转基因植物生产生物可降解塑料PHB的研究-phbA功能鉴定、多价表达载体的构建及转基因植物的获得


Autoria(s): 叶梁
Contribuinte(s)

宋艳茹

马庆虎

王台

Data(s)

1999

Resumo

聚-β-羟基链烷酸(PHA)是许多微生物作为碳源、能源的一类贮藏性聚酯,具有广泛的应用价值。该聚酯可被微生物完全降解且有与塑料相似的性质,因而研究并提高PHA在植物中的合成为解决环境污染提供了新的解决途径。 聚-β-羟基于酸酯(PHB)是研究的最早、研究的最清楚的一种PHA。用聚合酶链式反应扩增并克隆了真养产碱杆菌(Alcaligenes eutrophus)中合成PHB的一个关键酶——3-酮硫裂解酶基因phbA。DNA序列分析表明所克隆的基因与国外报道序列同源性很高,只有一个碱基对的区别。为了检测该基因的功能及导肽的定位效率,构建了带有导肽基因的组成型表达载体,由根癌农杆菌介导转化烟草(Nicotiana tabacum cv. Wisconsin 38)得到转基因植株。蛋白质电泳结果表明导肽可以将外源蛋白定位于质体,phbA基因能翻译成相应大小的蛋白。酶活性分析证实了转基因烟草中phbA编码的3-酮硫裂解酶可以催化乙酰-CoA合成乙酰乙酰-CoA。 将携有导肽序列的phbC(编码PHB合酶)和phbB(编码乙酰乙酰-CoA还原酶)连入pBIB-HYG得到组成型表达载体pZCB,用冻融法转入根癌农杆菌,介导转化烟草。烟草为已获得的具有卡那霉素抗性整合并表达phbA的转基因烟草。通过二次转化将携有潮霉素抗性的phbB基因和phbC基因导入已整合phbA的烟草,各基因均由质体导肽控制,最后得到整合PHB合成的三个酶基因的转基因烟草。转基因烟草经PCR、PCR-Southern检测,初步确定整合phbB和phbC烟草植株。以气相色谱初步分析,转基因烟草中PHB的含量可达鲜重的0.233%。 结果表明phbB和phbC基因可以在真核表达系统中编码相应的蛋白。通过色素分析、荧光动力学等手段分析了PHB在叶绿体中的累积对其功能的影响。 为了提高底物乙酰-CoA的供应能力及减少惰性聚酯对植物体的伤害,分离了种子特异性启动子和质体导肽序列,利用忆经克隆的合成PHB的三个关键酶基因,通过一系列DNA重组,分别构建了含有种子特异性启动子的嵌合phbC、phbB的二价表达载体pSCB及嵌合phbC、phbA、phbB的三价表达载体pSCAB,并由导肽将基因表达产物定位于质体。经根癌农杆菌介导转化油菜(Brassica napus L.) H165,获得转基因油菜植株,并进行了PCR、Southern blot及RT-PCR-DNA杂交等分检测。结果表明,三基因已经分别整合到相应的转基因油菜中,并已在转录水平表达。同时转化了油菜不育系、恢复系和保持系,获得批量转化株,并移入温室栽培。

Identificador

http://ir.ibcas.ac.cn/handle/151111/463

http://www.irgrid.ac.cn/handle/1471x/40854

Idioma(s)

ch

Fonte

叶梁.转基因植物生产生物可降解塑料PHB的研究-phbA功能鉴定、多价表达载体的构建及转基因植物的获得.[中科院植物所博士学位论文].1999.资料索取号:BS/:29/1999

Palavras-Chave #植物生理学 #聚-β-羟基丁酸酯 #3-酮硫裂解酶 #乙酰乙酰CoA还原酶 #PHB合酶 #油菜 #烟草 #poly-3-hydroxybutyrate #3-ketothiolase #acetoacetyl-CoA reductase #PHB synthase #Brassica napus #Nicotiana tabacum 
Tipo

学位论文