花粉管通道遗传转化方法的新证据

将pBIN35S-mGFP4质粒转入受体菌DH5α中，扩繁后提取纯化质粒DNA，待棉花盛花期时，用花粉管通道转化方法将其注射到授粉24小时左右的子房中。在被检测的950个发育10～20天左右的幼胚中，发现七个幼胚在蓝光(460～490nm)激发下发出绿色荧光，而对照发出程度不同的红色荧光。将收获的“转化种子”浸泡萌发得到生长5～6天的黄化无菌苗，在200粒种子来源的无菌苗中，检出两棵转化植株。在紫外光照射灯下转化植株发出绿色荧光，其叶片和下胚轴横切面在蓝光激发下也与对照明显不同。PCR及Southern blotting结果均证实转化植株的真实性，从而为花粉管通道转化方法的可行性提供了直接可靠的细胞及分子生物学证据。 将GFPmut1质粒的gfp通过一端平接一端粘接后重组到pBI121的BamH1和Sal1限制性酶切位点从而代替GUS基因，然后将新的重组质粒用三亲交配法转入到LBA4404菌株中得到双元载体，用于棉花下胚轴切段的转化。结果表明，gfp象gus一样可作为报告基因用于农杆菌介导的棉花转化。在对筛选培养基上生长的“抗性愈伤”进一步进行报告基因检测时，只需手持紫外灯就可以检出GFP阳性愈伤，大大减少了工作量和试验费用。 另外，在进行农杆菌转化前的棉花卡那霉素敏感性实验中发现，卡那霉素对棉花下胚轴的愈伤组织形成和增殖均有明显的抑制作用，随其浓度的增加，愈伤组织形成的频率降低，增殖的倍数减小;当浓度增加到100mg/L时，愈伤组织严重褐化，其正常生长受到完全抑制;下胚轴形态学上端切段较下端更易受卡那霉素的影响。

H-OLE1基因的克隆与功能鉴定及维管组织分化的激素调节

脂肪酸是生物体内普遍存在、具重要生理功能的物质，亦是重要的化工原料。研究脂肪酸生物合成及其调控，既是揭示生命活动基本规律的需要，又具巨大的经济价值。多形汉逊氏酵母(Hansenula polymorpha)是一种甲基嗜热酵母，能合成多聚不饱和脂肪酸，是研究脂肪酸生物合成的理想材料之一。为阐明多形汉逊氏酵母细胞中脂肪酸生物合成途径、关键步骤、调节机理，并利用此系统生产有用脂肪酸，我们开展了不饱和脂肪酸生物合成关键酶基因--△9-脂肪酸去饱和酶基因研究。 以P. angusta IFO 1475的P-OLE1基因为探针，Southern杂交分析，发现在亲缘关系很近的不同种类的甲基嗜热酵母如H. pofymorpha、Pichia angusta、P. pastoris、P. methanolica和Candida boMinii中Δ9-脂肪酸去饱和酶基因的结构多形性。 构建了H. polymorpha CBS 1976染色体Δ9-脂肪酸去饱和酶基因座位的限制性酶切图谱，进而分离了3.4 kb BamHI-XhoI基因片段并进行全序列分析，结果表明这个片段含1个与已克隆的酵母Δ59-脂肪酸去饱和酶基因高度同源的、由1353 bp组成的ORF。推导的H-OLE1多肽具脂肪酸去饱和酶的一些基本特征，如含2个结构域：1个位于N一端、含3个保守的组氨酸簇、具催化功能，另1个位于C-端、参与脱饱和反应中电子传递、类似细胞色素b5。将这个序列申报DDBJ，获得Accession number为：AB024576，推导的蛋白的氨基酸序列的Accession number为：BAA75902。 为验证H-OLE1基因的功能，建立了多形汉逊氏酵母DNA电穿孔实验系统，进行了遗传互补测验。发现完整的H-OLE1基因可互补缺乏Δ59-脂肪酸去饱和酶活性的多形汉逊氏酵母营养缺陷型fadl突变体，却不能互补相应的酿酒酵母olel突变体，而由酿酒酵母GAP表达框架和H-OLE1 ORF组成的嵌合基因可互补上述olel突变体。说明H-OLE1基因编码Δ9-脂肪酸去饱和酶，多形汉逊氏酵母的Δ9-脂肪酸去饱和酶和酿酒酵母的脂肪酸脱饱和系统相亲和，而H-OLE1基因的启动子在异源细胞中没有活性。 为研究H-OLE1基因的转录及其调节规律，通过一系列实验，首次找到了可在研究多形汉逊氏酵母基因表达时用作内标的GAP基因。Northern杂交发现，H-OLE1基因在细胞中以较低水平表达，产生1.5 kb的转录子;基因表达略受不饱和脂肪酸的抑制;在多形汉逊氏酵母HOLE1基因的转录调节中，Choi等在酿酒酵母OLE1基因中发现的脂肪酸调节元件FAR可能不是关键的。 利用基因敲除技术，通过转化H-OLE1∷S-LEU2线性DNA到多形汉逊氏酵母二倍体细胞(fadl／FADl)中，首次构建了多形汉逊氏酵母H-OLE1基因的破坏株。遗传学和分子生物学研究表明，破坏株细胞中线性DNA定位串联多拷贝整合到染色体中并置换了fadl突变部位。利用气相色谱分析了ΔH-OLE1破坏株、fadl-2突变株、野生型菌株及含H-OLE1基因转化子的细胞总脂肪酸，发现多形汉逊氏酵母细胞中除18:0→18:1(Δ9)→18:2(Δ9,12)→18:3(Δ9,12,15)这个脂肪酸去饱和主路外，还可能存在其它几个脱饱和反应与延长反应，如16:1(Δ9)→16:2(Δ9,12)→18:2(Δ11,14);16:1(Δ9)→18:1(Δ11)→18:2(Δ11,15)等。 近年维管组织分化研究进展迅速，取得大量可喜结果，也存在许多不足，如细胞分化调节机理，特别是激素诱导的分子机理研究比较薄弱。为建立研究维管组织分化的理想系统，研究嫁接体发育的激素调节机制，在Parkinson和Yeoman发明的离体茎段嫁接系统的基础上，研究了激素对嫁接体发育特别是维管组织分化的影响。 采用不同的嫁接方法，用试管苗对黄瓜离体茎段自体嫁接、亲和性的黄瓜／黑籽南瓜与不亲和性的黄瓜／绿豆离体茎段嫁接组合进行研究，建立了嫁接过程简单、污染率低的试管苗离体茎段嫁接系统。利用往培养基中添加或不加植物激素研究嫁接体发育，发现通过改变培养基中的植物激素，可使亲和的嫁接体难以形成贯通砧木和接穗的维管束桥，也可诱导非亲和性的嫁接体产生维管束桥。初步研究证明利用植物激素可以克服嫁接不亲和性，这一结果是嫁接基础理论研究的一个重要进展，对揭示嫁接亲和性机制具重要意义。由于黄瓜绿豆嫁接组合中，砧木绿豆是可以固氮的豆科植物，研究结果具有潜在的应用前景。 详细地研究了外源IAA和玉米素(ZT)对黄瓜自体嫁接系统中维管束桥形成时间和数目特别是贯通砧木和接穗的管状分子数的影响。当砧木和接穗培养基中都没有添加植物激素时，嫁接接合部难以产生维管束桥，也难以产生贯通的管状分子。当培养基中添加植物激素时，维管束桥数和贯通的管状分子数随激素浓度和种类的不同而不同。本实验的最佳激素条件是：在接穗培养基中加IAA 1.0 mg／L和ZT 0.25 mg／L，在砧木培养基中加ZT 0.25 mg／L。研究表明在试管苗离体茎段自体嫁接系统中，外源激素是嫁接成功的必要条件。试管苗离体茎段嫁接系统是一个理想的研究植物维管组织分化的新系统。 通过对嫁接体发育期接合部及嫁接体各部分IAA、玉米素及玉米素核苷(Z+ZR)的ELISA分析，发现嫁接接合部维管束的再生受IAA和Z+ZR含量的共同调节;连接接穗和砧木维管束桥的分化比维管束的网联要求更高的IAA水平及LAA(Z+ZR)比率。 上述结果为利用嫁接系统研究维管组织分化机理奠定了基础，使进一步研究嫁接体发育的激素调节机理成为可能。

转基因植物生产生物可降解塑料PHB的研究-phbA功能鉴定、多价表达载体的构建及转基因植物的获得

聚-β-羟基链烷酸（PHA）是许多微生物作为碳源、能源的一类贮藏性聚酯，具有广泛的应用价值。该聚酯可被微生物完全降解且有与塑料相似的性质，因而研究并提高PHA在植物中的合成为解决环境污染提供了新的解决途径。 聚-β-羟基于酸酯（PHB）是研究的最早、研究的最清楚的一种PHA。用聚合酶链式反应扩增并克隆了真养产碱杆菌（Alcaligenes eutrophus）中合成PHB的一个关键酶——3-酮硫裂解酶基因phbA。DNA序列分析表明所克隆的基因与国外报道序列同源性很高，只有一个碱基对的区别。为了检测该基因的功能及导肽的定位效率，构建了带有导肽基因的组成型表达载体，由根癌农杆菌介导转化烟草（Nicotiana tabacum cv. Wisconsin 38）得到转基因植株。蛋白质电泳结果表明导肽可以将外源蛋白定位于质体，phbA基因能翻译成相应大小的蛋白。酶活性分析证实了转基因烟草中phbA编码的3-酮硫裂解酶可以催化乙酰-CoA合成乙酰乙酰-CoA。 将携有导肽序列的phbC（编码PHB合酶）和phbB（编码乙酰乙酰-CoA还原酶）连入pBIB-HYG得到组成型表达载体pZCB，用冻融法转入根癌农杆菌，介导转化烟草。烟草为已获得的具有卡那霉素抗性整合并表达phbA的转基因烟草。通过二次转化将携有潮霉素抗性的phbB基因和phbC基因导入已整合phbA的烟草，各基因均由质体导肽控制，最后得到整合PHB合成的三个酶基因的转基因烟草。转基因烟草经PCR、PCR-Southern检测，初步确定整合phbB和phbC烟草植株。以气相色谱初步分析，转基因烟草中PHB的含量可达鲜重的0.233%。 结果表明phbB和phbC基因可以在真核表达系统中编码相应的蛋白。通过色素分析、荧光动力学等手段分析了PHB在叶绿体中的累积对其功能的影响。 为了提高底物乙酰-CoA的供应能力及减少惰性聚酯对植物体的伤害，分离了种子特异性启动子和质体导肽序列，利用忆经克隆的合成PHB的三个关键酶基因，通过一系列DNA重组，分别构建了含有种子特异性启动子的嵌合phbC、phbB的二价表达载体pSCB及嵌合phbC、phbA、phbB的三价表达载体pSCAB，并由导肽将基因表达产物定位于质体。经根癌农杆菌介导转化油菜（Brassica napus L.) H165，获得转基因油菜植株，并进行了PCR、Southern blot及RT-PCR-DNA杂交等分检测。结果表明，三基因已经分别整合到相应的转基因油菜中，并已在转录水平表达。同时转化了油菜不育系、恢复系和保持系，获得批量转化株，并移入温室栽培。

小麦春化相关基因的克隆及其功能分析

一． 小麦相关基因ver203F cDNA全序列克隆与功能分析 　　根据本实验室通过差异筛选技术克隆到的与春化相关的基因cDNA verc203的序列，设计PCR 5’端PCR引物，利用RACE（rapid amplification of cDNA ends）克隆策略，得到春化相关基因ver203基因的同源基因ver203F cDNA的3’端序列，长度为1,197bp。Northern分析表明ver203F全长约为1.5 kb，且其表达具有春化处理的特异性。根据3’RACE克隆的ver203F 3 ’端核苷酸序列设计了3’端PCR引物，利用5’RACE克隆到该基因的5’端片段，经DNASIS核酸分析软件分析将5’45RACE和3’RACE DNA序列拼接合并，得到ver203F全长cDNA，从TdT加尾5’末端到poly A全长为1,561 bp，5’端起始密码子ATG上游非编码区－1～－192共了192bp，终止密码子TGA到poly A的非编码区有253bp，cDNA编码区全长1,119 bp，推测编码373氨基酸残基。国际基因序列数据库检索表明该基因序列（GenBank/EMBL/DDBJ：AB012013）与大麦茉莉酸诱导基因有部分同源性。因上推测该基因在调控开花过程中可能参与茉莉酸介导的信号传导途径，ver203F作用的发挥可能需要其它蛋白的参与，或ver203F本身就是一个受体蛋白。 　　为了研究ver203F基因的功能，将通过3’RACE克隆到的ver203F 3’端序到分别构建正义和反义植物表达载体，通过花粉管通道法、农杆菌介导的叶圆片法以及农杆菌介导的真空转化法分别转化小麦、烟草和拟南芥菜。获得转基因植株后，PCR、DNA Dob Blot、Southern Blot分析以及GUS活性检测证明外源基因已整合到转基因植株中，并得到表达。在获得的小麦、烟草和拟南芥菜转基因植株中，它们开花时间都相应地推迟，表明正常植物体内该基因在控制营养生长向生殖生长的转变中起作用。ver203F可以影响小麦和拟南茶菜花序的发育，首先无论正义还是反义都使得花序的发育受到抑制，在小麦中表现为顶部小穗退化，在拟南芥菜中表现为顶花。其次在转化正义基因的转基因拟南芥菜中，观察到产生的顶花为对称的两朵或以对称的两朵顶花基部为生长点长出丛生花，这种对称花的麦型小麦小穗中小花的表型相类似，说明ver203F基因可能在小麦小花的发育过程中也起着重要作用。 二． 春化相关基因ver17在开花过程中功能的分析 以春化处理冬小麦（京冬1号）幼苗cDNA为材料，通过减法杂交与差异筛选得到春化相关cDNA克隆verc17。为了研究该基因的功能，以包含CaMV 35S启动子的pBI221为载体，将ver17cDNA片段分别从两个方向插入pBI221的BamH I－Sma I, Xba I－BamH I间，构建正义和反义表达质粒：p17S和p17X，通过花粉管通道法转化小麦。对T0和T1两代转基因小麦的观察发现，在转化反义基因p17X的转基因小麦首先表现为抽穗推迟，其次穗的顶部和基部小穗严重退化，另外还发现转化反义基因的小麦败育现象严重（主要是花粉败育），因此推测ver17基困能可具有以下几方面的特点：a．春化诱导型表达;b．促进植物开花;c．促进穗顶端和基部花的发育，减少其退化;d．影响雄蕊的发育。

东北地区蒙古栎林的群落学特征及物种多样性

根据野外样地调查方法取得数据，我对样地资料进行了以下几方面的分析。根据吴征镒、王荷生区系分析方法，分析了东北地区蒙古栎群落中261种维管植物的区系成分，还分别分析了蒙古栎群落的乔木层、灌木层、草本层以及层间植物的区系成分。比较了东北地区的10个地点和河北省1个地点的蒙古栎群落物种所在属的分布区类型，计算了温带属与热带属（T／R）的比值，并给出了T／R值、纬度和海拔三者关系的回归方程。最后对这种分布格局产生的原因进行了解释。分析了东北地区10个地点蒙古栎群落中290个维管植物的生活型，发现东北地区蒙古栎群落物种的生活型以地面芽最多，同时本文对地下芽、地面芽与纬度、海拔的关系进行了回归分析。根据Raunkiaer系统，分析了蒙古栎群落中337种维管植物的叶型，发现蒙古栎群落植物以小型叶为主，并分析了叶的边缘状况，全缘叶占22.3％。还分别分析了群落乔木、灌木和草本的叶型及叶缘状况。分析了13个地点蒙古栎群落物种相似性与两地之间距离的关系。 比较了丰林自然保护区三个不同年龄林（64年、100年和270年）物种多样性特征。对黑龙江省七个地点的蒙古栎林的更新特点的分析，蒙古栎林可划分为不同特点的蒙古栎林型，即蒙古栎纯林、蒙古栎桦林林、蒙古栎落叶松林、蒙古栎槭树林、蒙古栎红松林和蒙古栎红松混交林等。 比较了13个地点蒙古栎群落的物种丰富度、Simpson指数、PIE指数、Shannon指数和Pielou指数。并对蒙古栎群落和核桃揪群落、蒙古栎群落和长白落叶松群落、蒙古栎群落和杂灌丛群落及其交错带进行了研究。采用点样地法对五个地点蒙古栎的邻体多样性进行了研究，用物种共同出现百分率测定了4个地点的蒙古栎与其伴生种的种间联结值（PC值），并引入了LS值方法（即相邻物种的平均个体数目），对4个地点蒙古栎群落在不同的环境因子下物种多样性的进行了比较。

两个固氮相关的植物基因对烟草和水稻的转化及其表达

豆科植物凝集素基因和血红蛋白基因在对根瘤菌的识别作用和类菌体在低氧分压下的共生固氮中起重要作用。本文的目的是试图将这两个基因转移到非豆料植物烟草和水稻，使其能识别根瘤菌，探讨非豆科植物的共生和联合固氮的可能性。 构建了含有豌豆凝集素（P－Lec）基因、Parasponia andersonii血红蛋白基因、gus基因及植物选择标记潮霉素磷酸转移酶基因（hpt）的两个植物表达载体pCBHL和pCBHUL;同时，还构建了含有P－Lec基因、gus基因及植物选择标记PPT乙酰转移酶基因（bar）的植物表达载体pBBUL。在pCBHL中，CaMV35S启动子调控P－Lec基因的表达，而在pCBHUL和pBBUL中，该基因由玉米Ubiquitin 1启动子调控。 用农杆菌法将pCBHL导入烟草，得到53株再生植株，PCR检测表明转化频率为88％。用基因枪法分别将pCBHUL和pBBUL导入水稻幼胚或幼胚诱导的愈伤组织。转pCBHUL的材料共得到40株再生植株，经分子检测有18株分转基因植株，转化频率为0.9%。转pBBUL的幼胚愈伤组织经PPT筛选，只得到能分化出小芽的抗性愈伤组织。 PCR检测、Southern杂交表明P-Lec基因和Paraspoina血红蛋白基因都已经整合到转基因烟草及水稻的基因组中，转基因水稻植株中两个外源目的基因的拷贝数较高。Western杂交分析转基因植物中P-Lec基因的表达情况，结果表明该基因在转基因的烟草和水稻叶片中得到正确地表达。同时，GUS组织化学染色表明转基因烟草的嫩茎和幼根，转基因水稻的嫩叶和幼根中都有gus基因的表达。转基因烟草中外源基因的表达频率高于转基因水稻。T1代转基因烟草幼根的蛋白原位免疫杂交显示P-Lec正确定位于正在生长的幼根根毛的顶端，与对照豌豆中的P-Lec基因表达部位相一致。关于Parasponia血红蛋白基因，以前本实验室对转基因烟草和水稻的研究表明有转录水平的表达，国外实验室证实转基因烟草中有转译表达。 上述结果有可能为进一步研究转基因非豆科植物与根瘤菌的相互作用奠定一定的基础。

噬菌体434单链阻遏蛋白的高亲和力DNA结合序列的设计和筛选

一． 设计和筛选单链阻遏蛋白的高亲和力DNA结合序列 　　单链阻遏蛋白RRTRES是噬菌体434阻遏蛋白的衍生物，它是噬菌体434阻 遏蛋白的N端DBD(1-69位氨基酸)组成的共价二聚体。这个单链分子有两个DBD，一个是野生型噬菌体434的DBD-R，另一个是突变了的DBD - RTRES，二者用重组接头以头接尾的方式连接起来。在RTRES的α3-螺旋中．1、1、2、5位氨基酸与DNA识别紧密相关，它们分别为T、R、E、S。为了筛选出突变的RTRES的DNA结合位点，设计了核心序列为CATACAAGAAAGNNNNNNTTTATG随机DNA库，通过RRTRES与随机DNA库的体外结合和循环筛选。将筛选到的群体克隆并测序。通过与单链阻遏蛋白RRTRES的亲和力测定，对每一个筛选到的序列进行特性分析。结果表明，当结合位点（上述划线部分）为TTAC或TTCC时为最适操纵区序列。它们与单链阻遏蛋白RRTRES的亲和力很高，Kd值在1-10pM的范围。其中随机部分为TTTACG的操纵区与RRTRES的亲和力最高，Kd值约为lpM;当结合位点为TTAC时，平均Kd值为3pM：当结合位点为 TTCC时，Kd值在5-lOpM之间。天然噬菌体434阻遏蛋白与其操纵区的亲和力的Kd值在nM数量级，与之相比，所筛选操纵区的亲和力明显提高。此外，亲和力大小还受到结合位点两侧的碱基的影响，特别是5'位碱基的影响。 　　表达纯化同源双突变的单链阻遏蛋白RTRESRTRE'根据RTRES的以上识别特一点，设计了一系列新的操纵区序列，它们的共有序列为GTAAGAAARNTTACN，或GGAAGAAARNTTCCN，并测定它们与RTRES RTRE之间的结合特异性。结果表明，它们可被RTRES RTRES特异识别，且亲和力也很高，Kd值在5-40pM之间。其中GTAAGAAAGTTTACG与RTRES RTRES之间结合的Kd值约为5pM。同样，表达了异源双突变的单链阻遏蛋白R*RTRES，然而它与 设计的相关操纵区的亲和力并不很高，Kd值约为lOOpM。利用本工作中的随机筛选和合理设计的原则，得到了新的具有特异性识别和高亲和力的蛋白一DNA相互作用。这个方法可望用于其他DBP的新的结合特异性的筛选。 二． 非同位素的方法筛选单链阻遏蛋白的最佳DNA结合序列初探 　　克隆和表达了带半胱氨酸尾的单链阻遏蛋白，利用已包被了马来酰胺的活性板可以与自由巯基结合的特性，将蛋白固定在活性板表面。体外筛选RTRES RTRES的最佳DNA结合序列，得到了一些与RTRES RTRES结合的序列，但Kd值nM数量级。此方法需进一步优化。

盐渍条件下野大豆群体的DNA变异

当前分子生物学的方法以惊人的速度渗透到生命科学研究的各个领域。植物对不断变化的环境逐步适应的过程中，积累了丰富的遗传多样性。与此同时，人类活动空间的不断扩大已经严重威胁到其他生命的生存和繁衍，越来越多的物种以越来越快的速度在我们还没有来得及认识它们时就已经永远地消失了。加快物种鉴定和保护的步伐就必须发展更多能充分揭示物种遗传多样性的实验技术，从具有丰富遗传多样性的野生资源中寻找到更多能够服务于人类可持续发展的基因资源。本文以杨树杂交后代过氧化物同工酶和RAPD分析为基础，论证了我们改进的RAPD方法用于遗传分析的可行性。在前期工作的基础上，进一步测定了野大豆自然群体的耐盐性变异，并且用微卫星和RAPD分析的方法研究分子标记与DXA变异、植株耐盐性之间的关系。对四个可能与抗盐性有关的RAPD片段进行克隆、测序，并进行序列比较。由此得出以下结论： 1、在本文的实验条件下，杨树同工酶和RAPD分析均表明，RAPD标记在亲本及其杂交后代中性状比例符合孟德尔遗传规律，尽管有时也会出现遗传负载等机制引起的基因分布扭曲现象。 2、初步研究了个体发育阶段和环境条件对植株耐盐性的影响。结果表明，植物耐盐性不仅仅与外界的盐度有关，而且受发育阶段和其它环境条件（如，温度）的影响。但也发现了某些个体在各种条件下都具有较高的耐盐性，而且，不易受到其它环境条件的影响。 3、微卫星标记的结果表明，10对引物中的8对引物共检测到时17个等位基因，平均每对引物2.125个等位基因。本文的实验条件下，双核苷酸和三核苷酸的引物对扩增产物都没有出现“ghosts"条带或“打滑”现象。 4、有4个RAPD标记可能与野大豆群体的耐盐性有关，分别是OPCO8460bp、OPCO8213bp、OPCO2690bp、以及OPCO5270bp。测序结果与GenBank中的序列作同源性比较，结果显示，OPCO2_(690bp)与小麦、松树等植物的吉普赛性的逆转录转座子的部分区域（24－－53）有很高的同源性（86－89％）。此外，OPCO2690bp与栽培大豆胞质谷氨酰胺合成酶（gs15）基因的启动子有高达95％的同源性。 5、本文实验条件下，RAPD扩增产物在限制性内切酶消化后，消化产物的多态性未见增大，也没有发现与耐盐性相关的多态位点。 6、野大豆自然群体DNA变异的研究中也可以应用SWAPP方法。

陆地棉抗虫基因工程研究

以陆地棉（Gossypium hirsutum L.）栽培品种新陆早4号、系550、冀资492、衡无89-30、邯93-2、冀资123等为材料，进行了组织培养及植株再生研究，建立了一套陆地棉体细胞植株再生速成体系。通过调整激素种类与比例以及改善培养条件，降低了畸形胚发生频率（从80%降为41%），并可将畸形苗转化为正常苗（转化率约为78%）;通过水培和嫁接，结合试管扦插、扩繁技术，解决了棉花生根及移栽难题，为农杆菌介导法转化棉花奠定了基础。 用绿色荧光蛋白基因（gfp）作为报告基因，构建了pBGb1m（含Bt和gfp二价基因）、pBGbf（含Bt-gfp融合基因）和pBGbfg（含Bt-gfp融合基因和gna基因）等三种植物表达载体。通过农杆菌介导法转化烟草，转基因再生植株经过荧光、虫试、PCR、Southern blot和Western blot等检测，表明三种植物表达载体能够在转基因植物中有效表达，同时，绿色荧光蛋白（GFP）的检测表现出了简便、经济、快速、可靠等优点，为大量棉花转基因苗的检测提供了一种有效方法。 采用花粉管通道法将携带细胞间隙定位信号肽的Bt基因的pBin438-S1m质粒导入棉花品种冀资492，经过田间卡那霉素筛选、虫试、PCR、PCR-Southern blot和Southern blot检测，证明Bt基因已整合至棉花基因组中，而且可能是以单拷贝形式插入。 同时，通过农杆菌介导法将三种植物表达载体（pBGb1m、pBGbf和pBGbfg）转化陆地棉栽培品种新陆早4号、冀资492、衡无89-30和邯93-2等材料，获得了大量转化再生棉株。经过PCR和PCR-Southern blot检测，转基因阳性植株为转为再生植株总数的89.45%。目前，虫试、Southern blot及Western blot正在进行之中。

根瘤菌感染烟草、水稻及豌豆凝集素基因在烟草中的表达

该文用根据瘤菌合成血红素基因hemA，根瘤菌固氨氮酶调节基因nifA，固氮酶结构基因nifKDH，nifH的启动子与lacZ基因融合的质粒，通过三亲交配法将其思入豌豆根据瘤菌.接种烟草发根、烟草植株和水稻。结果表明β-半乳糖苷酶有不同强度的组织化学染色反应，hemA染色最强，其它次之。显微镜观察表明在烟草发根据的维管束中柱鞘细胞、水稻根皮层细胞内和细胞间隙有根瘤菌存在.从根中分离纯化细菌，LacZ染色，再回接豌豆结瘤和根瘤的LacZ染色，证明是LacZ标记基因的豌豆根据瘤菌。由此说明根瘤菌可以侵染非豆科植物烟草和水稻。除了对烟草、水稻根进行LacZ染色外，还对其茎、叶进行了染色，结果也有正反应现象，说明根瘤菌有可能由根向上部分移动。另一方面，说明根瘤蓖的nifA、nifKDH、 nifH的启动子在植物组织也可能起起动作用表达lacZ基因。用上述不同启动子-LacZ标记的豌豆根瘤菌接种烟草，有促进生长发育和提前开花的现象。 对豌豆凝集素基因转烟草的发根，用蛋白免疫原位杂交检测，表明该基因 的转译产物定位在根毛顶端。对发根接种豌豆根瘤菌、菜豆根瘤菌，结果只有 接种豌豆根瘤菌的发根出现瘤状物的结构。对其切片显微镜观察，可见细胞内 和细胞间隙有细菌颗粒存在。由于豌豆凝集素被认为是豌豆植物对其相应的豌 豆根瘤菌的识别因子，本结果初步表明有可能是转基因发根产生的豌豆凝集素 因子识别豌豆根瘤菌的结果。如果进一步得到证明，这一结果才具有重要的科 学意义，表明今后用基因工程的方法有可能扩大根瘤菌的宿主范围，使非豆科 植物有结瘤和固氮的可能性。

松杉类植物花粉发育和传粉生物学的研究

本文用光学显微镜结合荧光技术对青扦花粉的发育过程进行了观察;用共聚焦显微镜观察了白扦生长花粉管细胞内的游离Ca2+分布;利用原子力显微镜对雪松和水杉花粉外壁的亚结构进行了研究：用透射电镜、扫描电镜及解剖镜等技术研究了侧柏、北美香柏、红豆杉、粗榧和白皮松的传粉机制，结果如下。 青扦花粉的发育过程与松科其它一些植物花粉的发育模式相似。从小孢子母细胞到成熟花粉约二十天左右。小孢子母细胞进入减数分裂前彼此分开，但在某些部位仍有连接。细胞质内有大量淀粉粒，在减数分裂过程中减少或消失，没有观察到明显的淀粉粒带。减数分裂中的胞质分裂为同时型，四分体为四面体型。小孢子刚从四分体释放出来时，气囊已开始形成，细胞中含大量淀粉粒。随着小孢子的发育，其体积增大，并出现液泡，细胞核移向一侧。小孢子第一次不对称分裂产生一个大的中央细胞和一个小的原叶细胞。中央细胞不久就进行第二次分裂产生精子器原始细胞和第二原叶细胞。原叶细胞形成后，其与中央细胞或精子器原始细胞之间的壁逐渐沉积胼胝质，以后随着原叶细胞的退化，胼胝质壁消失。精子器原始细胞分裂形成管细胞和生殖细胞，生殖细胞在散粉前分裂形成体细胞（精原细胞）和柄细胞（不育细胞）。成熟花粉为5细胞，但两个原叶细胞已退化消失。 白扦花粉在10%蔗糖+0.01%硼酸的液体培养基内培养12小时后开始萌发。在正常生长的花粉管中，其顶端有一个透明区，而透明区后则含有大量的贮藏物质颗粒。在停止生长的花粉管中透明区消失，而整个花粉管顶端也被储藏物质颗粒充满。正常生长的花粉管顶端有一个较高的Ca2+浓度。在停止生长的花粉管内不具有这样一个Ca2+梯度。 雪松和水杉二种花粉外壁中由孢粉素构成的亚结构单位形态相似，均呈颗粒状，但大小略有不同。雪松的长56-99 nm，宽42-74;水杉的长81-118 nm，宽43-98 nm。在雪松中这些亚单位紧密排列组成短棒状或球状的花粉外壁结构单位，再由几个到十几个这样的结构单位组成较大的岛屿状结构。在这些岛屿状结构之间有大小不一的空隙存在，整个花粉外壁由这样一些岛屿状结构交互连接形成。水杉花粉外壁的亚单位排列也较紧密，且有3-10个成群分布的趋势，但各群之间界限不明显。此外，雪松和水杉的花粉外壁亚单位均无螺旋状排列趋势，这一结果倾向于支持Southworth关于花粉外壁亚单位颗粒状并呈网状排列的观点。 白皮松胚珠倒生，其发育过程与松属的其它种相似，成熟胚珠珠孔端具两手臂状结构，有利于接收花粉。花粉具气囊。传粉期间，没有观察到传粉滴产生，但珠心顶端细胞解体形成花粉室。花粉室内可接受一至几个花粉，花粉在花粉室内的位置无明方向性。传粉时，胚珠处于大孢子线细胞时期。花粉在花粉室内萌发形成花粉管进入珠心组织，花粉管在珠心内生长一段时间后停止生长，并于次年春天重新启动生长。离体生长的花粉管顶端常有胼胝质产生，但顶端区域后的花粉管壁上却无胼胝质沉积。 侧柏、北美香柏、红豆杉和粗榧均为直生胚珠。传粉时胚珠产生传粉滴。在红豆杉胚珠发育早期，珠心表面细胞轮廓清晰;而在后期，其珠心表面则形成了一层膜状结构。这层膜状结构在传粉前随珠心细胞的解体而破裂，珠心细胞的降解产物参与了传粉滴形成。在传粉前和传粉期，珠心细胞内含大量的线粒体、内质网、高尔基体和小泡。传粉滴主要由珠心细胞分泌形成。这四种植物的花粉均无气囊，属可湿性花粉。红豆杉和粗榧的花粉水合时，内壁膨胀，外壁开裂。通常情况下，红豆杉花粉的外壁保留在传粉滴的表面，而花粉的其它部分沉入传粉滴内。侧柏和北美香柏的传粉滴授粉后，花粉进入传粉滴导致传粉滴的明显收缩。在侧柏中传粉滴授粉后100分钟内就完全收缩进入珠孔。传粉滴收缩的速率与所授花粉数量和花粉的种类有关。与侧柏亲缘关系较近植物花粉引起传粉滴的收缩速率和侧柏自身花粉引起的传粉滴收缩速率相似;反之，收缩速率变慢。侧柏传粉滴的收缩可能主要是由于花粉减弱胚珠分泌的结果。但授粉不引起红豆杉和粗榧传粉滴的明显收缩。在红豆杉和粗榧中，从授粉到传粉完全收缩需要20-24小时。这两种植物传粉滴的收缩可能主要是蒸发引起的非代谢性过程，与侧柏和美香柏属于不同的传粉滴收缩机制。

植物根与茎输水结构的研究和功能分析

本文采用树脂复型法对裸子植物红豆杉的管胞，木本单子叶植物竹和棕榈藤木质部中各种管状分子（主要是导管和管胞）的内壁结构进行了研究;采用原子力显微镜对玉米和小麦根内皮层细胞内切向壁的表面结构进行了探索性的研究;用光学显微镜并结合荧光技术对典型的旱生、中生及水生植物根内皮层的次生加厚壁进行了比较观察;同时辅以传统的组织切片法对以上研究结果做了进一步的论证。 采用树脂复型法，不仅可观察到常规解剖法所能展示的结构，而且还可清晰地观察到管状分子间具缘纹孔对等常规方法所难以显示的三维构造，并对其各项结构参数进行了定量测量。结果表明：裸子植物管胞和竹、藤管状分子具缘纹孔的内、外口比例分别约为3:1 和1:1，其它各项结构参数均存在较大差别。此外，在云南省藤和桂竹等导管内壁上还观察到瘤层结构，瘤体直径大小为200-800纳米之间。 旱生植物内皮层细胞内切向壁的闪生加厚最为明显，水生植物的加厚程度最微弱，而中生植物则介于两类植物之间。玉米内皮层细胞内切向壁的内表面起伏不平，并具有70-90纳米的“孔状”质外体结构，其频率约为2，000个/平方微米。

芦苇Phragmites communis Trin. 耐盐变异体的生物学鉴定和快速繁殖以及在海水生态养殖中的应用示范

本文以芦苇野生亲本和耐盐变异体为材料，比较了两者在形态、生理生化以及分子生物学特性上的差异，对耐盐变异体抗盐能力提高的机理作了初步的探讨。为了适应推广芦苇耐盐变异体的需要，进行了耐盐变异体快速繁殖的研究，建立了两种诱导丛生芽的技术系统。对耐盐变异体芦苇在滩涂上的利用作了有益的尝试。结果总结如下： 1．通过对芦苇野生亲本和耐盐变异体的基因组DNA用随机引物扩增分析，发现两者的基因组DNA在序列上存在着一定的差异，并克隆测序了几个对变异体而言是特异的标记序列。 2．生化分析发现，在盐胁迫下，两者在可溶性蛋白上存在着差异，芦苇耐盐变异体在胁迫下分别在20～30 kD和43～66．2 kD之间各有一条特异的蛋白带表达。而且变异体盐胁迫下在同工酶的表达上也与野生亲本有着显著的区别。 3．生理测定发现，芦苇耐盐变异体在200 mmol/L NaCl盐胁迫下光合作用要比野生亲本强，叶绿素测定的结果与此相吻合，在此浓度的胁迫下，变异体叶绿素含量受影响较小，而野生亲本的叶绿素含量明显降低。对两者胁迫前后的离子含量测定发现，虽然K+含量最多，但是植株内离子含量变化最大且增加最多的离子是Na+，而且变异体内Na~+增加的量比野生亲本高得多。另一个变化较大的是游离脯氨酸的含量，其变化情况类似于Na~+，在胁迫后脯氨酸含量增加明显，而且变异体内的增加量比野生亲本高。对变异体进一步的胁迫反应证实了Na+和脯氨酸含量变化与胁迫反应的密切联系。推测它们的这些变化与变异体抗盐能力提高密切相关。 4．将芦苇耐盐变异体的种子苗切去种壳和种子根，以此作为外植体，通过筛选大量的激素组合，最终建立了两种快繁技术系统（MP－A和MP－B）进行丛生芽诱导。两个系统都包含预处理和诱导两个主要步骤，其中预处理培养基激素组合是相同的（NAA 2～5 mg/L + 2,4-D 0.05 ～ 0.1 mg + BA 1mg/L）,而诱导处理的培养基激素组合不同，分别为：MP－A的诱导处理的激素组合是将预处理的激素组合中的2，4－D去除即可;MP－B诱导处理的激素组合为1mg/L NAA + 0.05 ～0.1mg/L 2,4-D + 2～5mg/L BA. 两个系统都获得显著的丛生芽诱导效果。 5．在滩涂水产养殖中引入芦苇种植、发现耐盐芦苇能有效地降低水体污染和病害，实验了两种模式的种养殖方式：围隔模式和混合模式，初步结果表明混合模式效果较好。这一初中初步验证了芦苇对海水养殖的价值，对开发滩涂具有很大的意义，具有创新性。

毛乌素沙地中间锦鸡儿根瘤菌遗传多样性对柠条生态系统功能的影响

生物多样性科学（BiodiversityScience）的国际规划提出生物多样性对生态系统功能的影响是整个研究计划五大核心的核心.生物多样性包括遗传、物种和生态系统三个水平,其中遗传多样性是其它两个水平多样性的基础和最终来源.该文在实验室多年研究毛乌素沙地柠条遗传多样性的基础上,分别从表型（生理生化）、蛋白质、同工酶以及遗传型（rDNA）水平探讨中间锦鸡儿根瘤菌的遗传多样性,并模拟沙地生境,建立人工共生体系,以期发现最有效的共生伙伴关系,这不仅有得提高毛乌素地区农牧业产量,更重要的是在当今沙尘暴肆虐的情况下,发挥柠条防风固沙的能力具有现实意义. 1.毛乌素沙地中间锦鸡儿根瘤菌遗传多样性(1)全细胞可溶性蛋白质谱将供试中间锦鸡儿根瘤菌菌株分为两大类群，其中硬梁覆沙地菌株GH72不同于来自沙丘顶部和底部的菌株，而且中间锦鸡儿根瘤菌独立于参比菌株。酯酶同工酶谱分析表明，中间锦鸡儿根瘤菌与参比菌株仅存在一个等位酶位点差异，其余等位点与参菌株共享，因此，酯酶同工酶反映出中间锦鸡儿根瘤菌的异质性。(2)16SrDNA部分序列与16S-23S rDNA IGS结果表明，所有供试菌株扩增产物均较前人报道的分子量偏高。经16S rDNA PCR-RFLP分析，中间锦鸡儿根瘤菌共形成12种基因型，表现出丰富的遗传多样性，其中属于基因型2的菌株占42.4%。代表菌株GH33 16S rDNA全序列结果显示，与已知的快生型根瘤菌同源性在95%以上。(3）中间锦鸡儿根瘤菌生理生化反应特性B．T．B实验证明所有中间锦鸡儿根瘤菌均产酸，符合快生型根瘤菌的特征．唯一碳源测试显示，95%中间锦鸡儿根瘤菌不利用淀粉，33%菌株不利用乳糖，对其他测试碳源不具有选择性。检洲在不同盐离子浓度、不同酸性梯度以及不同温度条件下菌株生长状况，发现毛乌素沙地中间锦鸡儿根瘤菌具极强的耐盐性．53.8%的菌株可以在9%NaCl的YMA培养基生长．75%的菌株在pH4．O和pHl0,0 环境中仍能生长，66.7%菌株在60℃处理1 0min后仍具有生活力。体现出对于干旱沙地的适应。 2．不同实验共生系统中植物和根瘤菌对生态系统功能的影响14株根瘤菌分与三个柠条种（小叶锦鸡儿，中间锦鸡儿和柠条锦鸡儿）回接，用土壤上覆沙模拟毛乌索沙地景观生态条件，以多石砾贫瘠土壤为对照，比较不同基因型柠条与根瘤菌人工共生体的长和结瘤与生境的关系，初步证明根瘤菌很可能是该生态系统的关键种。寄主植物与共生根瘤菌的遗传多样性对生态系统功能的影响与生态环境有关。实验还表明，选择适当的共生组合对于防治沙漠化有很大潜力。3．银染变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测RAPD遗传模式以85株小钻杨F2代为材料，用本实验室改良的银染变性聚丙烯酰胺凝胶电泳法检测RAPD遗传模式。结果表明，仅用9个引物共扩增到399个位点，其中98个位点表现为多态性，卡方测验显示，79个多态位点符合经典的孟德尔遗传(3：1)，占多态位点80.6%。这种改良的检测RAPD标记的方法必将推动RAPD标汜构建连锁图谱的进程。