Humoral response towards high density lipoprotein : a new mechanism for atherogenesis

RESUMO:Aterosclerose é uma das principais causas de morbilidade e mortalidade no mundo ocidental. É responsável, direta ou indiretamente, pela maior percentagem de gastos com a saúde na maioria dos países europeus. A “teoria lipídica” da aterosclerose, que se baseia na dislipidemia como causa primária para a doença vascular tem algumas implicações práticas importantes: permite a definição de linhas de orientação e protocolos simples e ainda estabelece alvos terapêuticos que podem ser atingidos na maior parte dos casos com a atual intervenção farmacológica. A associação da aterosclerose com o sistema imunológico (a “teoria imunológica”), forneceu por sua vez novas formas de explorar os mecanismos envolvidos e abriu novas perspetivas para um conhecimento mais completo da doença. No entanto, levanta dificuldades evidentes no que diz respeito às possibilidades terapêuticas. De todos os intervenientes no processo aterosclerótico (bioquímicos, imunológicos e anatómicos), as lipoproteínas de elevada densidade (HDL) são atualmente reconhecidas como um dos fatores mais importantes na aterogénese. Isto é baseado no reconhecimento das múltiplas propriedades anti-aterogénicas das HDL como por exemplo: a anti-oxidante, a anti-inflamatória e a antitrombótica, bem como o seu importante papel na melhoraria da função endotelial. Atualmente, é consensual que as funções anti-aterogénicas das HDL vão além do seu papel no transporte reverso do colesterol (RCT) e a importância das HDL no processo aterosclerótico baseia-se não apenas no seu papel protetor impedindo a formação da placa de ateroma, mas também na estabilização destas, prevenindo a sua ruptura e, consequentemente o evento trombótico. Como fundamentais no processo aterosclerótico estão reconhecidos dois principais conjuntos de eventos: um caracterizado por alterações no metabolismo das lipoproteínas que resultam em lipoproteínas pró-inflamatórias e pró-oxidantes que interagem com os componentes celulares da parede arterial e que conduzem à formação da placa de ateroma; o outro evento é a resposta imunológica desencadeada contra um novo conjunto de antigénios que por sua vez leva à produção de citoquinas pró-inflamatórias. Dada a complexidade da HDL e das suas múltiplas funções estas lipoproteínas tornaram-se um potencial alvo para a resposta auto-imune, e cujas consequências podem explicar algumas das associações identificados em estudos clínicos e epidemiológicos. Contudo esta interação entre o sistema imunológico e HDL nunca foi exaustivamente estudada. Portanto, pomos a hipótese de que em condições oxidativas e pró-inflamatórias, um aumento do antigénio (HDL) conduz a um consequente acréscimo na produção de anticorpos anti-HDL (aHDL) responsáveis pela alteração quantitativa e / ou qualitativa das HDL. O conceito de que estes anticorpos podem contribuir tanto para a evolução a longo prazo do processo aterosclerótico, como para o desencadeamento de eventos clínicos pode também explicar a heterogeneidade encontrada em cada doente e nos grandes estudos clínicos, no que diz respeito aos fatores de risco e outcomes clínicos. Para além disso, a confirmação desta hipótese pode permitir explicar porque é que as intervenções terapêuticas atualmente em desenvolvimento para aumentar os níveis de HDL, não conseguem mostrar a tão esperada redução do risco vascular. O objetivo geral desta tese foi identificar e caracterizar a resposta humoral contra os componentes da HDL, e avaliar possíveis mecanismos que possam contribuir para a modificação das propriedades anti-aterogénicas das HDL. Para alcançar este objetivo investigou-se: 1) A presença de anticorpos aHDL em doentes com lúpus eritematoso sistémico (SLE) e em doentes com manifestações clínicas de aterosclerose, como os doentes com doença arterial coronária (CAD), acidente vascular cerebral isquémico (IS) e diabetes tipo 2; 2) Os principais alvos antigénicos dentro do complexo das HDL e a associação entre os títulos de anticorpos aHDL e diferentes características clínicas destas doenças; 3) As modificações das funções normais associadas às HDL, em particular da função anti-oxidante e anti-inflamatória; 4) A atividade biológica dos anticorpos aHDL isolados do soro de doentes através de um conjunto de experiências in vitro de inibição da atividade da paraoxonase 1 (PON1) e da expressão de moléculas de adesão em culturas de células endoteliais. Para tal foi necessário estabelecer um método de isolamento dos anticorpos. Os anticorpos aHDL isolados do soro de doentes foram utilizados de forma a identificar as potenciais alterações dos sistemas celulares utilizados; 5) O efeito de fármacos usados no tratamento das dislipidemias, em particular o ácido nicotínico e as estatinas, na variação dos títulos de anticorpos aHDL através de ensaios clínicos randomizados, controlados com placebo e em dupla ocultação. Os métodos utilizados neste trabalho incluíram: técnicas imunológicas (como por exemplo, enzyme-linked immunoabsorbent assay - ELISA, ensaio imunoturbidimetrico e cromatografia de imuno-afinidade) técnicas bioquímicas (tais como a quantificação de atividade enzimática por espectrofotometria e por luminescência), experiências com cultura de células e citometria de fluxo. Os nossos resultados mostram que: 1) A presença de anticorpos aHDL, e mais especificamente anticorpos contra alguns do seus principais componentes como a apolipoproteína A-I (ApoA-I, principal apolipoproteína presente nas HDL) e a PON1 (o enzima que mais contribui para a propriedade anti-oxidante das HDL), quer em doentes com doenças auto-imunes, como o SLE, quer em doentes com manifestações clínicas de aterosclerose, como CAD, IS e diabetes tipo 2. Os doentes apresentaram títulos de anticorpos IgG aHDL, aApoA-I e aPON1 significativamente mais elevados do que controlos saudáveis com a mesma idade e sexo. 2) A correlação positiva estatisticamente significativa entre os títulos de aHDL e aApoA-I e aPON1 sugere que estes sejam dois dos principais alvos antigénicos dentro do complexo das HDL. Os anticorpos encontrados nestes doentes estão associados com a diminuição da atividade da PON1 e a uma redução da capacidade anti-oxidante total (TAC) do soro, um aumento dos biomarcadores de disfunção endotelial (como por exemplo dos metabolitos do óxido nítrico - NO2- e NO3-, as moléculas de adesão vascular e intracelular - VCAM-1 e ICAM-1 e os níveis de 3-nitrotirosina). Nos doentes com SLE os títulos destes estão associados a um aumento do dano cardiovascular e à atividade global da doença avaliados pelas escalas SLICC/ACR DI e BILAG score, respetivamente. Enquanto que nos doentes com diabetes tipo 2 estes anticorpos estão associados com um aumento dos níveis de glicemia em jejum (FGP) e hemoglobina glicada (HbA1c). 3) Após se ter estabelecido um método de isolamento dos anticorpos que permite isolar quantidades significativas de anticorpos do soro de doentes sem perder a sua especificidade, foi identificada a capacidade dos anticorpos isolados do soro de doentes inibirem de uma forma dependente da concentração a atividade da PON1 até um máximo de 70% no caso dos doentes com SLE e ente 7-52% no caso dos anticorpos isolados de doentes com CAD e IS. 4) O efeito anti-inflamatório das HDL na inibição da produção de VCAM-1 induzida por citoquinas (como o TNF-) foi revertido em mais de 80% pelos anticorpos aHDL isolados do soro de doentes. 5) A angiogenesis induzida por HDL através do aumento do fator de crescimento do endotélio vascular (VEGF) foi anulada em 65% pelos anticorpos aHDL isolados do soro de doentes. 6) Os atuais agentes farmacológicos disponíveis para aumentar as concentrações de HDL-C estão associados a um aumento dos títulos de anticorpos.-------- ABSTRACTAtherosclerosis is the major cause of morbidity and mortality in the western world. It is also responsible, directly or indirectly, for the highest percentage of health costs in most European countries. Despite the use of new technologies for the diagnosis of vascular disease and regardless of the major advances in treatment, the atherosclerosis-related clinical burden is still raising. The “lipid theory” of atherogenesis, which identifies dyslipidemia as the primary cause of this vascular disease has some important practical implications: it allows the definition of simple guidelines and establishes therapeutic targets which can be generally met with current pharmacologic intervention. The association between atherosclerosis an the immune system (the immune concept) has in turn provided new ways of exploring the mechanisms involved in this condition and has opened new perspectives in the understanding of the disease. However, it raises obvious difficulties when it comes to treatment options. Of all the players (biochemical, immunological and anatomical) involved in this matter, high-density lipoproteins (HDL) are currently recognised as one of the most important factors in atherogenesis. This is based on the recognition of HDL's multiple anti-atherogenic properties: anti-oxidant, anti-inflammatory and antithrombotic, as well as its capacity to improve endothelial function. Nowadays, it is widely recognized that the anti-atherogenic functions of HDL go beyond reverse cholesterol transport (RCT), and the importance of HDL is based not just on its ability to reduce atheroma formation but also on its ability to stabilise plaques, therefore preventing their rupture and ultimately thrombosis. Two main set of events have been recognised as fundamental in atherogenesis: one, characterized by lipoprotein metabolism alterations, resulting in pro-inflammatory and pro-oxidative lipoproteins, which interact with the normal cellular elements of the arterial wall leading to atheroma formation; the other, the immune cellular response towards new sets of antigens which lead to the production of pro-inflammatory cytokines. Given to HDL complexity and multiple functions this lipoprotein has became a potential target for an auto-immune response, the consequences of which may explain some of the association identified in epidemiological and clinical studies, though the interaction between the immune system and HDL has never been thoroughly addressed. Therefore, we hypothesized that under oxidative and pro-inflammatory conditions, the increase in the antigen (HDL) would lead to a consequent increase in the production of anti-HDL (aHDL) antibodies be responsible for quantitative and/or qualitative changes of HDL. The concept that these antibodies may contribute either to the long-term evolution of atherosclerosis or to the triggering of clinical events may also explain the heterogeneity found in individual patients and in large cohorts regarding risk factors and clinical outcomes. Moreover this may be a major breakthrough in understanding why therapeutic interventions that increase HDL levels, failed to show the anticipated reduction in vascular risk. The overall aims of this thesis were to identified and characterize the humoral response towards HDL components and to evaluate the possible mechanisms that may contribute to the modifications of the anti-atherogenic properties of HDL. To achieve this objective we investigated: 1) the presence of aHDL antibodies in patients with systemic lupus erythematosus (SLE) and in patients with atherosclerosis-related clinical events, such as coronary artery disease (CAD), ischemic stroke (IS) and type 2 diabetes; 2) the association between the titres of aHDL antibodies and different clinical features of these diseases; 3) the modifications of the anti-atherogenic properties of HDL; 4) the biologic effect of aHDL antibodies isolated from serum of patients on the anti-oxidant and anti-inflammatory properties of HDL; 5) the effect of different pharmacologic treatments for dyslipidemia on the prevalence and activity of aHDL antibodies. The methodologies used in this work included immunologic-related techniques (e.g. enzyme-linked immunoabsorbent assay – ELISA, immunoturbidimetric immunoassay and immunoaffinity chromatography), biochemical techniques (enzymatic assays with quantification by spectrophotometry and luminescence methods), cell culture experiments and flow cytometry. Our results indicate that: 1) The titres of IgG aHDL, anti-apolipoprotein A-I (aApoA-I) and anti-paraoxonase 1 (aPON1) antibodies were higher in patients with SLE, CAD, IS and type 2 diabetes when compared with age and sex matched healthy controls. 2) The antibodies found in these patients were associated with decreased PON1 activity, (the enzyme responsible for most of the anti-oxidant effect of HDL), reduced total anti-oxidant capacity (TAC) of serum and increased biomarkers of endothelial dysfunction (nitric oxide metabolites, adhesion molecules, nitrotyrosine). In patients with SLE the antibody titres were associated with an increase in disease-related cardiovascular damage and activity whereas in patients with type 2 diabetes they were directly related with the fasting glucose plasma (FGP) levels and the glycosylated haemoglobin (HbA1c). 3) The antibodies isolated from serum of our patients, directly inhibited HDL-associated PON1 activity in a dose dependent way ranging from 7 to 52%. 4) The anti-inflammatory effect of HDL, measured by the percentage of inhibition of the cytokine-induced production of vascular adhesion molecules (VCAM-1), was reduced in more than 80% by aHDL antibodies isolated from our patients. 5) The HDL-induced angiogenesis by increasing vascular endothelial growth factor (VEGF) levels was abrogated in 65% by the antibodies isolated from serum of patients. 6) The current available pharmacologic agents for increasing HDL-C concentrations were associated with an increase in the titres of IgG aApoA-I antibodies. This increase was higher in the extended release niacin when compared to statins probably due to their dampening effect on oxidative stress. In conclusion, aHDL antibodies are present in different pathologic conditions. aHDL antibodies represent a family of self-reacting immunoglobulins, of which ApoA-I and PON1 might be the most relevant targets. These antibodies are biologically active, interfering with the HDL anti-oxidant and anti-inflammatory properties and, consequently, with the atherosclerotic process. The pathogenic potential of these antibodies may lead to the identification of a new biomarker for vascular disease, whilst presenting itself as a novel target for a different treatment approach which may redefine the treatment strategies and clinical trials design for HDL interventions in the future.

Digestão anaeróbia de resíduos agroalimentares: reutilização das frações líquidas e sólidas (state-of-art)

Dissertação para obtenção do Grau de Mestre em Energia e Bioenergia

Mimesis e Alteridade na obra de Jean Painlevé

Dissertação de mestrado para obtenção do grau de mestre em Ciências da Comunicação, Arte e Comunicação.

Descrição e Preservação em Fotografia: Um estudo de caso sobre a Colecção «Família Silveira e Lorena»

Dissertação apresentada para cumprimento dos requisitos necessários à obtenção do grau de Mestre em Ciências da Informação e da Documentação

Sociabilidade das especies arboreas arbustivas da caatinga em Petrolina-PE.

O presente trabalho teve por objetivo determinar o grau de afinidade entre espécies arbóreas arbustivas da Caatinga, inventariadas numa área de preservação permanente na Embrapa Semiárido.

Preparação e caracterização de filmes poliméricos inteligentes incorporando grafenos para aplicações biomédicas

O objectivo deste trabalho foi combinar o comportamento magnético de micropartículas de óxido de grafeno (GO) modificado com Fe3O4 (GO - 0%, 0.05%, 0.1% e 0.2%) com as propriedades do polímero álcool polivinílico (PVA), nomeadamente a sua elasticidade, de forma a obter-se materiais poliméricos com capacidade de reversão das suas características estruturais, topográficas e consequentemente controlar as suas características de transporte por ajuste de campo magnético. Preparou-se e caracterizou-se filmes/membranas poliméricas de PVA com GO na presença e ausência de campo magnético. Caracterizou-se a morfologia destas membranas, através de microscopia óptica e de varrimento electrónico; o efeito na superfície de membranas por incorporação de GO através de ângulos de contacto, a avaliação da estabilidade estrutural e química através de estudos de inchamento e degradação, adsorção de proteínas e o impacto da presença de GO e o seu comportamento magnético na permeabilidade a gases. As membranas apresentaram boa afinidade com o GO, e um bom alinhamento das micropartículas quando expostas a campo. A estabilidade estrutural foi avaliada durante um período de imersão de 28 dias, usando uma solução de PBS a 0.01M, a pH 6.9 e a 37ºC. A análise dos espectros de UV-Vis obtidos para solução de imersão ao longo do tempo não revelaram degradação das membranas. O efeito na rugosidade da superfície das membranas por incorporação de GOs obteve-se através de ensaios de ângulos de contacto de glicerol. Verificou-se um aumento destes com o aumento de %GO; uma diminuição dos ângulos quando as membranas humidificadas foram expostas a um campo magnético de intensidade 0.0832T; e um aumento destes nas membranas expostas a humidade e temperatura controlada, a 50% e 17ºC. Foi observado o efeito do conteúdo magnético existente nas membranas alinhadas e não-alinhadas, com diferentes %GO, no desempenho da adsorção de BSA, submetidas a campo. Verificou-se um aumento de adsorção na membrana com menor %GO, devido provavelmente ao aumento da sua rugosidade; e a diminuição de adsorção com o aumento de intensidade de campo. Nos ensaios de permeabilidade, observou-se que a membrana de PVA (0% GO) é mais permeável ao CO2 do que ao O2. As membranas com GOs (0.05% e 0.1%) apresentam uma maior permeabilidade ao O2 do que ao CO2, devendo-se isto a uma provável alteração topográfica das membranas por incorporação das micropartículas já referidas.

Espectroscopia in situ no estudo cinético da adsorção de produtos farmacêuticos poluentes em carvões activados

A utilização dos carvões activados na remoção compostos poluentes dos efluentes urbanos tem demonstrado ser um processo cada vez mais económico e eficaz, sendo por isso muito utilizado no sector de tratamento e purificação de águas de abastecimento. O principal objectivo desta dissertação foi aplicar espectroscopia UV-Vis in situ no processo de adsorção em fase líquida de PPCP’s, nomeadamente cafeína e paracetamol. Nesta nova abordagem de medição e procedimento experimental, tiveram de se ter em conta vários factores e estudar o seu efeito durante o processo de adsorção. Um destes factores é a presença do carvão durante a medição da absorvância em espectroscopia. Deste modo, foram realizadas medições ao longo do tempo em soluções de carvão activado para determinar qual a sua interferência na medição e os motivos de tal comportamento. Verificou-se também que a forma, a quantidade e a agitação do carvão também influenciam os resultados de espectroscopia. Aplicando este novo método de medição, foi necessário adaptar a lei de Lambert-Beer para calcular os valores de concentração das espécies em solução, eliminando o erro na medição, provocado pela presença do carvão. Deste modo, o método de decomposição espectral foi aplicado e verificou-se que apenas as concentrações de carvão calculadas não correspondem aos valores reais em solução, apenas a sua variação demostra a evolução da interferência do adsorvente na medição dos valores de absorvância. No estudo cinético de adsorção dos solutos foi usado um carvão comercial tanto em pó como em formato granular. Durante o processo de adsorção em carvão granular verificou-se que a velocidade de adsorção foi menor, provavelmente devido à maior dificuldade de acesso aos poros, provocada pela complexidade da estrutura. Contudo, registou-se sempre uma remoção completa do soluto neste carvão, uma vez que a quantidade mínima possível nestes ensaios de carvão NOG é de 2,5mg, sendo uma quantidade relativamente superior à necessária para remover o soluto completamente da solução. Num pequeno estudo de adsorção de cafeína em carvões de diferentes origens confirmou-se que a eficiência de remoção do soluto é proporcional ao volume total de poros e deduz-se que a sua velocidade de adsorção está relacionada com a presença de mesoporosidade. Comparando a eficiência de remoção e a velocidade de adsorção dos dois solutos pelo mesmo carvão, observou-se que a adsorção da cafeína é mais rápida. Apesar dos valores de solubilidade e de volume molecular não justificarem de imediato este resultado, a cafeína tem maior afinidade com o carvão comercial, sugerindo a existência de propriedades químicas e texturais do carvão que levam a estes resultados. Por último, efectuou-se um estudo de adsorção de misturas para verificar a hipótese de adsorção competitiva entre os solutos. Após a realização dos ensaios verificou-se que não existe competição significativa entre a cafeína e o paracetamol.

Bionanoconjugados catalíticos de tirosinase e nanopartículas de ouro

O presente estudo teve como principal objetivo a preparação de bionanoconjugados de Tirosinase e nanopartículas de ouro (AuNPs) com a finalidade de observar alterações positivas da atividade enzimática relativamente à enzima livre em solução, a partir da determinação dos respetivos parâmetros cinéticos. A atividade específica da tirosinase foi determinada com tirosina, L-3,4-dihidroxifenilalanina (L-DOPA) e 4-metilcatecol, tendo este último sido escolhido como substrato a utilizar no decorrer do restante trabalho experimental devido ao maior número de unidades específicas determinado para este substrato, bem como devido à menor concentração de enzima necessária para a realização dos ensaios. Os ensaios cinéticos com variação da temperatura e pH permitiram concluir que a 30 oC e a pH 6,5 a tirosinase é mais ativa. Os bionanoconjugados foram preparados incubando tirosinase de um dia para o outro com AuNPs. Três diferentes agentes de revestimento foram usados nos estudos: AuNPs sintetizadas revestidas por citrato, funcionalizadas com ácido 11-mercaptoundecanóico (MUA) e funcionalizadas com pentapéptido CALNN. Diferentes razões molares de tirosinase : AuNPs foram estudadas e, apesar da baixa reprodutibilidade dos resultados, os mais consistentes foram obtidos para a razão molar de 120. A conjugação da tirosinase com AuNPs aumentou a afinidade para o substrato e também a eficiência catalítica, em todos os bionanoconjugados, sendo que os melhores resultados foram observados para AuNPs funcionalizadas com CALNN, aumentando cerca de 48% a eficiência catalítica relativamente à tirosinase na sua forma livre em solução. As AuNPs funcionalizadas com citrato apresentaram maior consistência de resultados relativamente ao aumento da velocidade inicial da reacção. A modelação computacional da tirosinase a pH 6,5 revelou que a carga superficial da enzima é maioritariamente negativa, dificultando a adsorção na superfície das AuNPs, podendo esta ocorrer em regiões de maior carga positiva localizadas na subunidade L ou englobando regiões da subunidade H.

Filtragem de nuvens de pontos para geração de modelos digitais do terreno

As cartas topográficas são representações planas, generalizadas e reduzidas à escala, de zonas da superfície terrestre, contendo símbolos e informação textual para a descrição dos objectos. A forma mais comum de as produzir é por intermédio de fotografias aéreas, principalmente pela afinidade entre o conteúdo destas e aquilo que se convencionou representar na carta. O Instituto Geográfico do Exército (IGeoE) é uma entidade produtora de cartografia que provê, com informação geográfica, as Forças Armadas e a comunidade civil. A caracterização do relevo é parte da informação existente na carta, concretizada através das curvas de nível: linhas curvas que representam uma cota pré-definida (convencionado de 10 em 10 m nas cartas à escala 1/25 000), constante em toda a sua extensão. Estas acompanham as formas do terreno e indicam a altitude do nível do solo, independentemente de se cruzarem com outros objectos à superfície terrestre (como edifícios ou arvoredo). A informação do relevo é bastante completa, abrangendo a área de toda a carta. As curvas de nível são, por norma, restituídas, manualmente, por um operador numa estação fotogramétrica, numa tarefa compreensivelmente morosa. Uma das alternativas para a representação do relevo é por intermédio da correlação automática de fotografias aéreas, daí resultando uma nuvem de pontos cotados numa grelha regular, cada um com uma coordenada tridimensional. Alguns desses pontos contêm “ruído”, visto representarem não a cota ao nível do solo, mas a cota de objectos sobre a superfície terrestre. O processo de eliminação desse “ruído”, que permite corrigir a cota do topo do objecto para o solo, designa-se por filtragem. Há diversos processos de filtragem de nuvens de pontos, embora nenhum consiga obter resultados totalmente satisfatórios, apresentando mais ou menos dificuldades em algumas zonas de terreno específicas (zonas urbanizadas ou vegetação baixa, por exemplo). Um dos caminhos apontados para auxiliar a filtragem é a utilização de outros recursos que forneçam mais informação, para além da simples coordenada tridimensional do ponto a corrigir, bem como uma mistura de algoritmos, tentando conciliar os pontos fortes de cada uma destas abordagens. O presente trabalho desenvolveu uma metodologia automática para representar o relevo a partir de uma nuvem de pontos cotados, para ser integrada na cadeia de produção do IGeoE. A partir de uma nuvem de pontos primária, e utilizando como dados de entrada ortofotos e informação vectorial dos objectos da edição anterior e da edição de trabalho da carta (excepto relevo) da mesma região, efectua quatro filtragens: filtragem de edifícios, filtragem de áreas de arvoredo superiores a 150 m x 150 m, filtragem de áreas de arvoredo inferiores a 150 m x 150 m e árvores isoladas (envolvendo a detecção de árvores em ortofotos, ao nível do pixel, por algoritmo de aprendizagem automática), e filtragem por declives.

Remoção em fase líquida do fármaco Diclofenac por adsorção em biocarvão

Grande parte dos resíduos de biomassa gerados na indústria agro-alimentar encontram-se subvalorizados. Como tal, é fundamental desenvolver processos capazes de converter esses resíduos em produtos de valor acrescentado. Por outro lado, os compostos farmacêuticos são considerados contaminantes emergentes das águas residuais e com efeitos nocivos para a saúde humana e dos animais. Tendo em conta este enquadramento, resíduos industriais de processamento de batata, foram convertidos em biocarvão activado e utilizados como adsorventes do fármaco Diclofenac, em fase líquida. Os resíduos de biomassa, maioritariamente casca de batata, foram submetidos a caracterização química e a análise termogravimétrica. O biocarvão foi obtido por activação química dos resíduos de biomassa com K2CO3 a 700ºC durante 1 hora, em atmosfera de azoto. Seguidamente foi submetido a caracterização textural e química. O biocarvão (CRB) foi aplicado à remoção de diclofenac sódico (DCF), em fase aquosa, e o seu desempenho foi comparado com o de um carvão activado comercial (GAC). Ambos os carvões, apresentaram-se como materiais microporosos, mas o CRB revelou possuir uma extensa rede macroporosa que se reflectiu numa cinética de adsorção do DCF significativamente mais rápida que a do GAC. Concluiu-se que a cinética de adsorção do DCF com o biocarvão obedecia a um modelo de pseudo 2ªordem e a cinética do GAC se ajustava a um modelo de pseudo 1ª ordem. Apesar do GAC apresentar uma capacidade superior de adsorção no equilíbrio, a sua constante cinética foi inferior à do CRB. No estudo das isotérmicas de adsorção, observou-se que ambos os carvões seguiam o modelo de Langmuir. Apesar da maior capacidade de adsorção do carvão comercial, a constante de Langmuir para o carvão CRB apresentou-se acentuadamente superior, revelando maior afinidade do DCF com este carvão. Para além disso, a cinética superior do CRB representa uma vantagem para processos em que este parâmetro seja determinante.

A organização molecular do Celulossoma: caracterização estrutural da proteína CipA e estudo da diversidade das interações coesina-doquerina

A celulose, principal componente da parede celular vegetal e o composto orgânico mais abundante da biosfera, possui inúmeras aplicações biotecnológicas. O microrganismo anaeróbio Clostridium thermocellum (C.thermocellum) tem sido alvo de grande interesse pela sua capacidade em degradar eficientemente a celulose e outros componentes da parede celular vegetal, por meio de um complexo multi-enzimático altamente eficiente, denominado de celulossoma. A montagem deste complexo ocorre através de uma proteína multi-modular denominada CipA. Esta proteína estrutural possui módulos não catalíticos (coesinas tipo I) que se ligam a módulos complementares (doquerinas tipo I) presentes nas enzimas celulolíticas modulares. A CipA possui ainda um módulo doquerina de tipo II que permite a ancoragem deste complexo multi-enzimático à parede celular da bactéria. Na presente dissertação foram utilizadas as metodologias de Cristalografia de Raios-X, para caracterizar a interação coesina-doquerina a nível atómico e molecular, e de Microarrays, com o intuito de estudar as possíveis especifidades e afinidades dessas interações. Com base na primeira técnica foram elucidadas as estruturas do módulo coesina C4 da CipA em complexo com a doquerina da enzima modular Xyn10B e do módulo coesina C9 isolado. As estruturas foram comparadas com o complexo do módulo coesina C2-doquerina Xyn10B já publicado. Esta análise encontra-se descrita no capítulo 3. Por último, a técnica de Microarrays, associada à eletroforese em gel de poliacrilamida em condições nativas, permitiu a caracterização das diferenças de afinidade e especificidade entre os vários pares coesina-doquerina dos celulossomas de C. thermocellum e de Rumminococcus flavefaciens (R. flavefaciens). As especificidades e afinidades dos módulos doquerina, dos celulossomas mencionados anteriormente estão descritas no capítulo 4.

Torrefação de biomassa de Arundo donax L. e de Phoenix canariensis com vista à sua valorização energética ou material

A torrefação é vista como um pré-tratamento térmico que introduz modificações na biomassa, ou em resíduos de biomassa, que facilitam o seu processamento mecânico e aumentam a sua estabilidade e densidade energética, potenciando, assim, uma valorização posterior. Neste trabalho, estudou-se o impacte da torrefação na gama de 200 a 350 ºC e tempos de residência entre 15 e 90 min nas propriedades da biomassa proveniente da herbácea Arundo donax L. e das palmeiras Phoenix canariensis, espécies muito abundantes em vários locais do país, tendo em vista a sua posterior valorização. A proliferação descontrolada do arundo e a praga do escaravelho das palmeiras leva a que estas espécies sejam alvo de frequentes operações de remoção. A sua estrutura altamente fibrosa dificulta e encarece estas operações, que acarretam custos significativos para as câmaras municipais, e não se conhecem medidas para a sua valorização material ou energética. A torrefação foi também aplicada a peletes de resíduos de pinheiro, na gama de 200 a 250 ºC e com tempos de residência de 30 e 60 min, para averiguar o seu impacte na qualidade desse biocombustível sólido. A torrefação permitiu obter peletes mais resistentes à biodegradação, devido à redução do teor de humidade para valores residuais, sem aumentar significativamente o seu teor de cinzas e sem afetar de forma relevante a sua durabilidade, o teor de finos ou a densidade aparente. Com a biomassa de arundo e de palmeira obtiveram-se produtos com maior poder calorífico e com melhor moabilidade. No entanto, a acentuada diminuição dos rendimentos mássico e energético e o elevado teor de cinzas constrangem a sua utilização como biocombustíveis sólidos. Desta forma, optou-se por testar a sua valorização como adsorventes do corante azul de metileno, bastante comum, por exemplo, na indústria têxtil, nos curtumes ou nas industrias do papel. Os estudos de adsorção revelaram maior afinidade pelo corante por parte da biomassa sujeita a torrefação mais ligeira, com eficiências de remoção muito próximas das do carvão ativado comercial, para concentrações iniciais de corante até 200 mg/L. As isotérmicas foram melhor ajustadas ao modelo de Langmuir, que revelou capacidades máximas de adsorção na monocamada entre 59,92 e 92,68 mg/g, tendo as curvas de cinética sido melhor descritas pelo modelo de pseudo-segunda ordem. A adsorção é bastante rápida nos primeiros minutos, essencialmente devido a atrações eletrostáticas, sendo inicialmente controlada pela difusão no filme e depois pela difusão nos poros. Os adsorventes revelaram seletividade por um corante catiónico e permitiram dessorção de corante, ao contrário do verificado com o carvão ativado comercial, o que é um aspeto da maior relevância tendo em mente a regeneração do adsorvente e a recuperação do corante.

Elucidating the role of glycans in leucocyte function

RESUMO: O processo de glicosilação é a modificação pós-traducional de proteínas mais comum e está envolvido em vários processos fisiológicos e patológicos. Especificamente, certos perfis glicosídeos estão correlacionados a estados específicos de diferenciação celular, e podem modular vários eventos celulares, como sinalização celular, migração celular e interações hospedeiro-patogénio. Assim sendo, a glicosilação desempenha um papel crucial na modulação de vários processos imunológicos. No entanto, permanece por esclarecer como as estruturas glicosídicas influenciam a imunidade. Especificamente, algumas estruturas glicosídicas terminais que estão modificadas pela ligação de ácido siálico desempenham um papel importante em várias funções do sistema imune, nomeadamente migração leucocitária em contexto de inflamação e ativação de células imunes. Como tal, este trabalho teve como objectivo investigar como a expressão de certos glicanos influencia componentes importantes da resposta imune inata e adaptativa. Este trabalho está dividido em três componentes principais: 1) A imunidade está amplamente dependente da habilidade das células circulantes migrarem para os tecidos inflamados, sendo que a ligação de leucócitos à Eselectina endotelial é o primeiro passo. Assim, nós analisámos a estrutura e função dos ligandos de E-selectina que são expressos pelas células humanas mononucleares de sangue periférico (PBMCs), fornecendo novos conhecimentos para a compreensão dos intervenientes moleculares que mediam a ligação dos monócitos, células CD4+ e CD8+T e células B ao endotélio vascular. Surpreendentemente, os monócitos apresentaram maior capacidade de ligação à E-selectina comparativamente aos linfócitos. Esta observação pode ser explicada pelo facto de os monócitos humanos expressarem, uniformemente, um vasto reportório de glicoproteínas que exibem afinidade de ligação à E-selectina, nomeadamente: as glicoformas do CD43 (CD43E) e do CD44 (HCELL), em adição à já previamente reportada glicoforma da PSGL-1 (CLA). Consistentemente, a diferente capacidade que as diversas populações linfocitárias apresentam de se ligar à E-selectina, está integralmente relacionada com a sua expressão de glicoproteínas com afinidade de ligação à E-selectina. Enquanto que as células CD4+T apresentam uma elevada reatividade à E-selectina, as células CD8+T e B demonstram pouca ou nenhuma capacidade de ligação à E-selectina. Esta atividade de ligação à E-selectina das células CD4+T é conferida pela expressão de HCELL, em adição às já previamente reportadas CLA e CD43E. As células CD8+ T não expressam HCELL e apenas expressam pequenas quantidades de CLA e CD43E, enquanto que as células B não expressam ligandos de Eselectina. Mais, a exofucosilação da superfície destas células, levou ao dramático aumento da expressão dos ligandos de E-selectina em todos as populações leucocitárias, verificando-se que a criação de certos ligandos de E-selectina está dependente do tipo de célula, após fucosilação. Colectivamente, estes resultados redefinem o nosso conhecimento acerca dos mecanismos moleculares que governam o tráfico das células mononucleares de sangue periférico em contexto de inflamação. 2) A habilidade das células dendríticas (DCs) para extravasarem em locais de inflamação é crucial para o sucesso da terapia com DCs. Assim, analisámos a estrutura e função das moléculas de adesão que mediam a migração transendotelial (TEM) das DCs. Para isso, foram usadas DCs geradas a partir da diferenciação de monócitos (mo-DCS), obtidos quer pelo métodos de separação imuno-magnética de células CD14+ (CD14-S) ou por isolamento por aderência ao plástico (PA-S). Os resultados obtidos indicam que as glicoformas de ligação à Eselectina de PSGL-1, CD43 e CD44 são expressas pelas CD14-S mo-DCs, enquanto que as PA-S mo-DCs expressam apenas CLA. É importante notar que a ligação do CD44 nas mo-DCs, mas não nas PA-S mo-DCs, desencadeia a ativação e consequente adesão da VLA-4 ao endotélio na ausência de um gradiente de quimiocinas. Procedeu-se também à análise dos ligandos E-selectina expressos em mo-DCs geradas a partir de monócitos do sangue do cordão umbilical (UCB) e, inesperadamente, as UCB mo-DCs não expressam qualquer glicoproteína com reatividade à E-selectina. Além disso, a exofucosilação das mo- DCs humanas utilizando uma α(1,3)-fucosiltransferase aumenta significativamente a expressão de HCELL e, portanto, estas células apresentam uma capacidade aumentada para se ligarem à E-selectina em condições de fluxo hemodinâmico. Estes resultados destacam o papel do HCELL no desencadeamento do TEM das CD14-S mo-DCs e sugerem que estratégias para potenciar a expressão de HCELL poderão impulsionar o recrutamento de mo-DCs para locais de inflamação. 3) Outro obstáculo para alcançar o sucesso promissor de vacinas baseadas em DCs é o estabelecimento de abordagens eficientes que poderão melhorar o estado de maturação e apresentação antigénica das DCs. Por conseguinte, foram investigadas abordagens alternativas que podem superar este obstáculo. Através da remoção de ácido siálico de superfície celular das DCs, conseguiu-se induzir a maturação de DC humanas e de ratinhos. Notavelmente, tanto as DCs humanas como as de ratinho, ao serem desialiladas mostraram uma capacidade aumentada para induzir a proliferação de células T, para secretar citocinas Th1 e para induzir a morte específica de células tumorais. Em adição, as DCs desialiladas apresentam uma maior capacidade de apresentação cruzada de antigénios tumorais às células T citotóxicas. Colectivamente, o presente estudo oferece uma visão chave para optimizar a capacidade das DCs em induzir respostas imunitárias anti-tumorais, e indica que o tratamento com sialidase é uma nova tecnologia para melhorar a eficácia e aplicabilidade das vacinas baseadas em DCs. Coletivamente, os nossos resultados demostram como a glicosilação e a sua manipulação podem modular a imunidade. Concretamente, através de uma reação de exofucosilação conseguimos aumentar fortemente a capacidade de os leucócitos extravasarem para os tecidos afectados, enquanto que a remoção dos níveis de ácido siálico da superfície celular das DCs, induz potentes respostas anti-tumorais mediadas por células T citotóxicas. ------------------------------------ ABSTRACT: Glycosylation is the most widely form of protein post-translational modification and is involved in many physiological and pathological processes. Specifically, certain patterns of glycosylation are associated with determined stages of cell differentiation and can modulate processes like cell-signaling and migration and host-pathogen interactions. As such, glycosylation plays a crucial role in the modulation of several immune events. However, how glycans execute this immune-modulation and, therefore, influence immunity is still poorly unknown. Specifically, some terminal sialic acid-modified determinants are known to be involved in several physiological immune processes, including leukocyte trafficking into sites of inflammation and cell immune activation. Therefore, in this work, we sought to investigate more deeply how the expression of these glycosidic structures affects events form both innate and adaptive immune responses. To this end, we divided our work into three main parts: 1) Immunity critically depends on the ability of sentinel circulating cells to infiltrate injured sites, of which leukocyte binding to endothelial E-selectin is the critical first step. Thus, we first analyzed the structure and function of the E-selectin ligands expressed on native human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs), providing novel insights into the molecular effectors governing adhesion of circulating monocytes, and of circulating CD4+T, CD8+T and B cells, to vascular endothelium under hemodynamic shear conditions. Strikingly, monocytes show a higher ability to tether and roll on endothelial cells than lymphocyte subsets. This is due to the fact that human circulating monocytes uniformly display a wide repertoire of E-selectin binding glycoproteins, namely the E-selectin-binding glycoforms of CD43 (CD43E) and CD44 (HCELL), in addition to the previously described E-selectin-binding glycoform of PSGL-1 (CLA). In addition, we also observed a differential ability of the different lymphocyte subsets to bind to Eselectin under hemodynamic shear stress conditions, and these differences were highly correlated with their individual expression of E-selectin binding glycoproteins. While CD4+T cells show a robust E-selectin binding ability, CD8+T and B cells show little to no E-selectin reactivity. CD4+T cell potent Eselectin rolling activity is conferred by HCELL expression, in addition to the previously reported E-selectin-binding glycoproteins CD43E and CLA. CD8+T cells display no HCELL and low amounts of CLA and CD43E, whereas B cells lack E-selectin ligand expression. Moreover, enforced exofucosylation of cell surface of these cells noticeably increases expression of functional E-selectin ligands among all leukocytes subsets, with cell type-dependent specificity in the protein scaffolds that are modified. Taken together, these findings redefine our understanding of the molecular mechanisms governing the trafficking patterns of PBMCs that are relevant in the context of acute or chronic inflammatory conditions. 2) The ability of circulating dendritic cells (DCs) to extravasate at inflammatory sites is critical to the success of DC-based therapies. Therefore, we assessed the structure and function of adhesion molecules mediating the transendothelial migration (TEM) of human monocyte derived-DCs (mo-DCs), obtained either by CD14 positive immune-magnetic selection (CD14-S) or by plastic adherence of blood monocytes (PA-S). We report for the first time that the E-selectin binding glycoforms of PSGL-1, CD43 and CD44 are all expressed on CD14-S mo-DCs, in contrast to PA-S mo-DCs that express only CLA. Importantly, CD44 engagement on CD14-S mo-DCs, but not on PA-S mo-DCs, triggers VLA-4-dependent adhesiveness and programs TEM in absence of chemokine gradient. We also analyzed the E-selectin ligands expressed on mo-DCs generated from umbilical cord blood (UCB) monocytes, and unexpectedly, UCB mo-DCs do not express any glycoprotein with E-selectin reactivity. Furthermore, exoglycosylation of human mo-DCs using an α(1,3)-fucosyltransferase significantly increases expression of HCELL, and therefore exofucosylated mo-DCs exhibit an augmented ability to bind to E-selectin under hemodynamic shear stress conditions. These findings highlight a role for HCELL engagement in priming TEM of CD14-S mo-DCs, and suggest that strategies to enforce HCELL expression could boost mo-DC recruitment to inflammatory sites. 3) Another obstacle to achieve the promising success of DC-based vaccines is the establishment of efficient approaches that could successfully enhance maturation and cross-presentation ability of DCs. Therefore, we investigated an alternative approach that can overcome this problem. Through removal of sialic acid content from DC cell surface we are able to elicit maturation of both human and mouse DCs. Notably, desialylated human and murine DCs showed enhanced ability to induce autologous T cell to proliferate, to secrete Th1 cytokines and to kill tumor cells. Moreover, desialylated DCs display enhanced cross-presentation of tumor antigens to cytotoxic CD8+ T cells. Collectively, this study offers key insight to optimize the ability of DCs to boost anti-tumor immune responses, and indicates that the treatment with an exogenous sialidase is a powerful new technology to improve the efficacy and applicability of DC-based vaccines. Overall, our findings show how glycosylation and its manipulation can modulate immunity. Concretely, through an exofucosylation reaction we are able to greatly augment the ability of leukocytes to extravasate into injured tissues, while removal of sialic acid moieties from cell surface of DCs, significantly potentiate their ability to induce anti-tumor cytotoxic T cell-mediate responses.

Elucidating the role of glycans in leucocyte function

RESUMO:O processo de glicosilação é a modificação pós-traducional de proteínas mais comum e está envolvido em vários processos fisiológicos e patológicos. Especificamente, certos perfis glicosídeos estão correlacionados a estados específicos de diferenciação celular, e podem modular vários eventos celulares, como sinalização celular, migração celular e interações hospedeiro-patogénio. Assim sendo, a glicosilação desempenha um papel crucial na modulação de vários processos imunológicos. No entanto, permanece por esclarecer como as estruturas glicosídicas influenciam a imunidade. Especificamente, algumas estruturas glicosídicas terminais que estão modificadas pela ligação de ácido siálico desempenham um papel importante em várias funções do sistema imune, nomeadamente migração leucocitária em contexto de inflamação e ativação de células imunes. Como tal, este trabalho teve como objectivo investigar como a expressão de certos glicanos influencia componentes importantes da resposta imune inata e adaptativa. Este trabalho está dividido em três componentes principais: 1) A imunidade está amplamente dependente da habilidade das células circulantes migrarem para os tecidos inflamados, sendo que a ligação de leucócitos à Eselectina endotelial é o primeiro passo. Assim, nós analisámos a estrutura e função dos ligandos de E-selectina que são expressos pelas células humanas mononucleares de sangue periférico (PBMCs), fornecendo novos conhecimentos para a compreensão dos intervenientes moleculares que mediam a ligação dos monócitos, células CD4+ e CD8+T e células B ao endotélio vascular. Surpreendentemente, os monócitos apresentaram maior capacidade de ligação à E-selectina comparativamente aos linfócitos. Esta observação pode ser explicada pelo facto de os monócitos humanos expressarem, uniformemente, um vasto reportório de glicoproteínas que exibem afinidade de ligação à E-selectina, nomeadamente: as glicoformas do CD43 (CD43E) e do CD44 (HCELL), em adição à já previamente reportada glicoforma da PSGL-1 (CLA). Consistentemente, a diferente capacidade que as diversas populações linfocitárias apresentam de se ligar à E-selectina, está integralmente relacionada com a sua expressão de glicoproteínas com afinidade de ligação à E-selectina. Enquanto que as células CD4+T apresentam uma elevada reatividade à E-selectina, as células CD8+T e B demonstram pouca ou nenhuma capacidade de ligação à E-selectina. Esta atividade de ligação à E-selectina das células CD4+T é conferida pela expressão de HCELL, em adição às já previamente reportadas CLA e CD43E. As células CD8+ T não expressam HCELL e apenas expressam pequenas quantidades de CLA e CD43E, enquanto que as células B não expressam ligandos de Eselectina. Mais, a exofucosilação da superfície destas células, levou ao dramático aumento da expressão dos ligandos de E-selectina em todos as populações leucocitárias, verificando-se que a criação de certos ligandos de E-selectina está dependente do tipo de célula, após fucosilação. Colectivamente, estes resultados redefinem o nosso conhecimento acerca dos mecanismos moleculares que governam o tráfico das células mononucleares de sangue periférico em contexto de inflamação. 2) A habilidade das células dendríticas (DCs) para extravasarem em locais de inflamação é crucial para o sucesso da terapia com DCs. Assim, analisámos a estrutura e função das moléculas de adesão que mediam a migração transendotelial (TEM) das DCs. Para isso, foram usadas DCs geradas a partir da diferenciação de monócitos (mo-DCS), obtidos quer pelo métodos de separação imuno-magnética de células CD14+ (CD14-S) ou por isolamento por aderência ao plástico (PA-S). Os resultados obtidos indicam que as glicoformas de ligação à Eselectina de PSGL-1, CD43 e CD44 são expressas pelas CD14-S mo-DCs, enquanto que as PA-S mo-DCs expressam apenas CLA. É importante notar que a ligação do CD44 nas mo-DCs, mas não nas PA-S mo-DCs, desencadeia a ativação e consequente adesão da VLA-4 ao endotélio na ausência de um gradiente de quimiocinas. Procedeu-se também à análise dos ligandos E-selectina expressos em mo-DCs geradas a partir de monócitos do sangue do cordão umbilical (UCB) e, inesperadamente, as UCB mo-DCs não expressam qualquer glicoproteína com reatividade à E-selectina. Além disso, a exofucosilação das mo- DCs humanas utilizando uma α(1,3)-fucosiltransferase aumenta significativamente a expressão de HCELL e, portanto, estas células apresentam uma capacidade aumentada para se ligarem à E-selectina em condições de fluxo hemodinâmico. Estes resultados destacam o papel do HCELL no desencadeamento do TEM das CD14-S mo-DCs e sugerem que estratégias para potenciar a expressão de HCELL poderão impulsionar o recrutamento de mo-DCs para locais de inflamação. 3) Outro obstáculo para alcançar o sucesso promissor de vacinas baseadas em DCs é o estabelecimento de abordagens eficientes que poderão melhorar o estado de maturação e apresentação antigénica das DCs. Por conseguinte, foram investigadas abordagens alternativas que podem superar este obstáculo. Através da remoção de ácido siálico de superfície celular das DCs, conseguiu-se induzir a maturação de DC humanas e de ratinhos. Notavelmente, tanto as DCs humanas como as de ratinho, ao serem desialiladas mostraram uma capacidade aumentada para induzir a proliferação de células T, para secretar citocinas Th1 e para induzir a morte específica de células tumorais. Em adição, as DCs desialiladas apresentam uma maior capacidade de apresentação cruzada de antigénios tumorais às células T citotóxicas. Colectivamente, o presente estudo oferece uma visão chave para optimizar a capacidade das DCs em induzir respostas imunitárias anti-tumorais, e indica que o tratamento com sialidase é uma nova tecnologia para melhorar a eficácia e aplicabilidade das vacinas baseadas em DCs. Coletivamente, os nossos resultados demostram como a glicosilação e a sua manipulação podem modular a imunidade. Concretamente, através de uma reação de exofucosilação conseguimos aumentar fortemente a capacidade de os leucócitos extravasarem para os tecidos afectados, enquanto que a remoção dos níveis de ácido siálico da superfície celular das DCs, induz potentes respostas anti-tumorais mediadas por células T citotóxicas. ---------------------------- ABSTRACT: Glycosylation is the most widely form of protein post-translational modification and is involved in many physiological and pathological processes. Specifically, certain patterns of glycosylation are associated with determined stages of cell differentiation and can modulate processes like cell-signaling and migration and host-pathogen interactions. As such, glycosylation plays a crucial role in the modulation of several immune events. However, how glycans execute this immune-modulation and, therefore, influence immunity is still poorly unknown. Specifically, some terminal sialic acid-modified determinants are known to be involved in several physiological immune processes, including leukocyte trafficking into sites of inflammation and cell immune activation. Therefore, in this work, we sought to investigate more deeply how the expression of these glycosidic structures affects events form both innate and adaptive immune responses. To this end, we divided our work into three main parts: 1) Immunity critically depends on the ability of sentinel circulating cells to infiltrate injured sites, of which leukocyte binding to endothelial E-selectin is the critical first step. Thus, we first analyzed the structure and function of the E-selectin ligands expressed on native human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs), providing novel insights into the molecular effectors governing adhesion of circulating monocytes, and of circulating CD4+T, CD8+T and B cells, to vascular endothelium under hemodynamic shear conditions. Strikingly, monocytes show a higher ability to tether and roll on endothelial cells than lymphocyte subsets. This is due to the fact that human circulating monocytes uniformly display a wide repertoire of E-selectin binding glycoproteins, namely the E-selectin-binding glycoforms of CD43 (CD43E) and CD44 (HCELL), in addition to the previously described E-selectin-binding glycoform of PSGL-1 (CLA). In addition, we also observed a differential ability of the different lymphocyte subsets to bind to Eselectin under hemodynamic shear stress conditions, and these differences were highly correlated with their individual expression of E-selectin binding glycoproteins. While CD4+T cells show a robust E-selectin binding ability, CD8+T and B cells show little to no E-selectin reactivity. CD4+T cell potent Eselectin rolling activity is conferred by HCELL expression, in addition to the previously reported E-selectin-binding glycoproteins CD43E and CLA. CD8+T cells display no HCELL and low amounts of CLA and CD43E, whereas B cells lack E-selectin ligand expression. Moreover, enforced exofucosylation of cell surface of these cells noticeably increases expression of functional E-selectin ligands among all leukocytes subsets, with cell type-dependent specificity in the protein scaffolds that are modified. Taken together, these findings redefine our understanding of the molecular mechanisms governing the trafficking patterns of PBMCs that are relevant in the context of acute or chronic inflammatory conditions. 2) The ability of circulating dendritic cells (DCs) to extravasate at inflammatory sites is critical to the success of DC-based therapies. Therefore, we assessed the structure and function of adhesion molecules mediating the transendothelial migration (TEM) of human monocyte derived-DCs (mo-DCs), obtained either by CD14 positive immune-magnetic selection (CD14-S) or by plastic adherence of blood monocytes (PA-S). We report for the first time that the E-selectin binding glycoforms of PSGL-1, CD43 and CD44 are all expressed on CD14-S mo-DCs, in contrast to PA-S mo-DCs that express only CLA. Importantly, CD44 engagement on CD14-S mo-DCs, but not on PA-S mo-DCs, triggers VLA-4-dependent adhesiveness and programs TEM in absence of chemokine gradient. We also analyzed the E-selectin ligands expressed on mo-DCs generated from umbilical cord blood (UCB) monocytes, and unexpectedly, UCB mo-DCs do not express any glycoprotein with E-selectin reactivity. Furthermore, exoglycosylation of human mo-DCs using an α(1,3)-fucosyltransferase significantly increases expression of HCELL, and therefore exofucosylated mo-DCs exhibit an augmented ability to bind to E-selectin under hemodynamic shear stress conditions. These findings highlight a role for HCELL engagement in priming TEM of CD14-S mo-DCs, and suggest that strategies to enforce HCELL expression could boost mo-DC recruitment to inflammatory sites.3) Another obstacle to achieve the promising success of DC-based vaccines is the establishment of efficient approaches that could successfully enhance maturation and cross-presentation ability of DCs. Therefore, we investigated an alternative approach that can overcome this problem. Through removal of sialic acid content from DC cell surface we are able to elicit maturation of both human and mouse DCs. Notably, desialylated human and murine DCs showed enhanced ability to induce autologous T cell to proliferate, to secrete Th1 cytokines and to kill tumor cells. Moreover, desialylated DCs display enhanced cross-presentation of tumor antigens to cytotoxic CD8+ T cells. Collectively, this study offers key insight to optimize the ability of DCs to boost anti-tumor immune responses, and indicates that the treatment with an exogenous sialidase is a powerful new technology to improve the efficacy and applicability of DC-based vaccines. Overall, our findings show how glycosylation and its manipulation can modulate immunity. Concretely, through an exofucosylation reaction we are able to greatly augment the ability of leukocytes to extravasate into injured tissues, while removal of sialic acid moieties from cell surface of DCs, significantly potentiate their ability to induce anti-tumor cytotoxic T cell-mediate responses.

Fiscalização dos serviços de informações em Portugal

The present work offers a brief historical and evolutionary introduction to the legal basis of the Portuguese Republic Intelligence System (SIRP) which comprises two services – the Security Intelligence Service (SIS) and the Defence Strategic Intelligence Service (SIED) – and two entities responsible for its oversight – the Supervisory Body (CFSIRP) and the Data Monitoring Committee (CFD), also responsible for supervising the Military Intelligence and Security Centre (CISMIL) of the General Staff of the Armed Forces (EMGFA). The initial narrative subsequently leads us to a detailed analysis of the Portuguese Intelligence services' current model of monitoring, as well as of the legislator’s options, namely in the legal drafting field, used within the construction and definition of the legal structure that currently regulates the Portuguese Republic Intelligence System. For the purposes of this study we have broadly examined different models of the European Union, in particular those of Belgium, the Netherlands and Croatia. We have also transposed to the text the valuable contributions collected during the research phase, more precisely the replies to questionnaires and interviews conducted with certain individuals selected according to their knowledge and affinity with the subject of this study, including members and former members of the Supervisory Body and former directors of the three portuguese intelligence services. The present dissertation intends to contribute to the development of this subject, promoting critical analysis, within and beyond the academia, with the aim that some of its reflections might be useful towards the intelligence system’s future reform, particularly in what concerns intelligence services monitoring.