. ein Retentionskoeffizient kleiner 1, ist ein möglicher Mechanismus, der zum beobachteten Mischungsverhältnis dieser löslichen Spezies in der Ausströmregion beitragen kann.

Forensisch-anthropologische und traumatologische Untersuchungen an den menschlichen Skeletten aus der spätmittelalterlichen Schlacht von Dornach (1499 n. Chr.)

Der Forschungsgegenstand der vorliegenden Arbeit war die Identifikation und Interpretation von Traumata an menschlichen Skeletten. Neben einer umfassenden Darstellung des aktuellen Kenntnisstandes unter verschiedenen Gesichtspunkten wurden menschliche Überreste aus der Schlacht von Dornach 1499 n. Chr. untersucht. Ergänzend wurde eine Versuchsreihe mit Replika mittelalterlicher Waffen an Kunstköpfen durchgeführt. Für die Ansprache und Kategorisierung von Traumata an Skelettfunden existiert kein einheitliches und allgemein gebräuchliches System. Die verschiedenen Herangehensweisen und ihre Vor- und Nachteile wurden benannt und diskutiert. Nachfolgend wurden die Erscheinungsformen prä-, peri- und postmortaler Traumata bzw. Defekte sowie von Verletzungen durch stumpfe und scharfe Gewalt, Schussverletzungen und anderen Verletzungsarten dargestellt. Weitere besprochene Aspekte waren die Abgrenzung von Traumata gegen pathologische Veränderungen und anatomische Varianten sowie eine Diskussion der Methodik und Problematik der Erfassung von Verletzungsfrequenzen. Neben der Bestimmung von Geschlecht, Sterbealter und Körperhöhe wurden an den zur Untersuchung zur Verfügung stehenden Schädeln (N=106) und Femora (N=33) aus der Schlacht von Dornach 1499 n. Chr. pathologische und postmortale Veränderungen sowie als Schwerpunkt prä- und perimortale Traumata identifiziert und beschrieben. Die anthropologischen Befunde zeichneten das Bild einer in Hinsicht auf Sterbealter und Körperhöhe heterogenen Gruppe von Männern mit wenigen pathologischen Veränderungen. Die Ergebnisse wurden vor dem Hintergrund des spätmittelalterlichen Söldnerwesens diskutiert. An den Schädeln wurden insgesamt 417 perimortale Traumata identifiziert, wobei Hiebverletzungen stark überwogen. Die Entstehungsweise charakteristischer Merkmale von Hiebverletzungen konnte experimentell nachvollzogen werden. Weiter stellte sich heraus, dass Hiebverletzungen durch Schwerter und Hellebarden nur in Ausnahmefällen voneinander unterschieden werden können. Verletzungen durch punktuelle Einwirkungen und stumpfe Gewalt sowie Schussverletzungen wurden in weitaus geringerer Häufigkeit festgestellt. Experimentell konnte gezeigt werden, dass die Verletzungen durch punktuelle Einwirkungen mit einer Beibringung durch Langspiesse, Stossspitzen und Reisshaken von Hellebarden sowie Armbrustbolzen vereinbar sind, wobei beträchtliche Limitationen einer genaueren Waffenzuordnung offenkundig wurden. Die Verletzungen konnten als wohl typisch für die damalige Zeit bezeichnet werden, da sie das zeitgenössische Waffenspektrum deutlich widerspiegeln. Die Lokalisation der perimortalen Traumata am Schädel liess kein Muster erkennen, mit Ausnahme der Feststellung, dass grössere Schädelknochen mehr Verletzungen aufwiesen als kleinere. Diese regellose Verteilung wurde als Hinweis darauf verstanden, dass die Kampfweise keine „ritterliche“ gewesen sein dürfte, was in Einklang mit den damals geltenden Kriegsordnungen steht. Postmortale Veränderungen unterschiedlicher Art liessen vermuten, dass die untersuchten Individuen nicht bestattet wurden und dass die vom Schlachtfeld aufgesammelten Gebeine in Beinhäusern aufbewahrt wurden. Die Resultate bestätigten damit Angaben aus Schriftquellen und erlaubten die Zuordnung der Skelettreste zu Gefallenen des Reichsheeres. Beim Vergleich der Dornacher Stichprobe mit anderen mittelalterlichen Schlachtfeldserien traten sowohl hinsichtlich der anthropologischen Befunde als auch im Hinblick auf die Verletzungen und Verletzungsmuster deutliche Ähnlichkeiten zutage. Diese ergänzten nicht nur das lückenhafte Bild spätmittelalterlicher Heere und ihrer Kampfweise, sondern beleuchteten auch Unterschiede zwischen mittelalterlicher und neuzeitlicher Kriegsführung.

Untersuchung der Adhäsionskräfte in interaktiven Pulvermischungen zur Inhalation und deren Veränderung in Abhängigkeit von der Dichtigkeit der Verpackung

Die Untersuchung der Adhäsionskräfte mit Colloid Probe Technik, einer Weiterentwicklung der Rasterkraftmikroskopie (Atomic Force Microscopy=AFM), an erzeugten Carrier- und Wirkstoffkristallen bei Laborbedingungen und unter Einfluss der Luftfeuchte zeigte, dass die Adhäsion von Tiotropiumbromid Monohydrat an Mannitol deutlich höher ist als an Lactose Monohydrat. Die Kohäsionskräfte des Wirkstoffes sind stärker als die Adhäsionskräfte an Carriermaterialien. Auf dieser Grundlage wurde die Hypothese aufgestellt, dass eine Mischung mit Mannitol als Carrier eine kleinere Feinpartikeldosis liefert als eine Mischung mit Lactose. Diese Theorie wurde an interaktiven Pulvermischungen unter Variation von verschiedenen Einflussfaktoren überprüft. Die binare und ternäre Lactose-basierte Mischung lieferte unabhängig vom Kapselmaterial (Gelatine- und Polyethylenkapsel) eine höhere Feinpartikeldosis als die entsprechenden Mannitol-basierten Formulierungen. Die ternäre Komponente bewirkte nur bei Mannitol-basierten Mischungen eine Verbesserung der Feinpartikeldosis. Die detaillierte Untersuchung der aerodynamischen Verteilung ternärer Mischungen zeigte, dass das Kapselmaterial nur unter dem Einfluss der Luftfeuchte und Permeabilität der Blisterverpackung die interpartikulären Wechselwirkungen beeinflusst. Mischungen mit Mannitol als Carrier lieferten unabhängig vom Kapselmaterial, von Luftfeuchte/Lagerungsbedingungen und Permeabilität der Blisterverpackung eine kleinere Feinpartikeldosis als Mischungen mit Lactose als Carrier. Die Carrierart, die Permeabilität der Blisterverpackung und die Luftfeuchte wurden als Haupteinflussfaktoren auf die aerodynamischen Eigenschaften identifiziert. Es konnte gezeigt werden, dass AFM einen wertvollen Beitrag zum Verständnis der interpartikulären Wechselwirkungen leistet und aufgrund prädiktiver Eigenschaften hilfreich in der Entwicklung inhalativer Darreichungs-formen sein kann.

Komparative Analyse der humanen Chromosomenregion 11p15.3 um die Gene LMO1,TUB und der orthologen Region in der Maus

Ziel der vorliegenden Arbeit war die vergleichende Sequenzierung und nachfolgende Analyse des syntänen chromosomalen Abschnitts auf dem kurzen Arm des humanen Chromosoms 11 in der Region 11p15.3 mit den Genen LMO1, TUB und dem orthologen Genomabschnitt der Maus auf Chromosom 7 F2. Die im Rahmen dieser Arbeit durchgeführte Kartierung dieser beiden chromosomalen Bereiche ermöglichte die Komplettierung einer genomischen Karte auf insgesamt über eine Megabase, die im Kooperationssequenzierprojekt der Universitäts-Kinderklinik und dem Institut für Molekulargenetik in Mainz erstellt wurde. Mit Hilfe von 28 PAC- und Cosmid-Klonen konnten in dieser Arbeit 383 kb an genomischer DNA des Menschen und mit sechs BAC- und PAC-Klonen 412 kb an genomischer DNA der Maus dargestellt werden. Dies ermöglichte erstmals die exakte Festlegung der Reihenfolge der in diesem chromosomalen Abschnitt enthaltenen Gene und die genaue Kartierung von acht STS-Markern des Menschen, bzw. vier STS-Sonden der Maus. Es zeigte sich dabei, dass die chromosomale Orientierung telomer-/centromerwärts des orthologen Bereichs in der Maus im Vergleich zum Menschen in invertierter Ausrichtung vorliegt. Die Sequenzierung von drei humanen Klonen ermöglichte die Bestimmung von 319.119 bp an zusammenhängender genomischer DNA. Dadurch konnte die genaue Lokalisation und Strukturaufklärung der Gene LMO1, ein putatives Tumorsuppressorgen, das mit der Entstehung von Leukämien assoziiert ist, und TUB, ein Transkriptionsmodulator, der in die Fettstoffwechselregulation involviert ist, vorgenommen werden. Für das murine Genom wurden 412.827 bp an neuer DNA-Sequenz durch Sequenzierung von ebenfalls drei Klonen generiert. Der im Vergleich zum Menschen ca. 100 kb größere Genombereich beinhaltete zudem die neuen Gene Stk33 und Eif3. Es handelte sich dabei um zwei Gene, die erst im Rahmen dieser Arbeit entdeckt und charakterisiert wurden. Die parallele Bearbeitung beider Genombereiche ermöglichte eine umfassende komparative Analyse nach kodierenden, funktionellen und strukturgebenden Sequenzabschnitten in beiden Spezies. Es konnten dabei für beide Organismen die Exon-Intron-Strukturen der Gene LMO1/Lmo1 und TUB/Tub geklärt. Zudem konnten vier neue Exons und zwei neue speziesspezifischer Spleißvarianten für TUB/Tub beschrieben werden. Die Identifizierung dieser neuen Spleißvarianten offenbart neue Möglichkeiten für alternative Regulation und Funktion, oder für eine veränderte Proteinstruktur, die weitere Erklärungsansätze für die Entstehung der mit diesen Genen assoziierten Erkrankungen zulässt. In der sequenzierten, größeren Genomsequenz der Maus konnte in den flankierenden, nicht mit der sequenzierten Humansequenz überlappenden Bereich das neue Gen Eif3 in seiner Exon-Intron-Struktur und die beiden letzten Exons 11 und 12 des Gens Stk33 kartiert und charakterisiert werden. Die umfangreiche Sequenzanalyse beider sequenzierter Genombereiche ergab für den Abschnitt des Menschen insgesamt 229 potentielle Exonsequenzen und für den Bereich der Maus 527 mögliche Exonbereiche. Davon konnten beim Menschen explizit 21 Exons und bei der Maus 31 Exons als exprimierte Bereiche identifiziert und experimentell mittels RT-PCR, bzw. durch cDNA-Sequenzierung verifiziert werden. Diese Abschnitte beschrieben nicht nur die Exonbereiche der oben genannten vier Gene, sondern konnten auch neuen nicht weiter definierten EST-Sequenzen zugeordnet werden. Mittels des Interspeziesvergleiches war darüber hinaus auch die Analyse der nichtkodierenden Intergen-Bereiche möglich. So konnten beispielsweise im ersten Intron des LMO1/Lmo1 sieben Sequenzbereiche mit Konservierungen von ca. 90% bestimmt werden. Auch die Charakterisierung von Promotor- und putativ regulatorischen Sequenzabschnitten konnte mit Hilfe unterschiedlicher bioinformatischer Analyse-Tools durchgeführt werden. Die konservierten Sequenzbereiche der DNA zeigen im Durchschnitt eine Homologie von mehr als 65% auf. Auch die Betrachtung der Genomorganisation zeigte Gemeinsamkeiten, die sich meist nur in ihrer graduellen Ausprägung unterschieden. So weist ein knapp 80 kb großer Bereich proximal zum humanen TUB-Gen einen deutlich erhöhten AT-Gehalt auf, der ebenso im murinen Genom nur in verkürzter Version und schwächer ausgeprägt in Erscheinung tritt. Die zusätzliche Vergleichsanalyse mit einer weiteren Spezies, den orthologen Genomabschnitten von Fugu, zeigte, dass es sich bei den untersuchten Genen LMO1 und TUB um sehr konservierte und evolutiv alte Gene handelt, deren genomisches Organisationsmuster sich auch bei den paralogen Genfamilienmitglieder innerhalb derselben Spezies wiederfindet. Insgesamt konnte durch die Kartierung, Sequenzierung und Analyse eine umfassende Datenbasis für die betrachtete Genomregion und die beschriebenen Gene generiert werden, die für zukünftige Untersuchungen und Fragestellungen wertvolle Informationen bereithält.

Serumfreie Collagen-Monolayer- und Sandwich-Kulturen primärer Hepatozyten als ein wertvolles Modell zur Detektion von Toxizität und Arzneimittelwechselwirkungen in vitro

In dieser Arbeit wurden Zellkulturen primärer Hepatozyten von Ratte und Mensch hinsichtlich ihrer Eignung untersucht Speziesunterschiede der toxischen Wirkung und des Metabolismus von Substanzen darzustellen und inwieweit die in vitro-Ergebnisse in vivo vergleichbar bzw. übertragbar sind. Des Weiteren wurde ein Zellkulturmodell entwickelt, das eine Kultivierung von primären Hepatozyten aus Ratte, Mensch und Maus über einen Zeitraum von mindestens einer bis zwei Wochen erlaubt.rnrnDie Zellkulturen primärer Hepatozyten von Ratte und Mensch zeigten deutliche Unterschiede in der substanzinduzierten Veränderung der Genexpression nach Behandlung mit den, vor allem für den Menschen, lebertoxischen Substanzen Diclofenac und Troglitazon. Diese Unterschiede traten hauptsächlich in der Induktion fremdstoffmetabolisierender Enzyme sowie deren transkriptionsregulierenden Kernrezeptoren in den humanen Hepatozyten auf. Ebenso war eine verstärkte Stressantwort zu beobachten.rnDeutliche Speziesunterschiede konnten ebenso in der Wirkung der Arzneimittelentwicklungssubstanz EMD 392949 auf die Aktivität bzw. Genexpression von Cytochrom P450 Enzymen sowie deren Regulatoren nachgewiesen werden. Des Weiteren konnte hier eine sehr gute Übereinstimmung der Ergebnisse aus den Zellkulturen primärer Ratten- bzw. Humanhepatozyten mit jenen aus in vivo-Experimenten mit Ratten bzw. Affen (Macaca fascicularis) beobachtet werden, was die Aussagekraft der Primärkulturen verdeutlichte.rnDie große Übereinstimmung zwischen Enzymaktivität und Genexpression in der Induktion fremdstoffmetabolisierender Enzyme konnte durch die Behandlung mit einer Reihe speziesspezifischer Induktoren in Zellkulturen primärer Ratten- bzw. Humanhepatozyten bestätigt werden; vor allem nach dem von der amerikanischen Arzneimittelzulassungsbehörde (FDA, Food and Drug Administartion) vorgeschlagenen Bewertungsschema zur Untersuchung der CYP-Induktion.rnrnDie Lebensdauer sowie der Differenzierungsgrad von primären Hepatozyten in Kultur sind stark abhängig von den Zellkulturbedingungen. Durch diese Arbeit konnte gezeigt werden, dass spezifische Eigenschaften von Rattenleberzellen durch Kultivierung in einem Sandwich aus zwei hydratisierten Collagengelschichten und unter serumfreien Bedingungen für einen Zeitraum von mindestens zwei Wochen aufrechterhalten werden können. Dieses Kulturmodel konnte auf Primärhepatozyten von Mensch und Maus übertragen werden und erweitert die möglichen Anwendungen hin zu einer Behandlung über einen längeren Zeitraum und der Untersuchung von subchronischen Effekten.rn

Einfluss von Chromatin-Modulatoren auf Bildung, Reparatur und Mutagenität von DNA-Schäden

Die Entstehung von Mutationen, und somit der erste Schritt der Kanzerogenese, steht in engem Zusammenhang mit der Effektivität der DNA-Reparatur. Werden zur Fehlpaarung neigende (prämutagene) DNA-Schäden, wie z.B. die oxidative Läsion 8-oxoG, zu langsam oder auch fehlerhaft repariert, so führt dies zwangsläufig zu einer Erhöhung der Mutationsrate. Das Zusammenspiel zwischen Schadensentstehung und dessen Reparatur ist somit von großem Interesse. Ein wichtiger Faktor, der dieses Gleichgewicht beeinflussen könnte, ist die Chromatinstruktur, die entscheidend ist für die DNA-Zugänglichkeit.rnrnDie Frage, ob und in welchem Ausmaß der globale Kondensationsgrad des Chromatins die Entstehung und Reparatur von DNA-Schäden und damit die Entstehung von Mutationen beeinflusst, war der Ausgangspunkt für die vorliegende Arbeit. Um die Chromatinstruktur zu modulieren, wurden zum einen Resveratrol, zum anderen die HDAC-Inhibitoren Natriumbutyrat und Trichostatin A eingesetzt. Resveratrol führt, möglicherweise über eine SIRT1-Aktivierung, zu einem kondensierten und schlecht zugänglichen Chromatin. Die HDAC-Inhibitoren hingegen resultieren durch verstärkte Acetylierung von Histonen in einer global dekondensierten, offenen Chromatinstruktur. Mit Hilfe des Photosensibilisators Ro19-8022 in Kombination mit sichtbarem Licht, UV-B-Strahlung und Wasserstoffperoxid wurden in so veränderten Zellen verschiedene Arten von DNA-Schäden induziert, welche jeweils spezifisch sind für unterschiedliche Reparaturwege. Das Ausmaß induzierter Läsionen sowie deren Reparatur wurde mittels Alkalischer Elution und entsprechenden Reparaturendonukleasen bestimmt. rnrnDie Ergebnisse zeigen eine durch Resveratrol unbeeinflusste Schadensinduktion, andererseits jedoch eine deutliche Verlangsamung der Reparatur verschiedener Arten von DNA-Läsionen (oxidative Läsionen, Cyclobutanpyrimidindimere, Einzelstrangbrüche) und somit auch verschiedener Reparaturwege in AS52-Zellen. Die HDAC-Inhibitoren hingegen verursachen ein erhöhtes Ausmaß induzierter Läsionen, jedoch keine Änderung der Reparaturgeschwindigkeit. Die Entstehung spontaner und induzierter Mutationen zeigt sich durch Resveratrol unbeeinflusst, HDAC-Inhibitoren resultieren in signifikant erniedrigten Mutationsraten in AS52-Zellen. Letzterer Effekt ist durch die beobachteten Einflüsse auf Reparatur und Suszeptibilität in den Zellen nicht erklärbar und bedarf einer mechanistischen Aufklärung. Die durch Resveratrol beobachtete Reparatur-Retardierung wurde mechanistisch weiter untersucht. Durch Inhibierung von SIRT1, einer durch Resveratrol aktivierten Deacetylase, konnte dessen Beteiligung an der Reparaturverlangsamung ausgeschlossen werden. Auch eine Beteiligung von oxidativem Stress, dem MAPK-Signalweg (ERK 1/2, p38) oder p53 konnte ausgeschlossen werden. Die Durchführung der Reparaturversuche mit menschlichen HeLa-Zellen zeigten, dass die durch Resveratrol verursachten Effekte quantitativ stark zelltypabhängig sind. Während die Reparatur in HeLa-Zellen deutlich weniger beeinflusst wird, sind dennoch andere Parameter wie Proliferation und Glutathionspiegel eher stärker verändert wie in AS52-Zellen. Der Mechanismus der durch Resveratrol verursachten Reparaturhemmung bedarf somit weiterer Untersuchungen.rn

Etablierung und Optimierung von Therapeutischem Drug Monitoring für die Psychopharmakotherapie von Patienten mit Substanzabhängigkeit

Therapeutisches Drug Monitoring (TDM) findet Anwendung in der Therapie mit Immunosuppressiva, Antibiotika, antiretroviraler Medikation, Antikonvulsiva, Antidepressiva und auch Antipsychotika, um die Effizienz zu steigern und das Risiko von Intoxikationen zu reduzieren. Jedoch ist die Anwendung von TDM für Substanzen, die Einsatz finden in der Rückfallprophylaxe, der Substitution oder dem Entzug von Abhängigkeitserkrankungen nicht etabliert. Für diese Arbeit wurde im ersten Schritt eine sensitive Rating-Skala mit 22 Items entwickelt, mit Hilfe derer der theoretische Nutzen von TDM in der Pharmakotherapie von substanzbezogenen Abhängigkeitserkrankungen auf der Basis von pharmakologischen Eigenschaften der Medikamente und von Patientencharakteristika evaluiert wurde. Die vorgenommene Einschätzung zeigte für Bupropion, Buprenorphin, Disulfiram (oder einen Metaboliten), Methadon (chirale Bestimmung wenn möglich) und Naltrexon einen potentiellen Nutzen von TDM.rnFür die meisten Medikamente, die zur Behandlung von Abhängigkeitserkrankungen zugelassen sind, fehlen valide Messverfahren für TDM. Im Alltag werden überwiegend Drogen Screening-Tests in Form immunologischer Schnelltests angewendet. Für die Anwendung von TDM wurden in dieser Arbeit chromatographische Verfahren für die Bestimmung von Naltrexon und 6β-Naltrexol, Bupropion und Hydroxybupropion sowie R,S-Methadon und R,S-2-Ethyliden-1,5-dimethyl-3,3-diphenylpyrrolidin entwickelt, optimiert und validiert. Es handelt sich dabei HPLC-UV-Methoden mit Säulenschaltung sowie zur Bestimmung von Naltrexon und 6β-Naltrexol zusätzlich eine LC-MS/MS-Methode. Voraussetzung für die Interpretation der Plasmaspiegel ist im Wesentlichen die Kenntnis eines therapeutischen Bereichs. Für Naltrexon und seinen aktiven Metaboliten 6β-Naltrexol konnte eine signifikante Korrelation zwischen dem auftretenden Craving und der Summenkonzentration gefunden werden. Mittels Receiver-Operation-Characteristics-Kurven-Analyse wurde ein Schwellenwert von 16,6 ng/ml ermittelt, oberhalb dessen mit einem erhöhten Ansprechen gerechnet werden kann. Für Levomethadon wurde bezüglich der Detoxifikationsbehandlung ein Zusammenhang in der prozentualen Reduktion des Plasmaspiegels und den objektiven und subjektiven Entzugssymptomen gefunden. rnDoch nicht nur die Wirkstoffe, sondern auch das Patientenmerkmal substanzbezogene Abhängigkeit wurde charakterisiert, zum einen bezüglich pharmakokinetischer Besonderheiten, zum anderen in Hinsicht auf die Therapietreue (Adhärenz). Für Patienten mit komorbider Substanzabhängigkeit konnte eine verminderte Adhärenz unabhängig von der Hauptdiagnose gezeigt werden. Die Betrachtung des Einflusses von veränderten Leberwerten zeigt für komorbide Patienten eine hohe Korrelation mit dem Metabolisiererstatus, nicht aber für Patienten ohne Substanzabhängigkeit.rnÜbergeordnetes Ziel von TDM ist die Erhöhung der Therapiesicherheit und die Steigerung der Therapieeffizienz. Dies ist jedoch nur möglich, wenn TDM im klinischen Alltag integriert ist und korrekt eingesetzt wird. Obwohl es klare Evidenz für TDM von psychiatrischer Medikation gibt, ist die Diskrepanz zwischen Laborempfehlung und der klinischen Umsetzung hoch. Durch Intensivierung der interdisziplinären Zusammenarbeit zwischen Ärzten und Labor, der Entwicklung von interaktivem TDM (iTDM), konnte die Qualität der Anwendung von TDM verbessert und das Risiko von unerwünschten Arzneimittelwirkungen vermindert werden. rnInsgesamt konnte durch die eigenen Untersuchungen gezeigt werden, dass TDM für die medikamentöse Einstellung von Patienten mit Abhängigkeitserkrankung sinnvoll ist und dass optimales TDM eine interdisziplinäre Zusammenarbeit erfordert.rn

Identifizierung und Quantifizierung der Ketocarotinoide in Dauerstadien von Grünalgen und Ketocarotinoidbiosynthese im Modellorganismus Chlamydomonas reinhardtii

Grünalgen bilden zur Überdauerung schlechter Umweltbedingungen Ruhestadien, die sich durch Ausbildung einer festen Zellwand, die Reduktion des Plastiden und die starke Akkumulation von Speicherfetten und Ketocarotinoiden im Zytosol auszeichnen. Obwohl Ketocarotinoide in Grünalgen seit über vierzig Jahren beforscht werden, gab es hierzu noch wenige molekularbiologische Untersuchungen. Im Vorfeld meiner Promotion wurde durch unsere Arbeitsgruppe entdeckt, dass auch der molekular gut zugängliche Modellorganismus Chlamydomonas reinhardtii im Zygotenstadium große Mengen an Ketocarotinoiden bildet. Neben dem zu erwartenden Ketocarotinoid Astaxanthin fanden wir große Mengen des bisher nur in einer Grünalge beschriebenen 4-Ketoluteins. Vorversuche ließen die Vermutung aufkommen, dass dieses Pigment bei der Untersuchung der Pigmentausstattung in Dauerstadien von vielen Grünalgen bisher übersehen wurde. rnIn der vorliegenden Arbeit wurde daher zunächst die Pigmentzusammensetzung von Dauerstadien der bereits gut untersuchten Grünalgen Muriella zofingiensis und Scenedesmus rubescens durch Vergleich mit dem Ketocarotinoidmuster aus Dauerstadien von C. reinhardtii und Fritschiella tuberosa reevaluiert und dabei erstmals das Vorkommen signifikanter Mengen an 4-Ketolutein nachgewiesen. Außerdem zeigte sich, dass die als bisheriger Modellorganismus der Ketocarotinoidbiosynthese in Grünalgen sehr gut untersuchte Alge Haematococcus pluvialis eher eine Ausnahme darstellt, da ihre Dauerstadien als einzige der hier untersuchten Algen nur minimale Mengen von 4 Ketolutein aufwiesen. Diese Beobachtungen machen es sehr wahrscheinlich, dass die Fähigkeit zur Bildung von 4-Ketolutein unter den Grünalgen wesentlich weiter verbreitet ist als bisher angenommen. Das sekundäre Carotinoid 4-Ketolutein kam in den Dauerstadien der Grünalgen neben seiner freien Form ausschließlich als Monoacylester vor, im Gegensatz zu Astaxanthin, das als mono- und diacylierte Form auftrat. rnÜber die Analyse der Pigmentausstattung hinaus konnten die entscheidenden Schritte des Synthesewegs der Ketocarotinoide in C. reinhardtii durch funktionelle Charakterisierung der beteiligten Enzyme in Bakterien aufgeklärt werden. Als Basis für die Charakterisierungen wurde ein umfangreiches Portfolio von carotinogenen E. coli-Bakterien etabliert, darunter α Carotin und Lutein produzierende Stämme, die bisher nicht zur Verfügung standen. Das wurde durch die Klonierung der Lycopinzyklase (OluLCY) aus der Grünalge Ostreococcus lucimarinus möglich, die eine Sonderolle unter den Zyklasen einnimmt, da sie die Lycopin-β-Zyklase und Lycopin-ε-Zyklase in einem Fusionsenzym vereint. Vorteile dieses Fusionsenzyms sind die Expressionskontrolle durch nur einen Promotor und die weitgehend konstante Stöchiometrie seiner Produkte α-Carotin und β-Carotin, was die OluLCY für die biotechnologische Anwendung prädestiniert.rnDie funktionelle Charakterisierung der Carotinoidbiosyntheseenzyme aus C. reinhardtii umfasste das Schlüsselenzym der Ketocarotinoidbiosynthese, die β-Carotin-Ketolase (BKT), sowie die Carotinoid-Hydroxylasen CHYB, CYP97A5 und CYP97C3. Dabei wurde für das BKT-Enzym aus C. reinhardtii nachgewiesen, dass es nicht nur die Ketolierung von β Carotin zu Canthaxanthin und von Zeaxanthin zu Astaxanthin, sondern auch die Bildung der von α-Carotin abgeleiteten Ketocarotinoide wie 4-Keto-α-Carotin und 4 Ketolutein katalysieren kann.rn

Elementanalytik und Isotopenverhältnisbestimmungen an humanbiologischen Materialien

Ziel der Arbeit war es, festzustellen, inwieweit die Bestimmung der Konzentrationen und der Isotopenverhältnisse verschiedener Elemente in humanbiologischen Materialien dazu geeignet ist, Informationen über Herkunft und Wohnort oder zurückliegende Ortswechsel einer Person aufzuzeigen. Dieses Forschungsprojekt wurde in Zusammenarbeit mit dem Bundeskriminalamt Wiesbaden durchgeführt. Dort werden in dem seit 2008 laufenden Projekt „Isohaar“ vor allem Haare, aber auch Fingernägel, von Personen vor, während und nach einer Auslandsreise gesammelt. An diesen Materialien sollte überprüft werden, ob ein Ortswechsel Einfluss auf die Elementgehalte und/oder Isotopenverhältnisse hat.rnAls elementanalytische Methoden wurden die Neutronenaktivierungsanalyse (NAA) und die induktiv gekoppeltes Plasma-Massenspektrometrie (ICP-MS) an flüssigen Aufschlüssen der Proben, sowie direkt an den Proben mittels Laser Ablation (LA-ICP-MS) erprobt. Die Isotopenverhältnisse der Elemente Kohlenstoff und Stickstoff wurden mittels Isotopenverhältnis-Massenspektrometrie (IRMS) bestimmt, die der schweren Elemente Strontium und Blei mittels Thermionen-Massenspektrometrie (TIMS).rnMittels Flüssig-ICP-MS wurde ein Konzentrationsanstieg für einige Elemente (z.B. Na, Mg Ba, Cu, Sr und Ca) vom Haaransatz (jüngster Haarabschnitt) zur Haarspitze (ältester Haarabschnitt) einer analysierten Strähne gefunden. Die Spender dieser Proben hatten keinen Ortswechsel vollzogen. Bei Haarproben von Personen, die einen Aufenthaltsortswechsel erlebt hatten, zeigten sich markante Konzentrationserhöhungen bei Eisen, Mangan, Titan und Blei in den betreffenden Abschnitten. Diese Elemente scheinen evtl. das Potential zu haben, Ortswechsel anzuzeigen.rnBei den Isotopenverhältnissen von Kohlenstoff und Stickstoff konnten einige Unterschiede zwischen verschiedenen Aufenthaltsorten einer Person gefunden werden. Diese Änderungen werden mit der häufig unausweichlichen unterschiedlichen Ernährungsweise des Haarspenders bei Reisen in Zusammenhang gebracht. Die Isotopenverhältnisse von Strontium und Blei konnten bisher nicht einem bestimmten Land oder einer Region zugeordnet werden. Die Proben zwischen den einzelnen Teilnehmern unterschieden sich jedoch. rnFür die Zukunft sollte versucht werden, die Ergebnisse der Analysenmethoden miteinander zu kombinieren, um aussagekräftigere Hinweise auf einen möglichen Ortswechsel zu erhalten.rn