Fisiopatologia da microcirculação coronária e perfusão do miorcárdio : ecocardiografia de contraste do miocárdio e doppler transtorácico

RESUMO: Este trabalho tentou contribuir para a caracterização da fisiopatologia da microcirculação coronária em diferentes formas de patologia com o auxílio da ecocardiografia transtorácica. Com a aplicação da ecocardiografia Doppler transtorácica foi efectuado o estudo da reserva coronária da artéria descendente anterior e com a ecocardiografia de contraste do miocárdio foram analisados parâmetros de perfusão do miocárdio como a velocidade da microcirculação coronária, o volume de sangue miocárdico e a reserva de fluxo miocárdico. Estas técnicas foram utilizadas em diferentes situações fisiopatológicas com particular interesse na hipertrofia ventricular esquerda de diferentes etiologias como a hipertensão arterial, estenose aórtica e cardiomiopatia hipertrófica. Também na diabetes mellitus tipo 2 e na doença coronária aterosclerótica, estudámos as alterações da microcirculação coronária. Com a mesma técnica de ecocardiografia de contraste do miocárdio foi analisada a perfusão do miocárdio num modelo experimental animal sujeito a uma dieta aterogénica. Além das conclusões específicas em relação a cada um dos trabalhos efectuados há a referir como conclusões gerais a sua fácil aplicabilidade e exequibilidade em âmbito clínico, a sua reprodutibilidade e precisão. Quando comparadas com técnicas consideradas de referência mostraram resultados com significativa correlação estatística. Em todos os doentes e nos grupos controle foi possível comprovar e quantificar o gradiente de perfusão transmural em repouso e durante a acção de stress vasodilatador, relevando a importância da perfusão sub-endocárdica na função do ventrículo esquerdo. O estudo da microcirculação coronária no grupo de doentes com hipertrofia ventricular esquerda revelou que no grupo com hipertensão arterial existe disfunção da microcirculação coronária ainda antes de se observar aumento de massa do ventrículo esquerdo, e que esta disfunção é diferente em função da geometria ventricular. Nos doentes com estenose aórtica foi demonstrado que além da disfunção da microcirculação coronária, explicada pelo fenómeno de hipertrofia, existe outro componente extrínseco que depois de corrigido através de cirurgia de substituição valvular, conduziu a uma parcial normalização dos valores de reserva coronária. Na cardiomiopatia hipertrófica observou-se uma grande heterogeneidade de perfusão transmural e foi documentado, em imagens de ecocardiografia de contraste do miocárdio e após análise paramétrica, a ausência de perfusão do miocárdio na região sub-endocárdica durante o stress vasodilatador de reserva coronária diminuídos em fases precoces de evolução da doença. Foi demonstrado que a reserva coronária na DM2 em fases mais avançadas estava significativamente diminuída. Descrevemos também em doentes com DM2 e sem doença coronária angiográfica a existência de disfunção da microcirculação coronária. Durante o stress vasodilatador, observámos e documentámos neste grupo de doentes, a existência de defeitos de perfusão transitórios ou de diminuição da velocidade da microcirculação coronária. No grupo de doentes com doença coronária confirmámos o interesse da avaliação da reserva coronária após intervenção percutânea na definição de prognóstico pós EAM, em termos de recuperação funcional do ventrículo esquerdo. Em doentes com BCRE e de difícil estratificação de risco, foi possível calcular o valor de reserva coronária e estratificar o risco de doença coronária. Num modelo experimental animal demonstrámos a exequibilidade da técnica de ECM, e verificámos que nessas condições experimentais, uma sobrecarga aterogénica na dieta, ao fim de 6 semanas, comprometia severamente a reserva coronária. Estes resultados foram parcialmente reversíveis quando à dieta foi adicionada uma estatina. Estas técnicas pela sua não invasibilidade, fácil acesso, repetibilidade e inocuidade perspectivam-se de grande utilidade na caracterização de doentes com disfunção da microcirculação coronária, nas diferentes áreas de diagnóstico, terapêutica e prevenção. A possibilidade de adaptar a técnica em modelos experimentais animais também nos parece poder vir a ter grande utilidade em investigação.----------------ABSTRACT: This work is intended to be a contribution to the study of coronary microcirculation applying new echocardiographic techniques as transthoracic Doppler echocardiography of coronary arteries and myocardial contrast echocardiography. Coronary flow reserve may be assessed by transthoracic Doppler echocardiography, and important functional microcirculation parameters as microcirculation flow velocity, myocardial blood volume and myocardial flow reserve may be evaluated through myocardial contrast echocardiography. Microcirculation was analysed in different pathophysiological settings. We addressed situations with increased left ventricular mass as systemic arterial hypertension, aortic stenosis and hypertrophic cardiomyopathy. Also coronary microcirculation was studied in type 2 Diabetes and in different clinical forms of atherosclerotic coronary artery disease. Specific and detailed conclusions were withdrawn from each experimental work. In the overall it was concluded that these two techniques were important tools to easily assess specific pathophysiological information about coronary microcirculation at bed side which would be difficult to get through other techniques. When compared with gold standard techniques, similar sensibility and specificity was found. Because of their better temporal and spatial resolution it was possible to analyse the importance of transmural perfusion gradients, both in basal and during vasodilatation, and their relation to ischemia, and mechanical wall kinetics, as wall thickening and motion. Coronary microcirculation dysfunction was found in systemic arterial hypertension early evolution stages, also related to different left ventricular geometric patterns. Different etiopathogenical explanations for aortic stenosis coronary microcirculation dysfunction were analysed and compared after aortic valve replacement. Transmural myocardial perfusion heterogeneity pattern was observed in hypertrophic cardiomyopathy which was aggravated during adenosine challenge. Coronary microcirculation dysfunction was diagnosed in type 2 diabetes both with coronary artery disease and with normal angiographic coronary arteries. Dynamic transitory subendocardial perfusion defects with adenosine vasodilatation were visualized in these patients.In patients with left branch block, transthoracic Doppler echocardiography was able to suggest a coronary reserve cut-off value for risk stratification. Also it was possible with this technique to calculate coronary flow reserve and predict restenosis after PTCA Again, in an experimental animal model, applying myocardial contrast echocardiography technique it was possible to study the consequences of an atherogenic diet and statins action on the coronary microcirculation function. Because these techniques are easily performed at bed side, are harmless, use no ionizing radiation and because of their repeatability, reproducibility and accuracythey are promissory tools to assess coronary microcirculation. Both in clinic and research areas these techniques will probably have a role in clinical diagnosis, prevention and therapeutically decision.

The cellular basis of a congenital heart defect Drosophila

RESUMO: Mutações em genes envolvidos na formação do coração e anomalias em qualquer etapa deste processo causam frequentemente malformações cardíacas, que representam o tipo mais comum de defeitos em neonatais, afetando cerca de 1% dos nascimentos por ano. Assim, estima-se que 20 milhões de pessoas sejam portadoras de um defeito cardíaco congénito. O coração da Drosophila melanogaster (mosca-da-fruta), denominado vaso dorsal, é um órgão relativamente simples que actua como uma bomba muscular, contraindo automaticamente para permitir a circulação da hemolinfa através do corpo. A formação do vaso dorsal na mosca é muito semelhante ao desenvolvimento do coração em vertebrados, representando por isso, um poderoso modelo para estudar a rede de genes e os padrões regulatórios relacionados com o desenvolvimento deste órgão. Anteriormente, nós identificámos um gene em Drosophila, darhgef10, fortemente expresso no coração em desenvolvimento e cuja deleção induz anormalidades cardíacas subtis mas prevalentes. Os mutantes para darhgef10 são viáveis e férteis no ambiente controlado de laboratório. Este trabalho teve como objectivos caracterizar fenotipicamente os mutantes nulos para darhgef10, determinar a localização subcelular da proteína dArhgef10 e investigar a base celular subjacente ao defeito no alinhamento dos cardioblastos observado nos mutantes. Os nossos resultados revelaram que a deleção de darhgef10 provoca uma severa redução da viabilidade, sem no entanto comprometer o tempo de desenvolvimento e a longevidade. Por outro lado, o aumento da expressão de darhgef10 em músculos, glândulas salivares e no disco imaginal do olho afeta drasticamente a integridade destes tecidos. A expressão ectópica de darhgef10 in vitro e in vivo revelou que a proteína está localiza no citoplasma com enriquecimento junto à membrana celular, com associação à actina F. Live imaging de embriões mutantes para darhgef10 revelou que os defeitos observados no coração podem estar associados a um defeito na adesão dos músculos alary e/ou das células pericardiais ao vaso dorsal. O homólogo humano de darhgef10, ARHGEF10, também é expresso no coração e está associação a uma maior susceptibilidade para a ocorrência de acidentes vasculares cerebrais aterotrombóticos, sugerindo que o que aprendemos sobre darhgef10 em Drosophila pode ter implicações do ponto de vista clínico para a saúde humana. ----------------------------- ABSTRACT: Mutations in genes controlling heart development and abnormalities in any of its steps frequently cause cardiac malformations, the most common type of birth defects in humans, affecting nearly 1% of births per year. Hence around 20 million adults are expected to live with a congenital heart defect. The Drosophila melanogaster heart, called dorsal vessel, is a relatively simple organ that acts as a muscular pump contracting automatically to allow the circulation of hemolymph. Drosophila heart formation shares many similarities with heart development in vertebrates providing a powerful system to study gene networks and regulatory pathways involved in heart development. We have previously identified a Drosophila gene, darhgef10, which is strongly expressed in the developing heart and when deleted, leads to flies with highly prevalent yet subtle heart abnormalities, compatible with unchallenged life in the laboratory. Our aims were to phenotypically characterize homozygous null darhgef10 mutants, characterize the subcellular localization of dArhgef10 and to study the cellular basis of the misaligned cardioblasts defect. We found that about half of darhgef10 mutants die during development. However, the survivors surprisingly have a nearly normal developmental time, adult locomotor behavior and total lifespan. Detection of transgene-derived dArhgef10 protein in vitro and in vivo using custom antibodies revealed a cytosolic protein slightly enriched in the cellular membranes and associated with F-actin. Tissue-specific darhgef10 expression disrupts the normal morphology of developing muscles, salivary glands and the eye. Live imaging of darhgef10 mutant embryos revealed that heart defect could be caused by a reduced capacity of attachment of pericardial cells and/or alary muscle to dorsal vessel. The human homolog of darhgef10 is also expressed in the heart and is a susceptibility gene for atherothrombotic stroke, suggesting that what we learn about the function of this gene and its phenotypes in Drosophila could have implications to human health.

Primary cilia and the regulation of hedgehog signaling: link to cardiac development

RESUMO: As células eucarióticas evoluíram um sistema de sinalização complexo que lhes permite responder aos sinais extracelulares e intracelulares. Desta forma, as vias de sinalização são essenciais para a sobrevivência da célula e do organismo, uma vez que regulam processos fundamentais, tais como o desenvolvimento, o crescimento, a imunidade, e a homeostase dos tecidos. A via de transdução de sinal Hedgehog (Hh) envolve o receptor Patched1 (Ptch1), que tem um efeito inibidor sobre a proteína Smoothened (Smo) na ausência dos seus ligandos, as proteínas Sonic hedgehog (Shh). Estas proteínas são reguladores fundamentais do desenvolvimento embrionário, como ilustrado pelas malformações drásticas observadas em embriões humanos e de murganho com perturbações da transdução de sinal da via Hh e que incluem polidactilia, defeitos craniofaciais e malformações ósseas. Igualmente importantes são as consequências da ativação inapropriada da via de sinalização Hh na formação de tumores. Curiosamente, os componentes desta via localizam-se nos cílios primários. Além disso, demonstrou-se que esta localização é crucial para a sinalização através da via Hh. Na presença dos ligandos, Ptch1 é internalizado e destinado a degradação ou sequestrado num compartimento da célula de onde não pode desempenhar o seu papel inibitório. A proteína Arl13b é uma pequena GTPase pertencente à família Arf/Arl da superfamília Ras de pequenas GTPases e foi implicada no síndrome de Joubert, uma ciliopatia caracterizada por ataxia congénita cerebelar, hipotonia, atrso mental e cardiopatia congénita. Murganhos deficientes para Arl13b, chamado hennin (hnn) morrem morrem prematuramente ao dia 13,5 de gestação (E13,5) e exibem anomalias morfológicas nos cílios que levam à interrupção da sinalização Hh. Além disso, a Arl13b está diretamente envolvida na regulação da via Hh, controlando a localização de vários componentes desta via nos cílios primários. Neste trabalho, mostramos que a Arl13b se localiza em circular dorsal ruffles (CDRs), que são estruturas de actina envolvidas em macropinocitose e internalização de recetores, e que regula a sua formação. Além disso, aprofundámos o conhecimento do processo de ativação da via de sinalização Hh, mostrando que as CDRs sequestram seletivamente e internalizam o recetor Ptch1. As CDRs formam-se minutos após ativação da via por ligandos Shh ou pelo agonista de Smo SAG e continuam a ser formadas a partir daí, sugerindo uma indução contínua da reorganização do citoesqueleto de actina quando a via está ativada. Observámos ainda que a inibição da formação de CDRs através do silenciamento de WAVE1, uma proteína necessária para a formação destas estruturas, resulta na diminuição da ativação da via de sinalização Hh. Além disso, o bloqueio da macropinocitose, que se segue ao fecho das CDRs, através do silenciamento de uma proteína necessária para a cisão de macropinossomas, nomeadamente a proteína BARS, tem um efeito semelhante. Estes resultados sugerem que as CDRs e a macropinocitose são necessárias para a ativação da via de sinalização Hh e indicam que esta via de internalização controla os níveis de sinal Hh. Durante o desenvolvimento, as células proliferativas dependem do cílio primário para a transdução de várias vias de sinalização. A via Hh induz a diferenciação do músculo cardíaco. Por conseguinte, os murganhos deficientes na via de sinalização Hh exibem uma variedade de defeitos de lateralidade, incluindo alteração do looping do coração, como pode ser visto em murganhos deficientes para Arl13b. Por conseguinte, investigámos o papel da Arl13b no desenvolvimento do coração. Mostramos que a Arl13b é altamente expressa no coração de embriões de murganho e de murganhos adultos ao nível do mRNA e da proteína. Além disso, o perfil de distribuição da Arl13b no coração segue o dos cílios primários, que são essenciais para o desenvolvimento cardíaco. Corações de murganhos hnn no estadio E12,5 mostram um canal átrio-ventricular aberto, espessamento da camada compacta ventricular e aumento do índice mitótico no ventrículo esquerdo. Além disso, um atraso de 1 a 2 dias no desenvolvimento é observado em corações de murganhos hnn, quando comparados com controlos selvagens no estadio E13,5. Assim, estes resultados sugerem que a Arl13b é necessária para o desenvolvimento embrionário do coração e que defeitos cardíacos podem contribuir para a letalidade embrionária de murganhos hnn. Em suma, foi estabelecido um novo mecanismo para a regulação dos níveis de superfície do recetor Ptch1, que envolve a remodelação do citoesqueleto de actina e a formação de CDRs após a ativação da via de sinalização Hh. Este mecanismo permite um feedback negativo que evita a repressão excessiva da via através da remoção de Ptch1 da superfície da célula. Além disso, determinou-se que uma mutação de perda de função na Arl13b causa defeitos cardíacos durante o desenvolvimento, possivelmente relacionados com a associação dos defeitos em cílios primários e na sinalização Hh, existentes em murganhos deficientes para Arl13b. A via de sinalização Hh tem tido um papel central entre as vias de sinalização, uma vez que a sua regulação é crucial para o funcionamento apropriada da célula. Assim, a descoberta de um novo mecanismo de tráfego através de macropinocitose e CDRs que controla a ativação e repressão da via de sinalização Hh traz novas perspetivas de como esta via pode ser regulada e pode ainda conduzir à identificação de novos alvos e estratégias terapêuticas. --------------------ABSTRACT: Eukaryotic cells have evolved a complex signaling system that allows them to respond to extracellular and intracellular cues. Signaling pathways are essential for cell and organism survival, since they regulate fundamental processes such as development, growth, immunity, and tissue homeostasis. The Hedgehog (Hh) pathway of signal transduction involves the receptor Patched1 (Ptch1), which has an inhibitory effect on Smoothened (Smo) in the absence of its ligands, the Sonic hedgehog (Shh) proteins. These proteins are fundamental regulators of embryonic development, as illustrated by the dramatic malformations seen in human and mouse embryos with perturbed Hh signal transduction that include polydactyly, craniofacial defects and skeletal malformations. Equally important are the consequences of inappropriate activation of the Hh signaling response in tumor formation. Interestingly, the components of this pathway localize to primary cilia. Moreover, it has been shown that this localization is crucial for Hh signaling. However, in the presence of the ligands, Ptch1 is internalized and destined for degradation or sequestered in a cell compartment where it no longer can play its inhibitory role. ADP-ribosylation factor-like (Arl) 13b, a small GTPase belonging to Arf/Arl family of the Ras superfamily of small GTPases has been implicated in Joubert syndrome, a ciliopathy characterized by congenital cerebellar ataxia, hypotonia, intellectual disability and congenital heart disease. Arl13b-deficient mice, called hennin (hnn) die at embryonic day 13.5 (E13.5) and display morphological abnormalities in primary cilia that lead to the disruption of Hh signaling. Furthermore, Arl13b is directly involved in the regulation of Hh signaling by controlling the localization of several components of this pathway to primary cilia. Here, we show that Arl13b localizes to and regulates the formation of circular dorsal rufles (CDRs), which are actin-basedstructures known to be involved in macropinocytosis and receptor internalization. Additionally, we extended the knowledge of the Hh signaling activation process by showing that CDRs selectively sequester and internalize Ptch1 receptors. CDRs are formed minutes after Hh activation by Shh ligands or the Smo agonist SAG and keep being formed thereafter, suggesting a continuous induction of actin reorganization when the pathway is switched on. Importantly, we observed that disruption of CDRs by silencing WAVE1, a protein required for CDR formation, results in down-regulation of Hh signaling activation. Moreover, the blockade of macropinocytosis, which follows CDR closure, through silencing of a protein necessary for the fission of macropinosomes, namely BARS has a similar effect. These results suggest that CDRs and macropinocytosis are necessary for activation of Hh signaling and indicate that this pathway of internalization controls Hh signal levels. During development, proliferating cells rely on the primary cilium for the transduction of several signaling pathways. Hh induces the differentiation of cardiac muscle. Accordingly, Hh-deficient mice display a variety of laterality defects, including alteration of heart looping, as seen in Arl13b-deficient mice. Therefore, we investigated the role of Arl13b in heart development. We show that Arl13b is highly expressed in the heart of both embryonic and adult mice at mRNA and protein levels. Also, Arl13b localization profile mimics that of primary cilia, which have been shown to be essential to early heart development. E12.5 hnn hearts show an open atrioventricular channel, increased thickening of the ventricular compact layer and increased mitotic index in the left ventricle. Moreover, a delay of 1 to 2 days in development is observed in hnn hearts, when compared to wild-type controls at E13.5. Hence, these results suggest that Arl13b is necessary for embryonic heart development and that cardiac defects might contribute to the embryonic lethality of hnn mice. Altogether, we established a novel mechanism for the regulation of Ptch1 surface levels, involving cytoskeleton remodeling and CDR formation upon Hh signaling activation. This mechanism allows a negative feedback loop that prevents excessive repression of the pathway by removing Ptch1 from the cell surface. Additionally, we determined that the Arl13b loss-offunction mutation causes cardiac defects during development, possibly related to the associated ciliary and Hh signaling defects found in Arl13b-deficient mice. Hh signaling has taken a center stage among the signaling pathways since its regulation is crucial for the appropriate output and function of the cell. Hence, the finding of a novel trafficking mechanism through CDRs and macropinocytosis that controls Hh signaling activation and repression brings new insights to how this pathway can be regulated and can lead to the discovery of novel therapeutic targets and strategies.

Agenesis of the posterior arch of the atlas

PURPOSE: To illustrate the radiological findings and review the current literature concerning a rare congenital abnormality of the posterior arch of the atlas. CASE REPORT: An adult female without neurological symptoms presented with an absent posterior arch of the atlas, examined with plain films and helical computerized tomography. Complete agenesis of the posterior arch of the atlas is a rare entity that can be easily identified by means of plain films. Although it is generally asymptomatic, atlantoaxial instability and neurological deficits may occur because of structural instability. Computerized tomography provides a means of assessing the extent of this abnormality and can help evaluate the integrity of neural structures. Although considered to be rare entities, defects of the posterior arch of the atlas may be discovered as incidental asymptomatic findings in routine cervical radiographs. Familiarity with this abnormality may aid medical professionals in the correct management of these cases.

Quantitative analysis of collagen and elastic fibers in the transversalis fascia in direct and indirect inguinal hernia

PURPOSE: Our previous studies demonstrated structural and quantitative age-related changes of the elastic fibers in transversalis fascia, which may play a role in inguinal hernia formation. To verify whether there were differences in the extracellular matrix between direct and indirect inguinal hernia, we studied the amount of collagen and elastic fibers in the transversalis fascia of 36 male patients with indirect inguinal hernia and 21 with direct inguinal hernia. MATERIAL AND METHODS: Transversalis fascia fragments were obtained during surgical intervention and underwent histological quantitative analysis of collagen by colorimetry and analysis of elastic fibers by histomorphometry. RESULTS: We demonstrated significantly lower amounts of collagen and higher amounts of elastic fibers in transversalis fascia from patients with direct inguinal hernia compared to indirect inguinal hernia patients. The transversalis fascia from direct inguinal hernia patients showed structural changes of the mature and elaunin elastic fibers, which are responsible for elasticity, and lower density of oxytalan elastic fibers, which are responsible for resistance. These changes promoted loss of resiliency of the transversalis fascia. CONCLUSION: These results improve our understanding of the participation of the extracellular matrix in the genesis of direct inguinal hernia, suggesting a relationship with genetic defects of the elastic fiber and collagen synthesis.

The effect of intravenous zoledronic acid on glucocorticoid-induced multiple vertebral fractures in juvenile systemic lupus erythematosus

Glucocorticoids are widely used in the treatment of lupus patients, and adverse effects, which include osteoporosis and associated fractures, are frequent. Treatment of osteoporosis of young patients should be effective and not harmful to bone growth and remodeling. Bisphosphonates are drugs that decrease the incidence of bone fractures, but their use in juvenile patients is still controversial because of their possible side effects on the growing skeleton. However, recently published studies showed that linear growth continued normally after treatment with these drugs, and there was no excessive suppression of bone remodeling or mineralization defects. Zoledronic acid is a new intravenous bisphosphonate that has been approved by the US FDA for use with hypercalcemia of malignancies and might be an effective treatment for postmenopausal osteoporosis. The authors report a case of a young girl with systemic lupus who developed multiple vertebral collapses due to glucocorticoid therapy, and zoledronic acid was used producing significant clinical and densitometric improvement.

Estudo da vascularização dos nervos periféricos e da sua influência na regeneração nervosa : estudo experimental e no cadáver humano

RESUMO: Na clínica, a recuperação funcional que se segue a uma lesão nervosa raramente é atingida na sua totalidade. A reinervação, quer motora, quer sensitiva, ocorre geralmente com maior ou menor deficit. Interessa, então, identificar os factores que podem interferir na regeneração nervosa. O neurónio é a unidade anatómica fundamental do sistema nervoso periférico e é muito vulnerável à isquemia pela grande distância que existe entre o corpo neuronal e a extensão do axónio, que pode ser de apenas alguns milímetros ou até atingir um metro. É, por isso, fundamental o estudo da vascularização do nervo periférico e da sua influência na regeneração nervosa. O resultado deste estudo pode levar ao desenvolvimento de técnicas cirúrgicas que criem as condições que garantam, por sua vez, a revascularização precoce do nervo periférico em caso de lesão, ou mesmo em caso de doenças, nas quais a vascularização do nervo está alterada como, por exemplo, na neuropatia diabética. O estudo da vascularização do nervo periférico realizou-se através da investigação da vascularização do nervo mediano do cadáver humano, pela investigação da vascularização do nervo isquiático do rato Wistar e do Plexo Braquial (PB) do mesmo. A vascularização do PB do rato não é muito diferente daquela que é reportada na espécie humana, existindo uma homologia entre o rato e o Homem no que diz respeito à morfologia e à vascularização do PB. Através da comparação angiomorfológica entre o nervo isquiático do rato e o nervo mediano humano, concluíu-se que a microvascularização do nervo isquiático do rato e do mediano humano são muito semelhantes, o que suporta a utilização do rato como modelo experimental de lesões do nervo mediano humano. Para a avaliação da influência da vascularização na regeneração nervosa foi feita a análise da eficácia de enxerto de tubo de membrana amniótica humana imunologicamente inerte, de enxerto de veia jugular externa autóloga e de auto-enxerto de nervo, na reparação de um defeito de 10 milímetros no nervo isquiático do rato, na presença de um fornecimento vascular axial, comparando-se com os mesmos procedimentos em estudos realizados anteriormente, sem suprimento vascular. Os ratos foram avaliados funcionalmente através do estudo das pegadas, da electroneurografia e da força de flexão ao nível do tornozelo, e estruturalmente, através das avaliações histológicas e morfométricas, da taxa de recuperação do peso dos músculos gastrocnémio e solhear e da marcação axonal retrógrada com True Blue às 4, 8 e 12 semanas. Os nervos reconstruídos apresentaram uma arquitectura normal, incluindo a arquitectura vascular. A membrana amniótica foi bem tolerada, persistindo imunologicamente em torno do nervo até à 12.ª semana. Concluiu-se também que, na presença de um suprimento vascular axial local, a membrana amniótica humana e as veias autólogas são, pelo menos, tão eficazes como os auto-enxertos nervosos na reconstrução de defeitos nervosos de 10 milímetros.--------------------------------------ABSTRACT: At the clinic, the functional recovery that follows a nerve lesion is rarely achieved in full. The neuron is very vulnerable to ischemia that’s why it is essential to study the vascularization of the peripheral nerve and its influence on the nerve’s regeneration. The outcome of this study may lead to the development of surgical techniques that create the conditions which are necessary to ensure an early revascularization in case of a peripheral nerve injury. This study investigated the vascularization of the median nerve of the human cadaver and the vascularization of the sciatic nerve of the Wistar rat and his Brachial Plexus (BP) through animal experimentation. The mouse's BP vascularization is not so different from the one that is reported in the human species. An angiomorphological comparison between the mouse sciatic nerve and the human median nerve concluded that the microvascularizations are very similar, which supports the use of the mouse as an experimental model for the study of median nerve’s lesions. To evaluate the influence of vascularization in the nerve’s regeneration, it was made an assessment of the effectiveness of the human amniotic immuno-inert membrane grafts, of the autologous external jugular vein grafts and of the nerve auto-graft in the repair of a defect of 10 mm on the sciatic nerve of the rat, in the presence of an axial vascular supply, comparing these with the same procedures that were adopted in the previous studies, without vascular supply. The rats were functionally assessed and structurally evaluated (through histological and morphometric evaluations) at the 4.th, 8.th and 12.th weeks. The nerves reconstructed presented a normal architecture, including vascular architecture. The amniotic membrane was well-tolerated immunologically, persisting around the nerve until the 12.th week. As a result, it was also concluded that in the presence of a local axial vascular supply, the human amniotic membrane and the autologous veins are, at least, as effective as the nerve auto-grafts in the reconstruction of the nerve’s defects of 10 mm.

The role of arl13b in cilia length regulation and in zebrafish development

RESUMO: Arl13b é uma importante proteína ciliar, presente em cílios primários e cílios móveis. Ratinhos mutantes para Arl13b têm comprimento dos cílios reduzido e defeitos nos B-túbulos dos cílios. Como consequência destes fenótipos, deficiências na Arl13b originam, em modelos animais, várias doenças congénitas, incluindo problemas no estabelecimento do eixo esquerda-direita, malformações cerebrais e deformações corporais. Nos seres humanos, deficiências na Arl13b levam a uma doença crónica congénita chamada Síndrome de Joubert. Por outro lado, a sobreexpressão de Arl13b origina cílios mais longos, no entanto existe uma ausência da caracterização dos fenótipos celulares e durante o desenvolvimento embrionário. Neste trabalho, quisemos explorar o efeito da sobre-expressão de Arl13b em embriões de peixezebra. Descobrimos que, ao nível ciliar, a sobre-expressão de Arl13b nas células aumenta o comprimento ciliar em cílios primários e móveis, no entanto, a esses cílios falta adequada acetilação da alfa-tubulina no citoesqueleto feito por microtúbulos. Os nossos resultados mostraram que esse efeito é específico de Arl13b sobre-expressão e quando se manipularam as enzimas responsáveis pela acetilação (Mec17) e pela de-acetilação (HDAC6) encontrámos uma sinergia potencial com ambas. Testámos ainda, que o aumento no comprimento ciliar não estava causalmente relacionado com a falta de acetilação, ou seja, os cílios com menos acetilação não eram necessariamente os mais longos. Também mostrámos que a sobre-expressão de Arl13b é capaz de restaurar o comprimento dos cílios em mutantes com cílios curtos e como isso pode ser explorado para um futuro potencial papel terapêutico para Arl13b. Em seguida, foi avaliado o impacto do aumento da quantidade de Arl13b no desenvolvimento embrionário do peixe-zebra. Observou-se que a sobre-expressão de Arl13b apresentava fenótipos muito fracos, quando comparados com a perda de função dos mutantes de Arl13b. Focados no inesperado fenótipo leve no estabelecimento do eixo esquerda-direita abordámos a questão através do estabelecimento de uma colaboração com matemáticos, descobrimos que os cílios mais longos que potencialmente têm a capacidade de movimentar mais fluido são atenuados por amplitudes de batimento menores, e, como resultado, estes longos cílios não prejudicam o movimento do fluido e consequentemente não afetam o estabelecimento dos padrões de esquerda-direita. Sugerimos assim que a Arl13b é um regulador chave, do comprimento ciliar. Descobrimos uma nova interação com as enzimas de acetilação/de-acetilação e levantamos novas hipóteses quanto aos mecanismos moleculares da função da Arl13b. Propomos um novo modelo para o mecanismo molecular da Arl13b na regulação do comprimento dos cílios onde podemos integrar os nossos resultados com os relatados na literatura. Este trabalho adiciona mais conhecimento para o mecanismo de ação da Arl13b e, portanto, fornece uma importante contribuição para o campo da investigação em cílios.---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- ABSTRACT: Arl13b is an important ciliary protein, present in primary and motile cilia. arl13b-/- mouse mutants have reduced cilia length and cilia B-tubule defects. As a consequence of these phenotypes, Arl13b loss of function animal models suffer from several congenital disorders including left-right problems, brain malformations and body deformations. In humans Arl13b depletion leads to a congenital chronic disease called Joubert Syndrome. On the other hand, overexpressing Arl13b leads to longer cilia but the characterization of the cellular and developmental phenotypes was missing. In this work we explore the effect of Arl13b overexpression in zebrafish embryos. We found that, at the ciliary level, Arl13b overexpression from 1 cell stage produces longer primary and motile cilia, but these cilia lack proper alpha tubulin acetylation of their microtubule cytoskeleton. Our results showed that this effect is specific from Arl13b overexpression and when we manipulated the enzymes responsible for acetylation, Mec17, and de-acetylation, HDAC6, we found a potential synergy of both mec17 knockdown and HDAC6 activity with Arl13b overexpression. We tested that the ciliary increase in length was not causally related to the lack of acetylation, meaning the more de-acetylated cilia were not necessarily the longer ones. We also showed that Arl13b overexpression is able to restore cilia length in short cilia mutants and how that may be explored to a potential future therapeutic role for Arl13b. Next, we evaluated the impact of increasing the amount of Arl13b in zebrafish embryonic development. We observed that Arl13b overexpression presented very mild phenotypes when compared to the loss of function mutants. We focused on the unexpected left-right mild phenotype and by establishing a mathematical modeling collaboration, we found out that the longer cilia generated force was attenuated by smaller beating amplitudes, and as a result, these long cilia were not impairing the cilia generated flow and the establishment of left-right patterning. We suggest that Arl13b is one key cilia length regulator. We disclosed a novel interaction with the acetylation / de-acetylation enzymes and raised new hypothesis as to the mechanisms of Arl13b function. We propose a new model for the Arl13b molecular mechanism of cilia length regulation where we integrate our findings with those reported in the literature. This work adds more knowledge to the Arl13b mechanism of action and therefore provides an important contribution to the cilia research field.

Implementation of a lean six sigma project in a production line

Companies from the motorcycles components branch are dealing with a dynamic environment, resulting from the introduction of new products and the increase of market demand. This dynamic environment requires frequent changes in production lines and requires flexibility in the processes, which can cause reductions in the level of quality and productivity. This paper presents a Lean Six Sigma improvement project performed in a production line of the company's machining sector, in order to eliminate losses that cause low productivity, affecting the fulfillment of the production plan and customer satisfaction. The use of Lean methodology following the DMAIC stages allowed analyzing the factors that influence the line productivity loss. The major problems and causes that contribute to a reduction on productivity and that were identified in this study are the lack of standardization in the setup activities and the excessive stoppages for adjustment of the processes that caused an increase of defects. Control charts, Pareto analysis and cause-and-effect diagrams were used to analyze the problem. On the improvement stage, the changes were based on the reconfiguration of the line layout as well as the modernization of the process. Overall, the project justified an investment in new equipment, the defective product units were reduced by 84% and an increase of 29% of line capacity was noticed.

Structure-property relationships in polymer nanocomposites

Tese de Doutoramento em Ciência e Engenharia de Polímeros e Compósitos

Effect of annealing temperature on photoluminescence and resistive switching characteristics of ZnO/Al2O3 multilayer nanostructures

This work demonstrates the role of defects generated during rapid thermal annealing of pulsed laser deposited ZnO/Al2O3 multilayer nanostructures in presence of vacuum at different temperatures (Ta) (500–900 C) on their electrical conductance and optical characteristics. Photoluminescence (PL) emissions show the stronger green emission at Ta 600 C and violet–blue emission at TaP800 C, and are attributed to oxygen vacancies and zinc related defects (zinc vacancies and interstitials) respectively. Current–voltage (I–V) characteristics of nanostructures with rich oxygen vacancies and zinc related defects display the electroforming free resistive switching (RS) characteristics. Nanostructures with rich oxygen vacancies exhibit conventional and stable RS behavior with high and low resistance states (HRS/LRS) ratio 104 during the retention test. Besides, the dominant conduction mechanism of HRS and LRS is explained by trap-controlled-space-charge limited conduction mechanism, where the oxygen vacancies act as traps. On the other hand, nanostructures with rich zinc related defects show a diode-like RS behavior. The rectifying ratio is found to be sensitive on the zinc interstitials concentration. It is assumed that the rectifying behavior is due to the electrically formed interface layer ZnAl2O4 at the Zn defects rich ZnO crystals – Al2O3 x interface and the switching behavior is attributed to the electron trapping/de-trapping process at zinc vacancies.

Melhoria de desempenho da área de pintura numa empresa de mobiliário

Dissertação de mestrado integrado em Engenharia e Gestão Industrial

Quality costs analysis: case study in the automotive industry

Dissertação de mestrado integrado em Engenharia e Gestão Industrial

Implementação de procedimentos de autocontrolo numa empresa de produção de carroçarias

Dissertação de mestrado integrado em Engenharia e Gestão Industrial

Redução de contaminações: um projeto de melhoria contínua em ambiente seis sigma

Dissertação de mestrado integrado em Engenharia e Gestão Industrial