986 resultados para MECANISMO REED
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Dissertao de Mestrado apresentada ao ISPA - Instituto Universitrio
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RESUMO: O cancro do pulmo (LC), uma das principais causas de mortalidade relacionada com cancro em Portugal, pode levar formao de metstases hematognicas. A adeso das clulas tumorais ao endotlio considerada um dos passos fundamentais envolvidos na metstase. Em clulas sanguneas, esta adeso mediada por ligandos de E-selectina (E-SL), glicoprotenas ou glicolpidos decorados principalmente com sialyl-Lewis x (sLex) e sialyl-Lewis a (sLea). Tem sido descrito a expresso destes antignios em LC, contudo o seu papel funcional em permitir a adeso das clulas de LC ao endotlio ainda pouco compreendido. Foram analisadas amostras emparelhadas normais e tumorais de pacientes com cancro de pulmo de no-pequenas clulas (NSCLC) e trs linhas celulares de LC. Immunoblotting assays com anti-sLex/sLea e molcula quimrica de E-selectina demonstraram que tecidos tumorais de LC sobreexpressam significativamente E-SL e resultados de citometria de fluxo demonstraram uma expresso elevada de E-SL nas linhas celulares. Para compreender o mecanismo da sobreexpresso de E-SL em tecidos tumorais e linhas celulares de LC, foi analisada a expresso de genes envolvidos na biossntese de E-SL, nomeadamente FUT3, FUT4, FUT6, FUT7, ST3GAL3, ST3GAL4, ST3GAL6, 4GALT1, GCNT1 e GALNT3. Observou-se a sobreexpresso das fucosiltransferases FUT3, FUT6 e FUT7 em tecidos tumorais de LC e FUT3 em linhas celulares de LC, sendo que neste ltimo, esta expresso correlacionada com um aumento da adeso das clulas de LC s selectinas endoteliais. Foi observado que uma baixa expresso de FUT4 em tecidos tumorais est associada com estadios menos avanados de NSCLC. Foram analisadas ainda protenas decoradas com sLex/sLea, tendo-se identificado como E-SL o antignio carcinoembrionrio em NSCLC. Em resumo, esta tese contribuiu para uma melhor compreenso das alteraes glicosdicas e molculas que podem influenciar a progresso tumoral do LC, podendo permitir identificar futuramente novos biomarcadores de diagnstico/prognstico e potenciais alvos teraputicos para o NSCLC.--------------------------ABSTRACT: Lung cancer (LC), one of the major causes of mortality related to cancer in Portugal, may lead to hematogenous metastasis. Adhesion of cancer cells to endothelium is considered one of the crucial steps involved in metastasis. In blood cells, this adhesion is initiated by endothelial selectin ligands (E-SL) that are glycoproteins or glycolipids decorated mostly with sialyl-Lewis x (sLex) and sialyl-Lewis a (sLea). While LC has been described as expressing these sialyl Lewis antigens, its functional role in allowing LC adhesion to endothelium is still poorly understood. We analyzed paired tumor and normal tissues samples from non-small cell lung cancer (NSCLC) patients and three LC cell lines. Immunoblotting assays with anti-sLex/sLea and E-selectin chimera demonstrated that LC tumor tissues significantly overexpress E-SL and flow cytometry results indicated that E-SL are also abundantly expressed in LC cell lines. To understand the mechanism behind the overexpression of E-SL in LC tissues and cell lines, we analyzed the expression of genes involved in its biosynthesis, namely FUT3, FUT4, FUT6, FUT7, ST3GAL3, ST3GAL4, ST3GAL6, 4GALT1, GCNT1 and GALNT3. It was observed the overexpression of fucosyltransferases FUT3, FUT6 and FUT7 in LC tumor tissues and FUT3 in LC cell lines, being this last one correlated with an increased reactivity of the LC cells to endothelial selectins. It was described that low expression of FUT4 in tumor tissues is correlated with early stages of NSCLC. We also analyzed scaffolds proteins of sLex/sLea and it was identified the carcinoembryonic antigen as an E-SL in NSCLC. In summary, this thesis contributed to a better understanding of the glycosidic changes and molecules that can influence tumor progression of LC, allowing identifying in the future new diagnosis/prognosis biomarkers and potential therapeutic targets for NSCLC.
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The suppression of internal border controls has led the European Union to establish a mechanism for determining the Member State responsible for examining each asylum application, with the main intention of deterring asylum seekers from lodging multiple applications and guaranteeing that it will be assessed by one of the States the Dublin System. Even though it holds on a variety of criteria, the most commonly used is the country of first entrance in the EU. The growing migrating flows coming mainly from Northern Africa have thus resulted in an incommensurable burden over the border countries. Gradually, countries like Greece, Bulgaria and Italy have lost capability of providing adequate relief to all asylum seekers and the records of fundamental rights violations related to the provision of housing and basic needs or inhuman detention conditions started piling up. To prevent asylum seekers who had already displaced themselves to other Member States from being transferred back to countries where their human dignity is questionable, the European Court of Human Rights and the Court of Justice have developed a solid jurisprudence determining that when there is a risk of serious breach of fundamental rights all transfers to that country must halt, especially when it is identified with systemic deficiencies in the asylum system and procedures. This reflexion will go through the jurisprudence that influenced very recent legislative amendments, in order to identify which elements form part of the obligation not to transfer under the Dublin System. At last, we will critically analyze the new rising obligation, that has clearly proven insufficient in light of the international fundamental rights framework that the Member States and the EU are bound to respect, proposing substantial amendments with a view to reach a future marked by high solidarity and global responsibility from the European Union.
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RESUMO: As clulas eucariticas evoluram um sistema de sinalizao complexo que lhes permite responder aos sinais extracelulares e intracelulares. Desta forma, as vias de sinalizao so essenciais para a sobrevivncia da clula e do organismo, uma vez que regulam processos fundamentais, tais como o desenvolvimento, o crescimento, a imunidade, e a homeostase dos tecidos. A via de transduo de sinal Hedgehog (Hh) envolve o receptor Patched1 (Ptch1), que tem um efeito inibidor sobre a protena Smoothened (Smo) na ausncia dos seus ligandos, as protenas Sonic hedgehog (Shh). Estas protenas so reguladores fundamentais do desenvolvimento embrionrio, como ilustrado pelas malformaes drsticas observadas em embries humanos e de murganho com perturbaes da transduo de sinal da via Hh e que incluem polidactilia, defeitos craniofaciais e malformaes sseas. Igualmente importantes so as consequncias da ativao inapropriada da via de sinalizao Hh na formao de tumores. Curiosamente, os componentes desta via localizam-se nos clios primrios. Alm disso, demonstrou-se que esta localizao crucial para a sinalizao atravs da via Hh. Na presena dos ligandos, Ptch1 internalizado e destinado a degradao ou sequestrado num compartimento da clula de onde no pode desempenhar o seu papel inibitrio. A protena Arl13b uma pequena GTPase pertencente famlia Arf/Arl da superfamlia Ras de pequenas GTPases e foi implicada no sndrome de Joubert, uma ciliopatia caracterizada por ataxia congnita cerebelar, hipotonia, atrso mental e cardiopatia congnita. Murganhos deficientes para Arl13b, chamado hennin (hnn) morrem morrem prematuramente ao dia 13,5 de gestao (E13,5) e exibem anomalias morfolgicas nos clios que levam interrupo da sinalizao Hh. Alm disso, a Arl13b est diretamente envolvida na regulao da via Hh, controlando a localizao de vrios componentes desta via nos clios primrios. Neste trabalho, mostramos que a Arl13b se localiza em circular dorsal ruffles (CDRs), que so estruturas de actina envolvidas em macropinocitose e internalizao de recetores, e que regula a sua formao. Alm disso, aprofundmos o conhecimento do processo de ativao da via de sinalizao Hh, mostrando que as CDRs sequestram seletivamente e internalizam o recetor Ptch1. As CDRs formam-se minutos aps ativao da via por ligandos Shh ou pelo agonista de Smo SAG e continuam a ser formadas a partir da, sugerindo uma induo contnua da reorganizao do citoesqueleto de actina quando a via est ativada. Observmos ainda que a inibio da formao de CDRs atravs do silenciamento de WAVE1, uma protena necessria para a formao destas estruturas, resulta na diminuio da ativao da via de sinalizao Hh. Alm disso, o bloqueio da macropinocitose, que se segue ao fecho das CDRs, atravs do silenciamento de uma protena necessria para a ciso de macropinossomas, nomeadamente a protena BARS, tem um efeito semelhante. Estes resultados sugerem que as CDRs e a macropinocitose so necessrias para a ativao da via de sinalizao Hh e indicam que esta via de internalizao controla os nveis de sinal Hh. Durante o desenvolvimento, as clulas proliferativas dependem do clio primrio para a transduo de vrias vias de sinalizao. A via Hh induz a diferenciao do msculo cardaco. Por conseguinte, os murganhos deficientes na via de sinalizao Hh exibem uma variedade de defeitos de lateralidade, incluindo alterao do looping do corao, como pode ser visto em murganhos deficientes para Arl13b. Por conseguinte, investigmos o papel da Arl13b no desenvolvimento do corao. Mostramos que a Arl13b altamente expressa no corao de embries de murganho e de murganhos adultos ao nvel do mRNA e da protena. Alm disso, o perfil de distribuio da Arl13b no corao segue o dos clios primrios, que so essenciais para o desenvolvimento cardaco. Coraes de murganhos hnn no estadio E12,5 mostram um canal trio-ventricular aberto, espessamento da camada compacta ventricular e aumento do ndice mittico no ventrculo esquerdo. Alm disso, um atraso de 1 a 2 dias no desenvolvimento observado em coraes de murganhos hnn, quando comparados com controlos selvagens no estadio E13,5. Assim, estes resultados sugerem que a Arl13b necessria para o desenvolvimento embrionrio do corao e que defeitos cardacos podem contribuir para a letalidade embrionria de murganhos hnn. Em suma, foi estabelecido um novo mecanismo para a regulao dos nveis de superfcie do recetor Ptch1, que envolve a remodelao do citoesqueleto de actina e a formao de CDRs aps a ativao da via de sinalizao Hh. Este mecanismo permite um feedback negativo que evita a represso excessiva da via atravs da remoo de Ptch1 da superfcie da clula. Alm disso, determinou-se que uma mutao de perda de funo na Arl13b causa defeitos cardacos durante o desenvolvimento, possivelmente relacionados com a associao dos defeitos em clios primrios e na sinalizao Hh, existentes em murganhos deficientes para Arl13b. A via de sinalizao Hh tem tido um papel central entre as vias de sinalizao, uma vez que a sua regulao crucial para o funcionamento apropriada da clula. Assim, a descoberta de um novo mecanismo de trfego atravs de macropinocitose e CDRs que controla a ativao e represso da via de sinalizao Hh traz novas perspetivas de como esta via pode ser regulada e pode ainda conduzir identificao de novos alvos e estratgias teraputicas. --------------------ABSTRACT: Eukaryotic cells have evolved a complex signaling system that allows them to respond to extracellular and intracellular cues. Signaling pathways are essential for cell and organism survival, since they regulate fundamental processes such as development, growth, immunity, and tissue homeostasis. The Hedgehog (Hh) pathway of signal transduction involves the receptor Patched1 (Ptch1), which has an inhibitory effect on Smoothened (Smo) in the absence of its ligands, the Sonic hedgehog (Shh) proteins. These proteins are fundamental regulators of embryonic development, as illustrated by the dramatic malformations seen in human and mouse embryos with perturbed Hh signal transduction that include polydactyly, craniofacial defects and skeletal malformations. Equally important are the consequences of inappropriate activation of the Hh signaling response in tumor formation. Interestingly, the components of this pathway localize to primary cilia. Moreover, it has been shown that this localization is crucial for Hh signaling. However, in the presence of the ligands, Ptch1 is internalized and destined for degradation or sequestered in a cell compartment where it no longer can play its inhibitory role. ADP-ribosylation factor-like (Arl) 13b, a small GTPase belonging to Arf/Arl family of the Ras superfamily of small GTPases has been implicated in Joubert syndrome, a ciliopathy characterized by congenital cerebellar ataxia, hypotonia, intellectual disability and congenital heart disease. Arl13b-deficient mice, called hennin (hnn) die at embryonic day 13.5 (E13.5) and display morphological abnormalities in primary cilia that lead to the disruption of Hh signaling. Furthermore, Arl13b is directly involved in the regulation of Hh signaling by controlling the localization of several components of this pathway to primary cilia. Here, we show that Arl13b localizes to and regulates the formation of circular dorsal rufles (CDRs), which are actin-basedstructures known to be involved in macropinocytosis and receptor internalization. Additionally, we extended the knowledge of the Hh signaling activation process by showing that CDRs selectively sequester and internalize Ptch1 receptors. CDRs are formed minutes after Hh activation by Shh ligands or the Smo agonist SAG and keep being formed thereafter, suggesting a continuous induction of actin reorganization when the pathway is switched on. Importantly, we observed that disruption of CDRs by silencing WAVE1, a protein required for CDR formation, results in down-regulation of Hh signaling activation. Moreover, the blockade of macropinocytosis, which follows CDR closure, through silencing of a protein necessary for the fission of macropinosomes, namely BARS has a similar effect. These results suggest that CDRs and macropinocytosis are necessary for activation of Hh signaling and indicate that this pathway of internalization controls Hh signal levels. During development, proliferating cells rely on the primary cilium for the transduction of several signaling pathways. Hh induces the differentiation of cardiac muscle. Accordingly, Hh-deficient mice display a variety of laterality defects, including alteration of heart looping, as seen in Arl13b-deficient mice. Therefore, we investigated the role of Arl13b in heart development. We show that Arl13b is highly expressed in the heart of both embryonic and adult mice at mRNA and protein levels. Also, Arl13b localization profile mimics that of primary cilia, which have been shown to be essential to early heart development. E12.5 hnn hearts show an open atrioventricular channel, increased thickening of the ventricular compact layer and increased mitotic index in the left ventricle. Moreover, a delay of 1 to 2 days in development is observed in hnn hearts, when compared to wild-type controls at E13.5. Hence, these results suggest that Arl13b is necessary for embryonic heart development and that cardiac defects might contribute to the embryonic lethality of hnn mice. Altogether, we established a novel mechanism for the regulation of Ptch1 surface levels, involving cytoskeleton remodeling and CDR formation upon Hh signaling activation. This mechanism allows a negative feedback loop that prevents excessive repression of the pathway by removing Ptch1 from the cell surface. Additionally, we determined that the Arl13b loss-offunction mutation causes cardiac defects during development, possibly related to the associated ciliary and Hh signaling defects found in Arl13b-deficient mice. Hh signaling has taken a center stage among the signaling pathways since its regulation is crucial for the appropriate output and function of the cell. Hence, the finding of a novel trafficking mechanism through CDRs and macropinocytosis that controls Hh signaling activation and repression brings new insights to how this pathway can be regulated and can lead to the discovery of novel therapeutic targets and strategies.
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O risco de ocorrncia de desvios significativos dos custos oramentados e de incumprimento dos prazos de execuo constituem duas das principais preocupaes da gesto de projetos. A derrapa-gem de prazos de projetos um dos motivos apontados para a falta de competitividade da indstria portuguesa (Tenera, 2012). Estes atrasos, para alm de falta de competitividade, podem resultar ainda, por exemplo, em sanes financeiras e perda de confiana dos clientes. Goldratt, em 1997, alertou que as limitaes das tcnicas clssicas de planeamento e controlo pode-riam estar na origem do no cumprimento dos prazos dos projetos, propondo a aplicao da Teoria das Restries gesto de projetos, a Gesto de Projetos pela Cadeia Critica (Critical Chain Project Management - CCPM). A CCPM tem os seus princpios vocacionados para a gesto do tempo e introduz mudanas signifi-cativas na forma como os projetos so geridos, preconizando uma reduo nas duraes programadas das atividades, para contrariar tendncias comportamentais humanas de atrasar a execuo das tare-fas, introduzindo ainda estrategicamente reservas temporais agregadas, que procuram proteger o pro-jeto de derrapagens temporais. Um dos principais fatores de diferenciao da CCPM precisamente a forma de monitorizar os projetos, sendo a Gesto das Reservas (Buffer Management - BM) o prin-cipal mecanismo de gesto do tempo de execuo dos mesmos. No presente trabalho foi realizada uma reviso bibliogrfica dos conceitos associados gesto de riscos em geral e em particular gesto de tempo em projetos, atravs da CCPM. Estudou-se ainda, a metodologia geral de implementao das cartas de controlo, com o objetivo de se desenvolver um modelo adaptado ao controlo de reservas temporais em projetos. Assim, e de acordo com o estudo realizado, foi proposto, desenvolvido e implementado um modelo, que complementa a gesto clssica de reservas temporais da CCPM com a utilizao de cartas de controlo. O modelo proposto foi testado numa empreitada de reabilitao de edifcios, na Marinha Portuguesa, com o objetivo de se avaliar a sua aplicabilidade, as suas vantagens e limitaes. No presente trabalho procurou-se propor e implementar um modelo robusto de gesto de reservas na CCPM, com aplicabilidade efetiva gesto de riscos de derrapagem de prazos de projetos, no s na indstria da construo civil como em projetos de outras reas. Com a aplicao do modelo proposto num caso de estudo, foi possvel concluir o projeto dentro do prazo contratualizado, tendo-se verificado que a implementao de cartas de controlo na BM permi-tiu antecipar a deteo de consumos excessivos das reservas temporais do projeto.
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O presente trabalho, desenvolvido nas instalaes da FISIPE, teve como objectivo a caracterizao de fibra oxidada (FOX),actualmente em desenvolvimento, com vista ao controlo de processo e de qualidade, e centrou-se em quatro parmetros: i. Densidade; ii. ndice de Aromaticidade; iii. ndice de Oxignio Limitante; iv. Grupos funcionais. No estudo da densidade realizou-se: a. Consolidao do mtodo actualmente usado na empresa, observando-se uma reduo da incerteza para metade (0,005 gcm-3). b. Anlise de diferentes amostras de FOX que apresentaram valores entre 1,348-1,387 gcm-3, que atendendo incerteza do mtodo, se encontram dentro dos valores de referncia (1,35-1,39 gcm-3). c. Previso de densidades ao longo da etapa de estabilizao oxidativa. Confirmou-se ser apenas possvel pela expresso apresentada numa das fontes consultada. Para o ndice de Aromaticidade (AI) efectuou-se: a. Estudo de quatro mtodos de integrao de curvas de DSC para determinao do calor de combusto que permite determinar o AI. Verificou-se que o mais indicado seria o uso da temperatura de on-set como limite inferior linha de base de integrao. b. Anlise de diferentes amostras de FOX, observando-se valores de AI entre os 66% e 81%. Na determinao do ndice de Oxignio Limitante, parmetro exclusivo de qualidade, analisaram-se amostras de cabo pela adaptao da norma ASTM D 2863-06a. Obtiveram-se valores acima dos 40%O2 para a fibra oxidada. Para a verificao dos grupos funcionais realizou-se: a. Anlise de FTIR, confirmando-se o desaparecimento de grupos nitrilo em funo do tempo de oxidao, e a formao de bandas conjugadas e sobrepostas, indicando a presena de estruturas ciclizadas e aromatizadas. b. Proposta de um mecanismo reaccional para a reaco de oxidao de uma determinada fibra precursora. Com o intuito de minimizar o tempo de caracterizao das FOX, procurou-se ainda encontrar uma correlao entre a densidade e o ndice de Aromaticidade, tanto ao longo da etapa de oxidao, como da fibra oxidada final. Conclui-se que no possvel estabelecer uma relao matemtica para as amostras analisadas.
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Do presente trabalho resultou a submisso de um artigo, com o ttulo UV Curing Adhesives for Conservation of Glass- Chemical and Mechanical Stability, para comunicao oral em conferncia internacional intitulada Recent Advances in Glass and Ceramics Conservation, a ocorrer em Wroclaw, Polnia, de 25 a 29 de Maio de 2016, no mbito do ICOM-CC Glass and Ceramics Working Group Interim Meeting.
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Tax evasion and fraud threaten the economic and social objectives of modern tax systems, precluding the state funding for the satisfaction of collective needs and the fair distribution of wealth, being a violation of basic principles and values of our society. In tax law, to give tax administration the necessary powers to supervise and control the information provided by taxpayers and combat tax evasion and fraud, over the last years the grounds for a derogation of bank secrecy without judicial authorization have been extended, which raises some constitutional compatibility issues. Similarly, this tendency of making this legal regime more flexible and increasing automatic exchange of information has been followed by the European Union and the international community. Banking secrecy, as a professional secrecy, is an instrument to protect the right to privacy but also appears as an anti-abuse and repressive mechanism of evasive and fraudulent behaviors. Because of the conflict of interests will always be necessary to make a practical agreement between them, ensuring the legality and the due guarantees of the taxpayers but also an effective way to combat tax evasion and fraud. Bank secrecy cannot be one method to, behind the right to privacy, taxpayers practice illegal activities. But the practice of these irregular conducts also does not justify a total annihilation of the right to banking secrecy, uncovering all documents and bank informations. Although considering the legislative changes, the administrative derogation of bank secrecy will always be what the tax administration does of it.
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RESUMO - A gesto empresarial dos hospitais uma velha aspirao do sistema e dos profissionais da sade em Portugal. J o Estatuto Hospitalar de 1968 previa a organizao e a gesto dos hospitais em termos de gesto empresarial. A Lei de Bases da Sade, de 1990, relembrava que a administrao das unidades de sade deveria obedecer a regras de gesto empresarial. O Hospital Fernando da Fonseca, criado desde 1991, foi objecto de concesso de gesto por contrato, precedendo concurso pblico, a uma entidade privada, em 1995. Em 1997, o relatrio do Grupo de Trabalho sobre o Estatuto Jurdico do Hospital recomendava a adopo da figura de instituto pblico com natureza empresarial, adequada autonomia de gesto e forte responsabilidade, podendo regular-se, em alguns domnios, por normas de direito privado. Em 1998 foi criado o Hospital de So Sebastio, em Santa Maria da Feira, com formas inovadoras de gesto, utilizando meios de gesto maleveis. Em 1999 foi criada a Unidade Local de Sade de Matosinhos, englobando no apenas o Hospital de Pedro Hispano, naquela cidade, mas tambm os quatro centros de sade da sua rea de atraco. Em 2001 foi criado o Hospital do Barlavento Algarvio, em moldes semelhantes aos do Hospital de So Sebastio. Os restantes hospitais pblicos mantiveram a estrutura e regras de funcionamento convencionais. Observa-se que o modelo de gesto convencional do hospital pblico tem hoje consequncias desfavorveis para os cidados, para os profissionais que nele trabalham e tambm para o sistema de sade no seu conjunto. Em 2002, uma nova lei alterou disposies da Lei de Bases da Sade de 1990 e aprovou um novo regime jurdico de gesto hospitalar. De acordo com ele, a rede de prestao de cuidados de sade passou a integrar vrios modelos de hospitais: hospitais SPA, hospitais EPE, hospitais SA, clnicas privadas com ou sem nome de hospital, instituies e servios geridos por entidades pblicas ou privadas, mediante contrato de gesto e hospitais PPP. Analisam-se os ganhos introduzidos pelo modelo inovador de hospital SA, no que respeita ao estatuto, dotao de capital, poderes especiais, regras de controlo financeiro, regimes laborais, rgos sociais, instrumentos de gesto e direco tcnica. Finalmente, antecipa-se um quadro analtico de oportunidades e riscos sobre este modelo. As crticas tm-se concentrado sobre a estratgia de mudana e sobre o mecanismo de escolha dos dirigentes e das respectivas chefias intermdias. Em relao estratgia, conclui-se ser a questo mais emprica do que conceptual. Em relao forma de identificao dos dirigentes, recomenda-se o acompanhamento crtico da experincia, salientando-se, a par do que ela pode trazer de positivo, os riscos de partidarizao e instabilidade.
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4th Conference COST ACTION FP1303 Designing with Bio-based Materials Challenges and opportiunities. INIA CSIC, Madrid, 24-25 February 2016. Book of abstracts, T.Troya, J.Galvn, D.Jones (Eds.), INIA and IETcc CSIS, pg. 79-80 (ISBN: 978-91-88349-16-3)
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Foi descrita a constituio histolgica do esfago, estmago e cecos pilricos de Semaprochilodus insignis, um Characiforma de expressiva ocorrncia na Amaznia central, onde usualmente conhecido como "jaraqui escama-grossa". As camadas epitelial e muscular mostraram-se bastante variveis de rgo para rgo, e mesmo em diferentes segmentos de um nico rgo. O epitlio do esfago inicialmente estratificado pavimentoso e finalmente simples mucoso. O estmago compe-se de uma poro descendente, revestida por glndulas gstricas, e uma ascendente, no-glandular. A camada muscular nestes dois rgos sofre substituio gradual da estriada para a lisa, bem como a orientao dos feixes. Os cecos pilricos, pequenos e numerosos, no apresentam nem componentes glandulares, nem absortivos. Por fim, sugerido um mecanismo geral para a digesto, considerando o hbito alimentar dessa espcie.
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RESUMO: Os glicoconjugados que decoram a superfcie celular e os lpidos e protenas secretados ocupam o ponto de encontro onde normalmente ocorrem interaces crticas homlogas (hospedeiro-hospedeiro) e heterlogas (hospedeiro-patognio). Apesar de ser largamente aceite que os glicanos so parte integrante do processo de imunidade, continua a no ser claro qual o papel que os glicanos, em toda a sua diversidade, tomam no quadro geral da imunidade. Os glicanos, que so frequentemente terminados por resduos de cido silico, podem ser alterados por factores externos, tais como patognios, ou por acontecimentos fisiolgicos celulares especficos. Normalmente em posio terminal, as glico-estruturas que contm cido silico assumem um papel fundamental numa quantidade substancial de receptores imunes envolvidos na adesividade e trfico celular, tal como as Selectinas e as Siglecs, das quais se sabe apresentarem uma relevante funo imune. altura do incio desta tese, era sabido que os cidos silicos expressos superfcie das clulas poderiam modular mecanismos importantes nas respostas imunes adaptativas. Considerando a posio de charneira que as clulas dendrticas (DCs) ocupam na transio da resposta imune inata para a adaptativa, antecipmos que os cidos silicos poderiam tambm modular mecanismos relevantes nas DCs humanas. As DCs tm uma funo muito relevante na verificao e captura antignica, migrao para os gnglios linfticos e apresentao antignica aos linfcitos, uma sequncia de funes que conduz, em ultima instncia, induo da resposta inata adaptativa. Considerando estas premissas, a nossa hiptese principal foi que os cidos silicos podem influenciar funes relevantes das DCs, tais como captura de antignios, maturao, migrao para os gnglios linfticos e apresentao antignica s clulas Para testar esta hiptese, dividimos o trabalho em quatro partes: 1) Analismos os glicanos sialilados de superfcie, expressos durante a diferenciao de moncitos humanos em DCs (moDCs). Os nossos dados mostraram que a expresso dos glicanos com ligaes em O (O-glicanos) e sialilados em 2,3, assim como glicanos com ligaes em N (N-glicanos) sialilados em 2,6 e 2,3 aumentou durante o processo de diferenciao das moDCs. Contribuindo para esta nova configurao glicosdica, trs sialiltransferases (STs) podero estar envolvidas: a ST6Gal-1 correlaciona-se com a expresso aumentada de N-glicanos sialilados em 2,6; a ST3Gal-1 contribui para a sialilao em 2,3 de O-glicanos, em especial de antignios T; e a ST3Gal-4 poder ser responsvel pelo aumento de N-glicanos sialilados em 2,3. Aps estmulo e consequente maturao das moDCs, ambos os nveis de expresso gnica de ST6Gal-1 e ST3Gal-4 so negativamente modificados sendo, tambm, que a expresso de ST3Gal-1 varia consoante o estmulo. 2) Estudmos posteriormente as consequncias da modulao dos cidos silicos de superfcie nas funes das DCs. Observmos que a remoo dos cidos silicos de superfcie diminui significativamente a capacidade de macropinocitose e endocitose mediada por receptores nas moDCs. Em contrapartida, o tratamento com sialidase aumentou significativamente a capacidade das moDCs para fagocitar Escherichia coli. Determinou-se tambm que este mecanismo requer a existncia de cido silico presente nas E. coli indicando um mecanismo de interaco hospedeiro-patognio dependente de cido silico em ambas as partes envolvidas. As moDCs tratadas com sialidase tambm apresentam um nvel superior de expresso de molculas de MHC e molculas co-estimulatrias, sugerindo um fentipo celular mais maduro. Recorrendo ao modelo de ratinho, utilizaram-se DCs derivadas de clulas da medula (BMDCs) de ratinhos deficientes em ST3Gal-1 e ST6Gal-1. Estes ensaios revelaram que quer a endocitose quer a maturao so influenciadas por modificaes 37 nos glicanos sialilados em 2,3 ou 2,6. A deteco e quantificao de protenas Nglicosiladas e sialiladas em 2,6 apontou para um potencial envolvimento de integrinas 2 nestes mecanismos. 3) O efeito da sialilao em 2,6 na migrao das DCs para os gnglios linfticos foi tambm analisado. Observmos que BMDCs deficientes para ST6Gal-1 apresentam uma reduo de cerca de 50% nos nveis de migrao das DCs para os gnglios linfticos, tal como aferido em ensaios de inflamao in situ e estudos de transferncia adoptiva de clulas. Uma reduo dos nveis deste tipo de migrao foi tambm observada quando BMDCs nativas foram transferidas para ratinhos receptores deficientes em ST6Gal-1. So, contudo, necessrios mais ensaios de forma a identificar as molculas envolvidas neste processo. 4) Por ltimo, analismos o impacto da sialilao na estimulao antignica das DCs s clulas T. Assim, concluiu-se que moDCs tratadas com sialidase apresentam um nvel de expresso superior de IL-12, TNF-, IL-6 e IL-10, e activao do factor de transcrio nuclear kappa B (NF-B). As DCs tratadas com sialidase induziram uma maior proliferao nas clulas T, com expresso correspondente de interfero-. Este dado sugere que a remoo de cidos silicos de superfcie contribui para o desenvolvimento de uma resposta pro-inflamatria do tipo 1 por clulas T auxiliares (resposta Th1). Considerando estes dados no seu todo, conclumos que o cido silico tem um papel marcante nas funes imunes das DCs. Alteraes concentrao de cido silico superfcie das clulas podem alterar a endocitose/fagocitose, maturao, migrao para os tecidos e gnglios linfticos e capacidade estimulatria para com as clulas T. Complementando estes dados, as ligaes glicosdicas de cidos silicos criados por ST6Gal-1 e ST3Gal-1 so funcionalmente relevantes. A modulao programada da sialilao do glicoclice, mediada por sialidases individuais ou sialiltransferases uma possibilidade aceitvel para a melhoria da fagocitose por DCs e da sua potncia imunolgica. Este facto tem um significado particular para imunoterapias baseadas em DCs, podendo provar-se decisivo para a sua eficincia e aplicabilidade num futuro muito prximo.-------------------------------ABSTRACT: Glycans decorating cell surface and secreted proteins and lipids occupy the junction where critical hosthost and host-pathogen interactions occur. In spite of the wide acceptance that glycans are centrally implicated in immunity, exactly how glycans and their variety and variability contribute to the overall immune response remains poorly defined. Glycans, frequently terminated by sialic acid residues, may be modified by external factors such as pathogens or upon specific physiological cellular events. The terminal, privileged positions of sialic acid-modified structures makes them key, fundamental determinants for a number of immune receptors with known involvement in cellular adhesiveness and cell trafficking, such as Selectins and Siglecs, with known relevant immune functions. At the time this thesis was initiated, it was established that sialic acids expressed at cell surface could modulate important mechanisms of the adaptive immune responses. Given the key role of dendritic cells (DCs) in the transition from innate to the adaptive immune responses, we anticipated that sialic acids could also modulate important mechanisms of human DCs. DCs have a relevant role in antigen screening and uptake, migration to lymph nodes and antigen presentation to lymphocytes, ultimately triggering the adaptive immune response. Therefore, our primary hypothesis was that sialic acids may modulate DC functions, such as antigen uptake, maturation, homing to lymph nodes and antigen presentation to T cells. To test this hypothesis, we divided our work in four parts. 1) Surface sialylated glycans expressed during differentiation from human monocytes to DCs (moDCs) were analyzed. Our data showed that 2,3-sialylated O-glycans and 2,6- and 2,3-sialylated N-glycans expression increased during moDC differentiation. Three main sialyltransferases (STs) are committed with this new glycan configuration: ST6Gal- 1 correlates with the increased expression of 2,6-sialylated N-glycans; ST3Gal-1 32 contributes for the 2,3-sialylation of O-glycans, especially T antigens; and ST3Gal-4 may contribute for the increased 2,3-sialylated N-glycans. Upon moDC maturation, ST6Gal-1 and ST3Gal-4 are downregulated and ST3Gal-1 is altered in a stimulus dependent manner. 2) We subsequently analyzed the consequences of the modulation of cell surface sialic acids in DC functions. We observed that removing surface sialic acid by sialidase significantly decreased the capacity of moDCs to micropinocytose and receptormediated endocytose. In contrast, treatment with a sialidase significantly improved the capacity of moDCs to phagocytose Escherichia coli. The improved phagocytosis mechanism required E. coli sialic acids, indicating a mechanism of hostpathogen interaction dependent on sialic acid moieties. Sialidase-treated moDCs have increased expression of MHC and co-stimulatory molecules, suggesting a more mature phenotype. Experiments using mouse bone marrow-derived DCs (BMDCs) from ST3Gal-1-/- and ST6Gal-1-/- strains indicated that endocytosis and maturation are influenced by changes in either 2,3 or 2,6-sialylated glycans. The analysis of 2,6-sialylated, N-glycosylated proteins, strongly suggested the potential involvement of 2 integrins, underlying these mechanisms. 3) The effect of 2,6-sialylation in DC homing to lymph nodes was also analyzed. We observed that BMDCs deficient for ST6Gal-1 have an almost 50% reduction in DC homing, as assayed by in situ inflammation and adoptive transfer studies. A reduction in DC homing was also observed when wild type BMDCs were transferred into ST6Gal-1-/- recipient mice. Further investigations are necessary to identify the molecules involved in this process. 4) Finally, we also analyzed the impact of sialylation on DCs ability to prime T cells. Sialidase-treated moDCs show increased gene expression of IL-12, TNF-, IL-6 and IL- 10 cytokines, and activation of the transcription factor nuclear factor-B. Sialidase33 treated DCs induced a higher proliferative response of T cells with concomitant higher expression of interferon-, suggesting that the clearance of cell surface sialic acids contributes to the development of a T helper type 1 proinflammatory response. Together, our data strongly support sialic acids relevance in DC immune functions. Alterations of cell surface sialic acid content can alter the endocytosis/phagocytosis, maturation, migration/homing and the ability for T cell priming in human DCs. Moreover, sialic acid linkages created by ST6Gal-1 and ST3Gal-1 are functionally relevant. The engineering of cell surface sialylation, mediated by individual sialidases or sialyltransferases is a likely possibility to fine tune DC phagocytosis and immunological potency, with particular significance to DC-based therapies.
Resumo:
A compreenso da ocorrncia das doenas em termos de risco e o estabelecimento de relaes com os chamados estilos de vida, colocam na experincia de doena um acrscimo de conotaes morais, um dever de autodisciplina e responsabilidade. Estes princpios tm sido inmeras vezes sublinhados nos discursos e polticas da Sade Pblica, nomeadamente no que concerne s doenas cardiovasculares pela importncia epidemiolgica, econmica e social de que se revestem e consequente necessidade de reduo da sua grande incidncia na populao, como o caso de Portugal. A hipertenso, como doena crnica e fator de risco cardiovascular sujeita os doentes a controlo mdico peridico, teraputica farmacolgica e impele a um comprometimento com comportamentos alimentares e exerccio fsico adequado. Atravs das entrevistas realizadas a doentes hipertensos utentes da consulta especfica em Cuidados de Sade Primrios, verifica-se a presena de modos diversos de agir perante a circunstncia de se ter hipertenso arterial, mostrando a presena de vrias racionalidades, apreciaes e valoraes prticas dos comportamentos de sade e doena e do prprio corpo. Para os doentes hipertensos entrevistados, a hipertenso arterial no encarada como uma verdadeira doena, sendo vista sobretudo como resultado do envelhecimento e dos excessos que se acumularam no corpo, consequentes da prpria vida. Nas narrativas de experincia de doena, os conceitos de moderao e equilbrio, ter cuidado, parecem servir de mecanismo de operacionalizao entre aquilo que so as recomendaes mdicas e as prticas individuais. Constatam-se as capacidades dos doentes hipertensos construrem para si formas de gesto da doena e do medo, sendo que os seus comportamentos podem passar por assumir o controlo dos fatores de risco ou ignor-los. Em qualquer dos casos, as representaes e aes relativas hipertenso e s recomendaes mdicas a ela associadas integram-se nas prticas quotidianas dos doentes, ajustando-se a hbitos e representaes instaladas, constituindo-se em modos distintos de agir dos doentes hipertensos.
Resumo:
Foram estudadas populaes de Anopheles triannulatusprocedentes da hidreltrica de Balbina (AM), quanto ao sistema das esterases, usando-se gel de poliacrilamida e como substrato α-naftil propionato A anlise eletrofortica possibilitou identificar seis zonas de atividade e o mecanismo de herana foi estudado para cinco locique foram polimrficos. Foram detectados dois alelos para as esterases 1, 2 e 4 e trs para as esterases 3 e 5, sendo todos de ao codominante. Os dados de frequncias gnicas mostraram-se diferentes para os alelos em cada locus.Os valores de qui-quadrados para as frequncias genotpicas evidenciaram que a populao no est em equilbrio para todos os loci,sendo as frequncias observadas dos homozigotos superiores as esperadas. Esses resultados foram interpretados como decorrentes de alteraes ambientais que esto ocorrendo na rea em estudo.
Resumo:
RESUMO: Introduo: Tratamento do carcinoma da mama Este trabalho inicia-se com a histria do tratamento do carcinoma da mama, desde os primeiros documentos que descrevem doentes com carcinoma da mama at 1950. Desde 1950 at 2000 o diagnstico, risco e as modalidades teraputicas usadas no tratamento das doentes so mais detalhadas com nfase nas teraputicas locais, regionais e sistmicas. Parte 1:Quem tratar com teraputica sistmica adjuvante Captulo 1: A classificao TNM no est morta no carcinoma da mama Tem sido dito que a classificao TNM no adequada para usar como ferramenta de prognstico e deciso teraputica no carcinoma da mama, especialmente em doentes com carcinoma detectado atravs de rastreio, que tem geralmente menores dimenses. A razo desta classificao no ser adequada prendese com o facto de no estarem incluidos parmetros biolgicos na classificao TNM atual. Pusemos a hiptese de que numa populao com alta percentagem de carcinoma da mama no detectado em exames de rastreio, com uma mediana de idade baixa e com alta percentagem de estadios II e III, o estadiamento clssico, pela classificao TNM, mais descriminatrio que as caractersticas biolgicas na determinao do prognstico. Para isto analismos uma populao de doentes com carcinoma da mama tratados consecutivamente na mesma instituio, durante 10 anos. Caracterizmos os fatores de prognstico do estadiamento clssico includos na classificao TNM e as variantes biolgicas, presentemente no includas na classificao TNM. Quantificmos a capacidade de cada um dos factores de prognstico para para prever a sobrevivncia. A populao de 1699 doentes com carcinoma da mama que foram tratdos com teraputica sistmica adjuvante. Individualmente, cada um dos fatores de prognostico, clssicos ou biolgicos, diferem significativamente entre doentes que sobrevivem e que no sobrevivem. Explicitamente, como previsto, doentes com tumores maiores, envolvimento dos gnglios axilares, estadios TNM mais avanados, que no expressam recetor de esrogneo, com amplificao do gene Her2, triplos negativos ou de menor diferenciao tm menor sobrevida. Na anlise multivariada, s os fatores de prognostico da classificao TNM, o grau histolgico e a amplificao do gene Her2, esta ltima com menos significncia estatistica so preditores independentes de sobrevivncia. Captulo 2: Em busca de novos factores de prognostico: Poder preditivo e mecanismo das alteraes de centrossomas em carcinoma da mama Compilmos inmeros grupos de experincias de genmica feitas em tumores primrios de doentes com carcinoma da mama para as quais existe informao prognstica. Estas experincias so feitas com o objectivo de descobrir novos factores de prognstico. Reanalismos os dados, repetindo a mesma pergunta: Quais so os genes com expresso diferencial estatisticamente significativa entre doentes que recaram e doentes que no recaram. Identificmos 65 genes nestas condies e o MKI67, o gene que codifica a proteina Ki67, estava nesse grupo. Identificmos vrios genes que se sabe estarem envolvidos no processo de agregao de centrossomas. O gene que considermos mais promissor foi a kinesina KiFC1, que j tinha sido identificada como regulador da agregao de centrossomas. Anomalias cetrossomais numricas e estruturais tm sido observadas em neoplasias. H dados correlacionando anolmalias centrossomais estruturais e e numricas com o grau de malignidade e os eventos precoces da carcinognese. Mas estas anomalias centrossomais tm um peso para a clula que deve adapatar-se ou entrar em apoptose. Os nossos resultados sugerem que existe um mecanismo adaptativo, a agregao de centrossomas, com impacto prognstico negativo. O nosso objetivo foi quantificar o valor prognstico das anomalias centrossomais no carcinoma da mama. Para isto usmos material de doentes dos quais sabemos a histria natural. Avalimos os genes de agregao de centrossomas, KIFC1 e TACC3, nas amostras tumorais arquivadas em parafina: primeiro com PCR (polymerase chain reaction) quantitativa e depois com imunohistoqumica (IHQ). Apenas a protena KIFC1 foi discriminatria em IHQ, no se tendo conseguido otimizar o anticorpo da TACC3. Os nveis proteicos de KIFC1 correlacionam-se com mau prognstico. Nas doentes que recaram observmos, no tumor primrio, maior abundncia desta protena com localizao nuclear. Em seguida, demonstrmos que a agregao de centrossomas um fenmeno que ocorre in vivo. Identificmos centrossomas agregados em amostras de tumores primrios de doentes que recaram. Tecnicamente usmos microscopia de fluorescncia e IHQ contra protenas centrossomais que avalimos nos tumores primrios arquivados em blocos de parafina. Observmos agregao de centrossomas num pequeno nmero de doentes que recaram, no validmos, ainda, este fentipo celular em larga escala. Parte 2: Como tratar com teraputica sistmica os vrios subtipos de carcinoma da mama Captulo 3: Quantas doenas esto englobadas na definio carcinoma da mama triplo negativo? (reviso) O carcinoma da mama triplo negativo um tumor que no expressa trs protenas: recetor de estrognio, recetor de progesterona e o recetor do fator de crescimento epidermico tipo 2 (Her2). As doentes com estes tumores no so ainda tratadas com teraputica dirigida, possivelmente porque esta definio negativa no tem ajudado. Sabemos apenas as alteraes genticas que estes tumores no tm, no as que eles tm. Talvez por esta razo, estes tumores so o subtipo mais agressivo de carcinoma da mama. No entanto, na prtica clnica observamos que estas doentes no tm sempre mau prognstico, alm de que dados de histopatologia e epidemiologia sugerem que esta definio negativa no est a capturar um nico subtipo de carcinoma da mama, mas vrios. Avalimos criticamente esta evidncia, clnica, histopatolgica, epidemiolgica e molecular. H evidncia de heterogeneidade, mas no claro quantos subtipos esto englobados nesta definio de carcinoma da mama triplo negativo. A resposta a esta pergunta, e a identificao do fundamento molecular desta heterogeneidade vai ajudar a melhor definir o prognstico e eventualmente a definir novos alvos teraputicos nesta populao difcil. Captulo 4: Terapuica sistmica em carcinoma da mama triplo negativo (reviso) A quimioterapia a nica teraputica sistmica disponvel para as doentes com carcinoma da mama triplo negativo, ao contrrio dos outros dois subtipo de carcinoma da mama que tm com a teraputica antiestrognica e anti Her2, importantes benefcios. Apesar de terem surgido vrias opes teraputicas para estes doentes nennhuma teraputica dirigida foi validada pelos ensaios clnicos conduzidos, possivelmente porque a biologia deste carcinoma ainda no foi elucidada. Muitos ensaios demonstram que os tumores triplos negativos beneficiam com quimioterapia e que as mais altas taxas de resposta patolgica completa teraputica neoadjuvante so observadas precisamente nestes tumors. A resposta patolgica completa correlaciona-se com a sobrevivncia. Estamos a estudar regimes adjuvantes especficos para doentes com estes tumors, mas, neste momento, regimes de terceira gerao com taxanos e antraciclinas so os mais promissores. O papel de subgrupos de frmacos especficos, como os sais de platina, mantmse mal definido. Quanto s antraciclinas e taxanos, estes grupos no mostraram beneficio especfico em carcinoma da mama triplo negativo quando comparado com os outros subtipos. Os prprios carcinomas da mama triplos negativos so heterogneos e carcinomas da mama basais triplos negativos com elevada taxa de proliferao e carcinomas da mama triplos negativos surgidos em doentes com mutao germinal BRCA1 podero ser mais sensveis a sais de platino e menos sensveis a taxanos. Como a definio molecular ainda no foi explicada a busca de teraputica dirigida vai continuar. Captulo 5: Ensaio randomizado de fase II do anticorpo monoclonal contra o recetor do fator de crescimento epidrmico tipo 1 combinado com cisplatino versus cisplatino em monoterapia em doentes com carcinoma da mama triplo negativo metastizado O recetor do fator de crescimento epidrmico tipo 1 est sobre expresso nos tumores das doentes com carcinoma da mama triplo negativo metastizado, um subtipo agressivo de carcinoma da mama. Este ensaio investigou a combinao de cetuximab e cisplatino versus cisplatino isolado em doentes deste tipo. Doentes em primeira ou segunda linha de teraputica para doena metastizada foram randomizadas, num sistema de 2 para 1, para receber at 6 ciclos da combinao de cisplatino e cetuximab ou cisplatino isolado. s doentes randomizadas para o brao de monoterapia podiamos, aps progresso, acrescentar cetuximab ou trat-las com cetuximab isolado. O objetivo primrio foi a taxa de resposta global. Os objetivos secundrios foram a sobrevivncia livre de doena, a sobrevivncia global e o perfil de segurana dos frmacos. A populao em anlise foram 115 doentes tratadas com a combinao e 58 doentes tratadas com cisplatino em monoterapia, 31 destas em quem se documentou progresso passaram a ser tratadas com um regime que inclua cetuximab, isolado ou em combinao. A taxa de resposta global foi de 20% no brao da combinaao e de 10% no brao da monoterapia (odds ratio, 2.13). A sobrevivncia livre de doena foi de 3.7 meses no brao da combinao e de 1.5 meses no brao em monoterapia (hazard ratio, 0.67). A sobrevivncia global foi de 12.9 meses no brao da combinao versus 9.4 meses no brao de cisplatino. Conclui-se que, apesar de no ter sido alcanado o objectivo primrio, acrescentar cetuximab, duplica a resposta e prolonga tanto a sobrevivncia livre de doena como a sobrevivncia global. Captulo 6: Bloquear a angiognese para tratar o carcinoma da mama (reviso) A angiognese uma caracterstica que define a neoplasia, porque tumores com mais de 1mm precisam de formar novos vasos para poderem crescer. Desde que se descobriram as molculas que orquestram esta transformao, que se tm procurado desenvolver e testar frmacos que interfiram com este processo. No carcinoma da mama o bevacizumab foi o primeiro frmaco aprovado pela FDA em primeira linha para tratar doena metasttica. Depois foram estudados um grupo de inibidores de tirosina cinase associados aos recetores transmembranares envolvidos na angiognese como o VEGFR, PDGFR, KIT, RET, BRAF e Flt3: sunitinib, sorafenib, pazopanib e axitinib Neste captulo, analisaram-se e resumiram-se os dados dos ensaios clnicos das drogas anti-angiognicas no tratamaneto do carcinoma da mama. Os ensaios de fase III do bevacizumab em carcinoma da mama mostraram uma reduo na progresso de doena de 22 a 52% e aumento da sobrevivncia livre de doena de 1.2 a 5.5 meses mas nunca foi demonstrado prolongamento de sobrevivncia. Os ensaios de fase III em carcinoma da mama adjuvante com bevacizumab so dois e foram ambos negativos. O ensaio de fase III com o inibidor da tirosina cinase, sunitinib foi negativo, enquanto que os ensaios de fase II com os inibidores da tirosina cinase sorafenib e pazopanib melhoraram alguns indicadores de resposta e sobrevivncia. A endostatina foi testada no contexto neoadjuvante com antraciclinas e melhorou a taxa de resposta, mas, mais ensaios so necessrios para estabelecer este frmaco. A maioria dos ensaios clnicos dos agentes antiangiognicos em carcinoma da mama reportaram aumento da taxa de resposta e de sobrevivncia livre de doena mas nunca aumento da sobrevivncia global quando comparado com quimioterapia isolada o que levou ao cepticismo a que assistimos atualmente em relao ao bloqueio da angiognese. Ensaios clnicos selecionados em doentes especficas com objetivos translacionais relacionados com material biolgico colhido, preferefencialmente em diferentes intervalos da teraputica, sero cruciais para o bloqueio da angiognese sobreviver como estratgia teraputica em carcinoma da mama. Captulo 7: A resposta hipoxia medeia a resistncia primria ao sunitinib em carcinoma da mama localmente avanado O sunitinib um frmaco antiangiognico que nunca foi avaliado isolado em doentes com carcinoma da mama no tratadas. O nosso objetivo foi caracaterizar a atividade do sunitinib isolado e em combinao com o docetaxel em carcinoma da mama no tratado, localmente avanado ou opervel, mas de dimenso superior a 2 cm, para compreender os mecanismos de resposta. Doze doentes foram tratadas com duas semanas iniciais de sunitinib seguido de quatro ciclos de combinao de sunitinib e docetaxel. A resposta, a reistncia e a toxicidade foram avaliadas de acordo com parametros clnicos, ressonncia magntica nuclear, tomografia de emisso de positres, histopatologia e perfis de expresso genmica. Detetmos resistncia primria ao sunitinib na janela inicial de duas semanas, evidenciada em quatro doentes que no responderam. data da cirurgia, cinco doentes tinham tumor vivel na mama e axila, quatro tinahm tumor vivel na mama e trs foram retiradas do ensaio. No houve respostas patolgicas completas. A comparao dos perfis de expresso genmica entre os respondedores e os no respondedores, aos quinze dias iniciais, permitiu-nos identificar sobre expresso de VEGF e outras vias angiognicas nos no respondedores. Especificamente, em tumores resistentes ao sunitinib isolado detectmos uma resposta transcricional hipoxia caracterizada por sobre expresso de vrios dos genes alvo do HIF1. Neste ensaio de sunitinib isolado em doentes no tratadas com carcinoma da mama localmente avanado, encontrmos evidncia molecular de resistncia primria ao sunitinib possivelmente mediada por sobre expresso de genes que respondem hipoxia. Parte 3: Quando parar a teraputica sistmica s doentes com carcinoma da mama Captulo 8: Agressividade teraputica ns ltimos trs meses de vida num estudo retrospetivo dum centro nico Inclumos todos os adultos que morreram com tumores slidos na instituio em 2003 e foram tratados com quimioterapia para tratar neoplaias metastizadas. Colhemos dados detalhados relacionados com quimioterapia e toxicidade nos ltimos trs meses de vida a partir do processo clnico. Trezentas e dezanove doentes foram includos, a mediana de idade foi 61 anos. A mediana de sobrevivncia de doena metasttica foi de 11 meses. 66% (211) dos doentes foram tratados com QT nos ltimos 3 meses de vida, 37% foram tratados com QT no limo ms de vida e 21% nas ltimas duas semanas. Nos doentes que foram tratados com QT nos ltimos trs meses de vida, 50% comearam um novo regime teraputico neste perodo e 14% comearam um novo regime no ltimo ms. Identificmos como determinantes de tratamento com QT no fim de vida a idade jovem, o carcinoma da mama, do ovrio e do pncreas. Conclumos que administrmos QT no fim de vida frequentemente e inicimos novos regimes teraputicos no ltimo ms de vida em 14% dos casos. Precisamos de aprofundar este trabalho para compreender se esta atitude agressiva resulta em melhor paliao de sintomas e qualidade de vida no fim de vida dos doentes com neoplasias disseminadas. Captulo 9: O tratamento do carcinoma da mama no fim de vida est a mudar? Quismos caracterizar a modificao da tendncia no uso de QT e de estratgias paliativas no fim de vida das doentes com carcinoma da mama em diferentes instituies e em intervalos de tempo diferentes. Para isto selecionmos doentes que morreram de carcinoma da mama durante 6 anos, entre 2007 e 2012, num hospital geral e comparmos com as doentes que morreram de carcinoma da mama em 2003 num centro oncolgico. Avalimos um total de 232 doentes. O grupo mais recente tem 114 doentes e o grupo anterior tem 118 doentes. Usmos estatstica descritiva para caracterizar QT no fim de vida e o uso de estratgias paliativas. Ambas as coortes so comparveis em termos das caractersticas do carcinoma da mama. Observmos aumento do uso de estatgias paliativas: consulta da dor, consulta de cuidados paliativos e radioterapia paliativa no cuidado das doentes com carcinoma da mama metastizado. Evidencimos aumento do nmero de mortes em servios de cuidados paliativos. No entanto, a QT paliativa continua a ser prolongada at aos ltimos meses de vida, embora tenhamos mostrado uma diminuio desta prtica. Outros indicadores de agressividade como a admisso hospitalar tambm mostraram diminuio. Confirmmos a nossa hiptese de que h maior integrao da medicina paliativa multidisciplinar e menos agressividade na teraputica sistmica das doentes com carcinoma da mama nos ltimos meses de vida. Chapter 10: Porque que os nossos doentes so tratados com quimioterapia at ao fim da vida? (editorial) Este captulo comea por dar o exmeplo duma jovem de 22 anos que viveu trs meses aps comear QT paliatva. Este caso epitomiza a futilidade teraputica e usado como ponto de partida para explorar as razes pelas quais administramos QT no fim de vida aos doentes quando intil, txica, logisticamente complexa e cara. Ser que estamos a prescrever QT at tarde demais? Os oncologistas fazem previses excessivamente otimistas e tm uma atitude pr teraputica excessiva e so criticados por outros intervenientes nas instituies de sade por isto. Crescentemente doentes, familiares, associaes de doentes, definidores de polticas de sade, jornalistas e a sociedade em geral afloram este tema mas tornam-se inconsistentes quando se trata dum doente prximo em que se modifica o discurso para que se faam teraputicas sitmicas agressivas. H uma crescente cultura de preservao da qualidade de vida, paliao, abordagem sintomtica, referenciao a unidades de cuidados paliativos e outros temas do fim de vida dos doentes oncolgicos terminais. Infelizmente, este tema tem ganhado momentum no porque os oncologistas estejam a refletir criticamente sobre a sua prtica, mas porque os custos dos cuidados de sade so crescentes e incomportveis. Seja qual fr o motivo, as razes que levam os oncologistas a administrar QT no fim de vida devem ser criticamente elucidadas. Mas h poucos dados para nos guiar nesta fase delicada da vida dos doentes e os que existem so por vezes irreconciliveis, uma reviso destes dados que foi feita neste captulo. Concluso: A abordagem do carcinoma da mama no futuro? Na concluso, tenta-se olhar para o futuro e prever como ser a tomada a cargo dum doente com carcioma da mama amanh. Faz-se uma avaliao das vrias reas desde preveno, rastreio, suscetibilidade gentica e comportamental e teraputica. Na teraputica separa-se a teraputica locoregional, sistmica adjuvante e da doena metastizada. Nos trs ltimos pargrafos a histria duma mulher com um carcinoma localmente avanado que sobre expressa o recetor Her2, serve como ilustrao de como devemos estar preparados para incorporar evoluo, heterogeneidade e dinamismo no cuidado de doentes com carcinoma da mama. -------------------------------------------------------------------------------------------------- ABSTRACT: Introduction: Breast cancer care in the past This work starts with an overview of the treatment of breast cancer (BC). From the first reports of patients ill with BC until 1950. From 1950 until 2000, there is a more detailed account on how BC patients were treated with emphasis on the different modalities, local, regional and systemic treatments and their evolution. Part 1: Who to treat with adjuvant systemic therapy? Chapter 1: TNM is not dead in breast cancer It has been said that the current TNM staging system might not be suitable for predicting breast cancer (BC) outcomes and for making therapeutic decisions, especially for patients with screen detected BC which is smaller. The reason for this is also due to the non inclusion of tumor biology parameters in the current TNM system. We hypothesize that in a population where there is still a large abundance of non screen detected BC, with a low median age of incidence and abundance of high TNM staged lesions, biology is still second to classical staging in predicting prognosis. We analyzed a population of consecutive BC patients from a single institution during ten years. We characterized current established prognostic factors, classical staging variables included in the current TNM staging system and biological variables, currently not included in the TNM system. We quantified the capacity of individual prognostic factors to predict survival. We analyzed a population of 1699 consecutive BC patients. We found that individually both the TNM system prognostic factors and the biological prognostic factors are differing among BC survivors and dead patients in a statistically significant distribution. Explicitly, patients with larger tumors, positive nodes, higher stage lesions, ER negative, HER2 positive, TN or lower differentiation tumors show decreased survival. In the multivariate analysis we can conclude that in a population such as ours classical TNM staging variables, irrespective of tumor biological features, are still the most powerful outcome predictors. Chapter 2: Defining breast cancer prognosis: The predictive power and mechanism of centrosome alterations in breast cancer We performed a systematic analysis of the literature and compiled an extensive data set of gene expression data originated in primary tumours of BC patients with prognostic information. We analysed this data seeking for genes consistently up or down regulated in poor prognosis BC, i.e. that relapsed after initial treatment. In the course this bioinformatics analysis our lab identified 65 genes statistically significant across multiple datasets that can discriminate between relapsed and non-relapsed BC patients. Among the identified genes, we have detected genes such as MKI67, a marker of mitotic activity which is routinely used in the clinic. Unexpectedly, we also discovered several genes found to be involved in centrosome clustering, The most prominent of these is the kinesin KIFC1, also called HSET, and previously identified as regulator of centrosome clustering. Centrosome abnormalities (numerical, structural) have been observed in cancer. Indeed, compelling data has shown that cells from many cancers have multiple and abnormal centrosomes, that are either correlated with tumour malignancy or considered an early tumorigenesis event. However, extra centrosomes come at a cost and cells must be able to handle such abnormalities or otherwise die. Thus our results suggested a new mechanism of breast cancer progression with negative prognostic value. We aimed at quantifying the predictive power of centrosome clustering in BC clinical setting and at detecting this process in BC patient material. We validated the centrosome clustering genes KIFC1 and TACC3 in formalin fixed paraffin embedded (FFPE) BC patient material, using quantitative real-time PCR (RT-qPCR) technology. Our results indicate that the tested KIFC1 has a clear IHC signal (1) and that the protein expression patterns and levels correlate with prognosis, with relapsing patients having increased expression and nuclear localisation of this kinesin (2). Next we were able to show that centrosome clustering does occur in vivo. We identified centrosome amplification and clustering in breast cancer samples, and we established a fluorescence microscopy-based IHC approach by staining FFPE samples with centrosomal markers. Using this approach we have observed centrosome amplification and clustering in a small set of poor prognosis samples. By expanding the number of samples in which we have characterised the number of centrosomes, we were able to confirm our preliminary observation that centrosomes are clustered in relapsed BC. Part 2: How to treat breast cancer subtypes? Chapter 3: How many diseases is triple negative breast cancer? (review) Triple negative breast cancer is a subtype of breast cancer that does not express the estrogen receptor, the progesterone receptor and the epidermal growth factor receptor type 2 (Her2). These tumors are not yet treated with targeted therapies probably because no positive markers have been described to reliably classify them - they are described for what they are not. Perhaps for this reason, they are among the most aggressive of breast carcinomas, albeit with very heterogenous clinical behavior. The clinical observation that these patients do not carry a uniformly dismal prognosis, coupled with data coming from pathology and epidemiology, suggests that this negative definition is not capturing a single clinical entity, but several. We critically evaluate this evidence in this paper, reviewing clinical and epidemiological data, as well as molecular data. There is evidence for heterogeneity, but it is not clear how many diseases are grouped into triple negative breast cancer. Answering this question, and identifying the molecular basis of heterogeneity will help define prognosis and, eventually, the identification of new targeted therapies. Chapter 4: Systemic treatment for triple negative breast cancer (review) Chemotherapy remains the backbone of treatment for triple negative breast cancer (TNBC). Despite the appearance of new targeted and biologic agents there has been no targeted therapy validated for TNBC, possibly because the biology of TNBC has not been conclusively elucidated. Many studies have shown that TNBC derive significant benefit of chemotherapy in the neoadjuvant, adjuvant and metastatic treatment, possibly more benefit than other BC subtypes. Neoadjuvant chemotherapy studies have repeatedly shown higher response rates in TNBC than non-TNBC. Pathologic complete response has been shown to predict improved long term outcomes in BC. Although specific adjuvant regimens for TNBC are under study, third generation chemotherapy regimens utilizing dose dense or metronomic polychemotherapy are among the most effective tools presently available. The role of specific chemotherapy agents, namely platinum salts, in the treatment of TNBC remains undefined. Taxanes and anthracyclines are active in TNBC and remain important agents, but have not shown specific benefit over non-TNBC. TNBC is itself a heterogeneous group in which subgroups like basal like BC defined by higher proliferation and including those TNBC arising in BRCA1 mutation carriers may be more sensitive to platinum agents and relatively less sensitive to taxanes. The molecular characterization of TNBC is lacking and therefore the search for targeted therapy is still ongoing. Chapter 5: Randomized phase II study of the anti-epidermal growth factor receptor monoclonal antibody cetuximab with cisplatin versus cisplatin alone in patients with metastatic triple-negative breast cancer Epidermal growth factor receptor is overexpressed in metastatic triple-negative breast cancers, an aggressive subtype of breast cancer. Our randomized phase II study investigated cisplatin with or without cetuximab in this setting. Patients who had received no more than one previous chemotherapy regimen were randomly assigned on a 2:1 schedule to receive no more than six cycles of cisplatin plus cetuximab or cisplatin alone. Patients receiving cisplatin alone could switch to cisplatin plus cetuximab or cetuximab alone on disease progression. The primary end point was overall response rate (ORR). Secondary end points studied included progressionfree survival (PFS), overall survival (OS), and safety profiles. The full analysis set comprised 115 patients receiving cisplatin plus cetuximab and 58 receiving cisplatin alone; 31 patients whose disease progressed on cisplatin alone switched to cetuximab-containing therapy. The ORR was 20% with cisplatin plus cetuximab and 10% with cisplatin alone (odds ratio, 2.13). Cisplatin plus cetuximab resulted in longer PFS compared with cisplatin alone (median, 3.7 v 1.5 months; hazard ratio, 0.67. Corresponding median OS was 12.9 versus 9.4 months. While the primary study end point was not met, adding cetuximab to cisplatin doubled the ORR and appeared to prolong PFS and OS, warranting further investigation in mTNBC. Chapter 6: Blocking angiogenesis to treat breast cancer (review) Angiogenesis is a hallmark of cancer because tumors larger than 1mm need new vessels to sustain their growth. Since the discovery of the molecular players of this process and some inhibitors, that angiogenesis became a promising therapeutic target. Bevacizumab was the first molecular-targeted antiangiogenic therapy approved by the FDA and is used as first-line therapy in metastatic breast cancer. A second class of approved inhibitors (sunitinib, sorafenib, pazopanib and axitinib) include oral small-molecule tyrosine kinase inhibitors that target vascular endothelial growth factor receptors, platelet-derived growth factor receptors, and other kinases including KIT, Ret, BRAF and Flt-3, but none of these have gained approval to treat breast cancer. This review analyzes and summarizes data from clinical trials of anti-angiogenic agents in the treatment of BC. Phase III trials of bevacizumab in advanced BC have demonstrated a reduction in disease progression (2252%), increased response rates and improvements in progression-free survival of 1.2 to 5.5 months, but no improvements in OS. Bevacizumab phase III trials in early BC have both been negative. Bevacizumab combined with chemotherapy is associated with more adverse events. Phase III trials of the tyrosine kinase inhibitor sunitinib were negative, while randomized phase II trials of sorafenib and pazopanib have improved some outcomes. Endostatin has been tested in neoadjuvant clinical trials in combination with anthracyclinebased chemotherapy in treatment-naive patients and has increased the clinical response rate, but more trials are needed to establish this drug. Most trials of anti-angiogenic agents in BC have reported improved RR and PFS but no increase in OS compared to chemotherapy alone, leading to skepticism towards blocking angiogenesis. Selected trials in selected BC populations with translational endpoints related to harvested tumor tissue and other biological material samples, preferentially at several timepoints, will be crucial if antiangiogenesis is to survive as a strategy to treat BC. Chapter 7: Does hypoxic response mediate primary resistance to sunitinib in untreated locally advanced breast cancer? The antiangiogenic drug sunitinib has never been evaluated as single agent in untreated BC patients. We aimed to characterize the activity of sunitinib, alone and with docetaxel, in untreated locally advanced or operable BC, and, to uncover the mechanisms of response. Twelve patients were treated with an upfront window of sunitinib followed by four cycles of sunitinib plus docetaxel. Response, resistance and toxicity were evaluated according to standard clinical parameters, magnetic resonance imaging, positron emission tomography, pathology characterization and gene expression profiling. We detected primary resistance to sunitinib upfront window in untreated BC, as evidenced by four non-responding patients. At surgery, five patients had viable disease in the breast and axilla, four had viable tumor cells in the breast alone and three were taken off study due to unacceptable toxicity and thus not evaluated. Early functional imaging was useful in predicting response. There were no pathologic complete responses (pCR). Comparison of gene expression profiling tumor data between early responders and non-responders allowed us to identify upregulation of VEGF and angiogenic pathways in non responders. Specifically, in tumors resistant to the single-agent sunitinib we detected a transcriptional response to hypoxia characterized by over-expression of several HIF1 target genes. In this report of single-agent sunitinib treatment of untreated localized BC patients, we found molecular evidence of primary resistance to sunitinib likely mediated by up-regulation of hypoxia responsive genes. Part 3: When to stop systemic treatment of breast cancer patients? Chapter 8: The aggressiveness of cancer care in the last three months of life: a retrospective single centre analysis. All adult patients with solid tumors who died in our hospital in 2003 and received chemotherapy for advanced cancer, were included. Detailed data concerning chemotherapy and toxicity, in the last three months of life, were collected from patients clinical charts. A total of 319 patients were included. Median age was 61 years. Median time from diagnosis of metastatic disease to death was 11 months. The proportion of patients who received chemotherapy in the last three months of life was 66% (n=211), in the last month 37% and in the last two weeks 21%. Among patients who received chemotherapy in the last three months of life, 50% started a new chemotherapy regimen in this period and 14% in the last month. There was an increased probability of receiving chemotherapy in the last three months of life in younger patients and in patients with breast, ovarian and pancreatic carcinomas. There was a large proportion of patients who received chemotherapy in the last three months of life, including initiation of a new regimen within the last 30 days. Thus, further study is needed to evaluate if such aggressive attitude results in better palliation of symptoms at the end of life. Chapter 9: Is breast cancer treatment in the end of life changing? We aimed to characterize the shifting trends in use of anti-cancer chemotherapy and palliative care approaches in the end of life of BC patients in different institutions and times. For this, we selected women that died of BC during six years, from 2007 to 2012, and were treated in a central acute care general hospital and compared it with the BC patients that died in 2003 and were treated in a large cancer center. We analyzed a total of 232 patients: the more recent group has 114 women and the older cohort has 118. We used descriptive statistics to characterize CT in the EoL and use of palliative care resources. Both populations were similar in terms of BC characteristics. We observed more palliative care resources, pain clinic, palliative care teams and palliative radiotherapy, involved in the care of MBC patients and a shift towards more deaths at hospices. Systemic anti cancer treatments continue to be prolonged until very late in patients lives, notwithstanding, we could show a decrease in the use of such treatments. Other indicators of aggressiveness, namely hospital admissions, also show a decrease. We confirmed our hypothesis that there is more integration of multidisciplinary palliative care and less aggressiveness in the treatment of metastatic cancer patients, specifically, use of palliative anti-cancer treatment and hospital admissions. Nonetheless, we use systemic therapy until too late with underutilization of palliative medicine. Chapter 10: Why do our patients get chemotherapy until the end of life? (editorial) The editorial starts with a clinical case of a 21 year old patient that lives three months after starting palliative chemotherapy for the first time, a case that illustrates therapeutic futility at the end of life. Why are we not ceasing chemotherapy when it is useless, toxic, logistically complex and expensive? Are we prescribing chemotherapy until too late in solid tumor patients lives? Medical oncologists have overly optimistic predictions and, excessive, treatment-prone attitude and they are criticized by other health care providers for this. Increasingly, patients, their families, advocacy groups, policy makers, journalists and society at large dwell on this topic, which is a perplexing conundrum, because sometimes they are the ones demanding not to stop aggressive systemic anticancer treatments, when it comes to their loved ones. There is a growing culture of awareness toward preserving quality of life, palliative care, symptom-directed care, hospice referral and end of life issues regarding terminal cancer patients. Sadly, this issue is gaining momentum, not because oncologists are questioning their practice but because health care costs are soaring. Whatever the motive, the reasons for administering chemotherapy at the end of life should be known. There are few and conflicting scientific data to guide treatments in this delicate setting and we review this evidence in this paper. Conclusion: What is the future of breast cancer care? This work ends with a view into the future of BC care. Looking into the different areas from prevention, screening, hereditary BC, local, regional and systemic treatments of adjuvant and metastatic patients. The last three paragraphs are a final comment where the story of a patient with Her2 positive locally advanced breast cancer is used as paradigm of evolution, heterogeneity and dynamism in the management of BC.
