Stimulating Neoblast-Like Cell Proliferation in Juvenile Fasciola hepatica Supports Growth and Progression towards the Adult Phenotype In Vitro

Fascioliasis (or fasciolosis) is a socioeconomically important parasitic disease caused by liver flukes of the genus Fasciola. Flukicide resistance has exposed the need for new drugs and/or a vaccine for liver fluke control. A rapidly improving 'molecular toolbox' for liver fluke encompasses quality genomic/transcriptomic datasets and an RNA interference platform that facilitates functional genomics approaches to drug/vaccine target validation. The exploitation of these resources is undermined by the absence of effective culture/maintenance systems that would support in vitro studies on juvenile fluke development/biology. Here we report markedly improved in vitro maintenance methods for Fasciola hepatica that achieved 65% survival of juvenile fluke after 6 months in standard cell culture medium supplemented with 50% chicken serum. We discovered that this long-term maintenance was dependent upon fluke growth, which was supported by increased proliferation of cells resembling the "neoblast" stem cells described in other flatworms. Growth led to dramatic morphological changes in juveniles, including the development of the digestive tract, reproductive organs and the tegument, towards more adult-like forms. The inhibition of DNA synthesis prevented neoblast-like cell proliferation and inhibited growth/development. Supporting our assertion that we have triggered the development of juveniles towards adult-like fluke, mass spectrometric analyses showed that growing fluke have an excretory/secretory protein profile that is distinct from that of newly-excysted juveniles and more closely resembles that of ex vivo immature and adult fluke. Further, in vitro maintained fluke displayed a transition in their movement from the probing behaviour associated with migrating stage worms to a slower wave-like motility seen in adults. Our ability to stimulate neoblast-like cell proliferation and growth in F. hepatica underpins the first simple platform for their long-term in vitro study, complementing the recent expansion in liver fluke resources and facilitating in vitro target validation studies of the developmental biology of liver fluke.

Rôle des protéoglycanes à héparane sulfate dans le transfert de gène des cellules CHO et HEK293

La possibilité de programmer une cellule dans le but de produire une protéine d’intérêt est apparue au début des années 1970 avec l’essor du génie génétique. Environ dix années plus tard, l’insuline issue de la plateforme de production microbienne Escherichia coli, fut la première protéine recombinante (r-protéine) humaine commercialisée. Les défis associés à la production de r-protéines plus complexes et glycosylées ont amené l’industrie biopharmaceutique à développer des systèmes d’expression en cellules de mammifères. Ces derniers permettent d’obtenir des protéines humaines correctement repliées et de ce fait, biologiquement actives. Afin de transférer le gène d’intérêt dans les cellules de mammifères, le polyéthylènimine (PEI) est certainement un des vecteurs synthétiques le plus utilisé en raison de son efficacité, mais aussi sa simplicité d’élaboration, son faible coût et sa stabilité en solution qui facilite son utilisation. Il est donc largement employé dans le contexte de la production de r-protéines à grande échelle et fait l’objet d’intenses recherches dans le domaine de la thérapie génique non virale. Le PEI est capable de condenser efficacement l’ADN plasmidique (vecteur d’expression contenant le gène d’intérêt) pour former des complexes de petites tailles appelés polyplexes. Ces derniers doivent contourner plusieurs étapes limitantes afin de délivrer le gène d’intérêt au noyau de la cellule hôte. Dans les conditions optimales du transfert de gène par le PEI, les polyplexes arborent une charge positive nette interagissant de manière électrostatique avec les protéoglycanes à héparane sulfate (HSPG) qui décorent la surface cellulaire. On observe deux familles d’HSPG exprimés en abondance à la surface des cellules de mammifères : les syndécanes (4 membres, SDC1-4) et les glypicanes (6 membres, GPC1-6). Si l’implication des HSPG dans l’attachement cellulaire des polyplexes est aujourd’hui largement acceptée, leur rôle individuel vis-à-vis de cet attachement et des étapes subséquentes du transfert de gène reste à confirmer. Après avoir optimisées les conditions de transfection des cellules de mammifères CHO et HEK293 dans le but de produire des r-protéines secrétées, nous avons entrepris des cinétiques de capture, d’internalisation des polyplexes et aussi d’expression du transgène afin de mieux comprendre le processus de transfert de gène. Nous avons pu observer des différences au niveau de ces paramètres de transfection dépendamment du système d’expression et des caractéristiques structurelles du PEI utilisé. Ces résultats présentés sous forme d’articles scientifiques constituent une base solide de l’enchaînement dans le temps des évènements essentiels à une transfection efficace des cellules CHO et HEK293 par le PEI. Chaque type cellulaire possède un profil d’expression des HSPG qui lui est propre, ces derniers étant plus ou moins permissifs au transfert de gène. En effet, une étude menée dans notre laboratoire montre que les SDC1 et SDC2 ont des rôles opposés vis-à-vis du transfert de gène. Alors que tous deux sont capables de lier les polyplexes, l’expression de SDC1 permet leur internalisation contrairement à l’expression de SDC2 qui l’inhibe. De plus, lorsque le SDC1 est exprimé à la surface des cellules HEK293, l’efficacité de transfection est augmentée de douze pourcents. En utilisant la capacité de SDC1 à induire l’internalisation des polyplexes, nous avons étudié le trafic intracellulaire des complexes SDC1 / polyplexes dans les cellules HEK293. De plus, nos observations suggèrent une nouvelle voie par laquelle les polyplexes pourraient atteindre efficacement le noyau cellulaire. Dans le contexte du transfert de gène, les HSPG sont essentiellement étudiés dans leur globalité. S’il est vrai que le rôle des syndécanes dans ce contexte est le sujet de quelques études, celui des glypicanes est inexploré. Grâce à une série de traitements chimiques et enzymatiques visant une approche « perte de fonction », l’importance de la sulfatation comme modification post-traductionnelle, l’effet des chaînes d’héparanes sulfates mais aussi des glypicanes sur l’attachement, l’internalisation des polyplexes, et l’expression du transgène ont été étudiés dans les cellules CHO et HEK293. L’ensemble de nos observations indique clairement que le rôle des HSPG dans le transfert de gène devrait être investigué individuellement plutôt que collectivement. En effet, le rôle spécifique de chaque membre des HSPG sur la capture des polyplexes et leur permissivité à l’expression génique demeure encore inconnu. En exprimant de manière transitoire chaque membre des syndécanes et glypicanes à la surface des cellules CHO, nous avons déterminé leur effet inhibiteur ou activateur sur la capture des polyplexes sans pouvoir conclure quant à l’effet de cette surexpression sur l’efficacité de transfection. Par contre, lorsqu’ils sont présents dans le milieu de culture, le domaine extracellulaire des HSPG réduit l’efficacité de transfection des cellules CHO sans induire la dissociation des polyplexes. Curieusement, lorsque chaque HSPG est exprimé de manière stable dans les cellules CHO, seulement une légère modulation de l’expression du transgène a pu être observée. Ces travaux ont contribué à la compréhension des mécanismes d'action du vecteur polycationique polyéthylènimine et à préciser le rôle des protéoglycanes à héparane sulfate dans le transfert de gène des cellules CHO et HEK293.

Quitosana na indução de resistência ao tombamento de plântulas de espécies olerícolas e no controle de fitopatógenos in vitro

Induction of resistance is defined as the activation of a state of resistance against diseases which is induced systemically in plants by the use of biotic or abiotic agents without any modification of the plant genome, occurring non-specific way, by activating genes coding for various plant defense responses. Chitosan is a polymer derived from the deacetylation of chitin, which is found in large quantities in crustacean shell, and studied with the potential to control plant pathogens, both by its direct fungistatic action, as the ability to induce protection of plants, indicating the presence of molecules of elicitoras characteristics. Three experiments with objective of evaluating the potential of chitosan in the seedling resistance induction were developed, beet (Beta vulgaris) seeds, cucumber (Cucumis sativus) seeds and tomato (Solanum lycopersicum) seeds, and the control of Fusarium sp., Rhizoctonia solani K¨uhn e Pythium sp. in vitro conditions. The experimental design was completely randomized, with four replications. Beet seeds, tomato and cucumber were submerged in chitosan solution for 20 minutes, in concentrations of 0.25, 0.5, 1 and 2% in the control and distilled water. Seeds were sown in trays containing Plantmax Florestalr substrate sterilized and inoculated with Fusarium sp., Rhizoctonia solani K¨unh and Pythium sp., respectively for the three cultures. The experiment was conducted for 14 days in growth chamber with controlled temperature (25 C 2 C), light (12 hour photoperiod) and humidity (70% 10%). The evaluations were seed emergency, seedling damping-off, seedling length, fresh weight and activity of the enzymes phenylalanine amˆonia-liase (PAL), chitinase and b-1,3-glucanase. It was also rated the mycelial growth of Fusarium sp., Pythium sp. and R. solani on P.D.A. (Potato-Dextrose and Agar) culture medium containing chitosan at the same concentrations evaluated in seeds. For beet growing, seed treatment with chitosan presented higher emergence and the length of the seedlings, and reduced the percentage of tipping. Treatment with chitosan activated the systemic acquired resistance with expression of chitinase and b-1,3-glucanase enzymes. For the tomato crop in chitosan concentration of 0.25% favored the emergency of seedlings, reduced the incidence of tipping and activated the PAL enzymes, chitinase and b-1,3-glucanase. In cucumber on the concentration of up 0.5% favored seedlings emergence and reduces the incidence of tipping. Chitosan activated the PAL enzymes and b-1,3-glucanase. Chitosan also presented fungistatic action on the initial growth of Pythium sp. and R. solani in vitro conditions, however, such action did not prevail until the end of the experiment. To Fusarium sp. the concentration of chitosan resulted in the reduction of mycelial growth in vitro.

Alternativas de uso da borra de café através de hidrólise ácida, enzimática, ou como substrato para a produção das enzimas: lacase e celulase

In the industrial production of soluble coffee, huge amounts of extracted coffee residues are generated; onaverage, for eachtonne of green coffee extracted, 480 kg of coffee ground waste is produced. This is a solid residue currently used to generate energy at the steam boilers from the soluble coffee industry. Some is also used or as fertilizer on agriculture fields. Seeking a better end use, the work reported here aimed to study the viability of hydrolyzing the coffee ground residue for the production of carbohydrates. Hydrolysis was undertaken with hydrochloric acid at different temperatures and pressures, using a water bath or autoclave.An enzymatic hydrolysis with Viscozyme Lwas developed using Whatman filter paper No1 and the optimal conditions were determined using a rotational central composite experimental design (DCCR).The best conditions to hydrolyze filter paper cellulose were 50 FBG (Fungal β-glucanase) of Viscozyme L at pH 4.0 for 1.0 h and 45 ºC. The ground coffee was hydrolyzed under the same conditions as described above for filter paper, however this enzymatic hydrolysis was not efficient. A combination of enzymatic hydrolysis as a pre-treatment for the ground coffee followed by acid hydrolysis using HCl conducted in an autoclave (120 C for 2.0 h) resulted in higher production of glucose as analyzed by HPLC. Another end use of the ground coffee evaluated was as source of substrate in the culture medium to grow Botryosphaeria rhodina MAMB-05 to produce the enzymes laccase and cellulase. Highest enzyme titres obtained were with 8% (w/v) coffee grounds to which was added a minimum salts medium(Vogel), under agitation conditions (180 rpm) at 28ºC. The phenolic compounds present in the coffee grounds appear to have induced laccase by Botryosphaeria rhodina.

Optimization of lipase production from yeasts strains isolated from olive mil wastewater

Dissertação submetida à Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências para a obtenção do Grau de Mestre em Microbiologia Aplicada.

Crescimento celular e produção de carotenoides pela microalga haematococcus pluvialis

O crescimento celular da microalga Haematococcus pluvialis e a bioprodução de carotenoides são influenciados pelas diferentes condições de cultivo. Dentre os corantes naturais, a astaxantina tem importante aplicação farmacêutica, cosmética e na indústria de alimentos. Este pigmento além de colorir, possui propriedades biológicas, dentre elas a atividade antioxidante. A produção de astaxantina através do cultivo de H. pluvialis pode alcançar até 4% do peso seco da microalga. O objetivo desse trabalho foi avaliar o crescimento celular, bem como a produção de carotenoides pela microalga Haematococcus pluvialis em diferentes condições de cultivo e a atividade antioxidante dos extratos carotenogênicos. Foram utilizados os meios autotróficos Blue Green-11 (BG-11), BAR (Barbera Medium) e BBM (Bold Basal Medium) e os meios mixotróficos BBM e glicose e BBM e acetato de sódio, empregando 10 ou 20% de inóculo em pHs iniciais de 6, 7 ou 8, aeração de 0,30 L.min-1 , sob iluminância de 6 Klx, 24±1ºC durante 15 dias em fotobiorreatores de 1 L. A concentração celular foi avaliada diariamente através de leitura de absorvância a 560 nm. A ruptura celular foi realizada através de 0,05 g de células secas com 2 mL de dimetilsulfóxido e a concentração de carotenoides totais determinada a partir de leitura espectrofotométrica a 474 nm. Os meios de cultivo BG-11, BBM e glicose e BBM e acetato de sódio apresentaram, respectivamente, o maior crescimento celular e produção de carotenoides totais de 0,64, 1,18 e 0,68 g.L-1 , e 3026,66, 2623,12 e 2635,38 µg.g-1 , empregando 10% de inóculo em pH inicial de 7. Com base nesses resultados, foram selecionados esses três meios para dar continuidade ao trabalho. O meio de cultivo BBM e acetato de sódio obteve o melhor valor de concentração celular máxima, com 1,29±0,07 g.L-1 e de carotenoides totais 5653,56 µg.g-1 empregando pH inicial de 7 e concentração de inóculo de 20%. Este meio foi selecionado para a realização dos cultivos com injeção de 30 % de CO2 uma vez ao dia durante 1 hora, realizados durante 22 dias, em pH inicial de 7 e 20% de inóculo, com 30% de injeção de CO2 uma vez ao dia durante 1 hora. Nestas condições o crescimento celular alcançou o máximo de 1,13 g.L-1 (10 dias), carotenoides totais específicos de 2949,91 µg.g-1 e volumétricos de 764,79 µg.g-1 .L-1 (22 dias). A capacidade antioxidante dos extratos carotenogênicos também foi avaliada pelos métodos DPPH, FRAP e ABTS, não sendo possível quantificá-la através do DPPH e FRAP. Por outro lado, utilizando o método ABTS, em 90 minutos de reação, o poder de inibição encontrado foi de 35,70 % μg-1 . Assim, a condição que mais se destaca é a utilização do meio de cultivo BBM e acetato de sódio, com pH inicial 7, com 20% de inóculo, 0,30 L.min-1 de aeração, 6 Klx e 24±1ºC, uma vez que o crescimento celular e a bioprodução de carotenoides foi significativamente superior quando comparada às demais condições estudadas. Além disso, os carotenoides produzidos pela H. pluvialis, nesta condição, apresentaram capacidade antioxidativa.

Produção enzimática de biodiesel a partir de resíduos agro-industriais usando a lipase imobilizada de origem microbiana

Trabalho Final de Mestrado para obtenção do grau de Mestre em Engenharia Química e Biológica

The regulation of cancer cell invasive behaviour by Chloride Interacellular Channel 3 (CLIC3) and Transglutaminasae 2

A study into the role of secreted CLIC3 in tumour cell invasion. The initiation and progression of cancers is thought to be linked to their relationship with a population of activated fibroblasts, which are associated with tumours. I have used an organotypic approach, in which plugs of collagen I are preconditioned with fibroblastic cells, to characterise the mechanisms through which carcinoma-associated fibroblasts (CAFs) influence the invasive behaviour of tumour cells. I have found that immortalised cancer-associated fibroblasts (iCAFs) support increased invasiveness of cancer cells, and that this is associated with the ability of CAFs to increase the fibrillar collagen content of the extracellular matrix (ECM). To gain mechanistic insight into this phenomenon, an in-depth SILAC-based mass proteomic analysis was conducted, which allowed quantitative comparison of the proteomes of iCAFs and immortalised normal fibroblast (iNFs) controls. Chloride Intracellular Channel Protein 3 (CLIC3) was one of the most significantly upregulated components of the iCAF proteome. Knockdown of CLIC3 in iCAFs reduced the ability of these cells to remodel the ECM and to support tumour cell invasion through organotypic plugs. A series of experiments, including proteomic analysis of cell culture medium that had been preconditioned by iCAFs, indicated that CLIC3 itself was a component of the iCAF secretome that was responsible for the ability of iCAFs to drive tumour cell invasiveness. Moreover, addition of soluble recombinant CLIC3 (rCLIC3) was sufficient to drive the extension of invasive pseudopods in cancer cell lines, and to promote disruption of the basement membrane in a 3D in vitro model of the ductal carcinoma in situ (DCIS) to invasive ductal carcinoma (IDC) transition. My investigation into the mechanism through which extracellular CLIC3 drives tumour cell invasiveness led me to focus on the relationship between CLIC3 and the ECM modifying enzyme, transglutaminase-2 (TG2). Through this, I have found that TG2 physically associates with CLIC3 and that TG2 is necessary for CLIC3 to drive tumour cell invasiveness. These data identifying CLIC3 as a key pro-invasive factor, which is secreted by CAFs, provides an unprecedented mechanism through which the stroma may drive cancer progression.

Produção de carboidratos a partir do efluente de laticínios tratado por cianobactéria

Nesta tese foi demonstrado o potencial de produção de carboidratos por Aphanothece microscopica Nägeli cultivada no efluente oriundo de uma indústria de laticínios. Para tanto, o trabalho é composto de quatro artigos que objetivaram avaliar a produção de carboidratos em função da temperatura, inóculo e razões C/N e N/P do elfluente, bem como a possibilidade de reúso da água residuária. Foram utilizadas temperaturas de (10, 20 e 30ºC) e inóculo (100, 200 e 300 mg.L-1). A melhor condição indicada foi quando utilizou-se a temperatura de 30°C e 200 mg.L-1 de inóculo. Na sequência, considerando a temperatura e a concentração celular selecionada, foi estudada a influência das razões C/N e N/P na produção de carboidratos. Para tal, C/N (20, 40 e 60) e N/P (5, 10 e 15) na produção de carboidratos extracelulares foram avaliadas em cultivos a 30°C, tendo como inóculo 200 mg.L-1. Os melhores resultados obtidos, foram quando foi utilizado C/N 60 e N/P 10. Uma vez definidas as melhores condições de produção de carboidratos, foi estudado o processo de separação de biomassa do meio de cultivo, a partir dos coagulantes FeCl3, Al2(SO4)3 e tanino. O efeito dos coagulantes na separação da biomassa foram estudados, quanto ao pH (6,0, 7,0 e 8,0) e concentração de coagulantes (50, 300 e 550 mg.L-1), utilizando como parâmetro de medida, a eficiência de remoção de DQO, turbidez e sólidos suspensos (SS). Os resultados demonstraram que as concentrações de coagulantes influenciaram significativamente ao nível de significância de 5 %, na separação da biomassa, com eficiência significativa na remoção da DQO, turbidez e SS. A melhor condição avaliada foi a que utilizou tanino na concentração de 300 mg.L-1 e pH 7,0, o que resultou em uma água residuária com remoção média de 96 % da turbidez, com potencial de ser reutilizada. Por fim, foi realizada a identificação de carboidratos gerados por Aphanothece microscopica Nägeli. Os resultados evidenciaram uma biomassa com até 33,5 % de carboidratos totais, perfazendo uma fração de carboidratos extracelulares, na fase estacionária de crescimento celular, de aproximadamente 25 % e 8 % os carboidratos da parede celular. Ficou demonstrado ainda que a composição dos carboidratos extracelulares do microorganismo em estudo é constituído por mono e dissacarídeos perfazendo concentrações na ordem de 12,88 % de glicose, 3,54 % de rafinose, 3,43 % sacarose, 2,13 % de frutose e 2,45 % de ribose. Ficou demonstrado o potencial de produção de carboidratos por Aphanothece microscopica Nägeli quando cultivada no efluente da indústria de laticínios.

Dinâmica de nitrogênio em cultivo heterotrófico a partir de cianobactéria sob o escopo de biorrefinarias agroindustriais

O trabalho teve por objetivo avaliar a dinâmica de nitrogênio, em cultivo heterotrófico, a partir da cianobactéria Aphanothece microscopica Nägeli, sob o escopo de uma biorrefinaria. Neste sentido, foi avaliada a contribuição dos compostos nitrogenados não proteicos, na dinâmica de distribuição do nitrogênio, na biomassa gerada pelo micro-organismo em estudo, quando cultivado em sistema autotrófico e heterotrófico. Para o cultivo em condições autotróficas, foi utilizado o meio padrão BG-11, enquanto que, para o cultivo em condições heterotróficas, foi empregado o efluente da indústria de laticínios. Inicialmente, foi avaliada a contribuição dos pigmentos na fração nitrogenada não proteica tendo como base dois experimentos. No primeiro experimento foi selecionada a melhor condição para a produção de pigmentos, expressos pela clorofila-a em sistema heterotrófico, tendo como base os parâmetros C/N (20, 40 e 60), N/P (5, 10 e 15) e concentração de inóculo (100, 200 e 300 mg.L-1), mediante um planejamento fatorial 23 . Os experimentos foram conduzidos em biorreator heterotrófico a 20°C, pH 7,6 e aeração contínua de 1VVM. A melhor condição de produção de pigmento foi indicada como sendo a 200 mg.L-1 de concentração celular, razões C/N 20 e N/P 10. Com base nestes resultados, um segundo experimento foi delineado, visando avaliar a contribuição de pigmentos na fração de nitrogênio não proteico, bem como avaliar a produção de clorofila-a e ficobiliproteínas (ficocianina, aloficocianina e ficoeritrina), sob influência da luz e do meio de cultivo. Foi possível destacar teores superiores de ficobiliproteínas na biomassa gerada no cultivo heterotrófico. No entanto, com notada diferença (p≤0,05) nos teores de clorofila-a, quando são comparadas as concentrações na biomassa de meios autotróficos (10,7 mg.g-1) e heterotróficos (1,0 mg.g-1). Fato este compensado pelo menor tempo de cultivo registrado para atingir o final do experimento, quando o micro-organismo é cultivado em condições heterotróficas. Fica demonstrado assim, ainda, a importante contribuição dos pigmentos na fração de nitrogênio não proteico. Na sequência, um terceiro e quarto experimentos foram delineados, visando avaliar a influência do nitrogênio inorgânico intracelular na fração não proteica e na produção de proteína, assim como a caracterização da fração proteica quanto ao seu perfil aminoacídico. O estudo da dinâmica do nitrogênio intracelular demonstrou que o N-NH4 + foi a forma nitrogenada predominante, perfazendo importante fração de N-NP, sendo, portanto, os teores de N-NP significativamente dependente dos teores de pigmentos e nitrogênio intracelular. Os aminogramas das biomassas geradas pelos cultivos autotróficos e heterotróficos indicaram como aminoácidos majoritários o ácido glutâmico e aspártico, seguidos por valina, leucina e isoleucina, e como minoritários, lisina, glicina e metionina. O perfil aminoacídico caracterizou-se por apresentar aminoácidos essenciais como isoleucina, metionina + cisteína, fenilalanina + tirosina, valina e treonina em concentrações superiores ao preconizado pela FAO/WHO. A caracterização da fração proteica quanto ao perfil aminoacídico qualificou esta biomassa como fonte potencial de proteína. Os resultados obtidos neste trabalho demonstram a influência e dinâmica de distribuição dos compostos nitrogenados em Aphanothece microscopica Nägeli. Fica demonstrado, ainda, que a implementação do conceito de biorrefino, no tipo de agroindústria estudado, poderá representar importantes possibilidades de aproveitamento sustentável do efluente gerado.

Produção e purificação de biogás utilizando microalga spirulina sp. LEB-18

O crescimento da população mundial e a tentativa de substituição parcial dos combustíveis fósseis por novas fontes de energia têm levado a uma maior atenção quanto à possível escassez de alimentos e a carência de grandes áreas disponíveis para agricultura. Microalgas, por meio do metabolismo fotossintético, utilizam energia solar e gás carbônico como nutrientes para o crescimento. A microalga Spirulina pode ser utilizada como suplemento alimentar, na biofixação de CO2, como fonte de biocombustíveis e no tratamento de efluentes. A digestão anaeróbia da biomassa microalgal produz biogás e os resíduos deste processo podem ser utilizados como substrato para novos cultivos da microalga. O objetivo deste trabalho foi estudar a conversão de Spirulina sp. LEB-18 em biogás em escala piloto e produzir biomassa microalgal utilizando os efluentes bicarbonato e dióxido de carbono do processo anaeróbio como fonte de nutrientes. Spirulina foi utilizada como substrato na digestão anaeróbia para produção de biogás em escala piloto sob temperaturas variáveis (12- 38 °C). Efluente do processo anaeróbio foi adicionado (20 %, v/v) como fonte de carbono no cultivo da microalga para avaliar o crescimento e a composição da biomassa. A seguir foi avaliada a capacidade da microalga de remover CO2 presente no biogás através de biofixação para obtenção do biocombustível purificado. O biogás produzido sob as diferentes temperaturas apresentou entre 72,2 e 74,4 % de CH4, quando realizado nas temperaturas 12 a 21 °C e 26 a 38 °C, respectivamente. A redução na temperatura do processo anaeróbio provocou um decréscimo na conversão de biomassa em biogás (0,30 para 0,22 g.g-1 ), ocorrendo dentro da faixa adequada e segura para as bactérias metanogênicas (pH 6,9; alcalinidade entre 1706,0 e 2248,0 mg.L-1 CaCO3 e nitrogênio amoniacal 479,3 a 661,7 mg.L-1 ). Os cultivos de Spirulina sp. LEB-18 em efluente anaeróbio contendo 20 % (v/v) e meio Zarrouk modificado (NaHCO3 2,8 e 5,3 g.L-1 ) apresentaram velocidade específica máxima de crescimento entre 0,324 e 0,354 d-1 , produtividade volumétrica entre 0,280 e 0,297 g.L-1 .d-1 e produtividade areal entre 14,00 e 14,85 g.m-2 .d-1 , sem diferenças significativas (p > 0,05) entre as diferentes condições estudadas. Lipídios variaram entre 4,9 e 5,0 % com proporção de ácido linoleico maximizada nos meios com efluente e ácido alfa-linolênico reduzida nesses meios em comparação ao meio Zarrouk completo. Nos ensaios para avaliar a capacidade da microalga Spirulina sp. LEB-18 de remover CO2 contaminante no biogás, as máximas concentrações celulares e produtividades de biomassa variaram, respectivamente, entre 1,12 e 1,24 g.L-1 e 0,11 e 0,14 g.L-1 .d-1 , não apresentando diferenças significativas (p > 0,05) entre os ensaios. A maior fixação diária total (FDT) de dióxido de carbono obtida foi 58,01 % (v/v) em cultivos com adição de biogás contendo 25 % (v/v) CO2. Obteve-se biogás com 89,5 % (v/v) de CH4 após injeção em cultivos de Spirulina, no qual aproximadamente 45 % (v/v) do CO2 injetado foi fixado pela microalga, gerando biomassa para diversas aplicações e biogás purificado.

Cyto- and Genotoxicity assessment of manufactured nano cerium dioxide in the A549 cell line

In the past decades the growing application of nanomaterials (NMs) in diverse consumer products has raised various concerns in the field of toxicology. They have been extensively used in a broad range of applications and cover most of the industrial sectors as well as the medicine and the environmental areas. The most common scenarios for human exposure to NMs are occupational, environmental and as consumers and inhalation is the most frequent route of exposure, especially in occupational settings. Cerium dioxide NMs (nano-CeO2) are widely used in a number of applications such as in cosmetics, outdoor paints, wood care products as well as fuel catalysts. For such reason, nano-CeO2 is one of the selected NMs for priority testing within the sponsorship program of the Working Party of Manufactured Nanomaterials of the OECD. In this context, the aim of this study is to assess the safety of nano-CeO2 (NM-212, Joint Research Center Repository) through the characterization of its cytotoxicity and genotoxicity in a human alveolar epithelial cell line. A dispersion of the NM in water plus 0.05% BSA was prepared and sonicated during 16 minutes, according to a standardized protocol. DLS analysis was used to characterize the quality of the NM dispersion in the culture medium. To evaluate the cytotoxicity of nano-CeO2 in the A549 cell line, the colorimetric MTT assay was performed; the capacity of cells to proliferate when exposed to CeO2 was also assessed with the Clonogenic assay. The genotoxicity of this NM was evaluated by the Comet Assay (3 and 24h of exposure) to quantify DNA breaks and the FPG-modified comet assay to assess oxidative DNA damage. The Cytokinesis-Block Micronucleus (CBMN) assay was used to further detect chromosome breaks or loss. The nano-CeO2 particles are spherical, displaying a diameter of 33 nm and 28 m2/g of surface area. The results of the MTT assay did not show any decreased in cells viability following treatment with a dose-range of nano-CeO2 during 24h. Nevertheless, the highest concentrations of this NM were able to significantly reduce the colony forming ability of A549 cells, suggesting that a prolonged exposure may be cytotoxic to these cells. Data from both genotoxicity assays revealed that nano-CeO2 was neither able to induce DNA breaks nor oxidative DNA damage. Likewise, no significant micronucleus induction was observed. Taken together, the present results indicate that this nano-CeO2 is not genotoxic in this alveolar cell line under the tested conditions, although further studies should be performed, e.g., gene mutation in somatic cells and in vivo chromosome damage (rodent micronucleus assay) to ensure its safety to human health.

Síntese de carboidratos por microalgas e produção de bioetanol

A maior parte da energia hoje consumida no mundo é derivada de fontes como petróleo, carvão e gás natural. Essas fontes, no entanto, não são renováveis e podem se esgotar em data futura. Nas últimas décadas, as fontes renováveis de combustíveis de base biológica, em especial o bioetanol, têm sido consideradas como alternativa à matriz energética convencional. Porém, existe a necessidade de ampliação da oferta de matérias-primas para produção de etanol, sem pressionar a área plantada para produção de alimentos, o que tem levado empresas e países a investirem em pesquisas para maior utilização de outras matériasprimas. As microalgas surgem como uma das alternativas mais promissoras para a produção de bioetanol, sendo que modificações nas condições de cultivo podem propiciar incremento na concentração de carboidratos destas. Neste contexto, o objetivo deste trabalho foi avaliar a influência da concentração de nutrientes na concentração de carboidratos de microalgas e produzir bioetanol a partir destas. Avaliou-se a síntese de carboidratos das microalgas Chlorella homosphaera e Spirulina platensis LEB 52 em cultivos mixotróficos com diferentes concentrações do componente nitrogenado e cloreto de sódio adicionados aos meios de cultivo. Para a microalga Chlorella minutissima, foram avaliados os efeitos do meio de cultivo e das concentrações dos componentes nitrogenado e fosfatados utilizados no meio de cultivo da microalga sobre a concentração de carboidratos desta. Foram realizadas fermentações alcoólicas utilizando como substrato biomassa das microalgas Chlorella pyrenoidosa e Spirulina sp. LEB 18 acrescidos de glicose e sacarose. Para a microalga Chlorella homosphaera, a maior produtividade em carboidratos foi obtida nos ensaios realizados com a maior concentração de KNO3 com menor concentração de NaCl e menor concentração de KNO3 com maior concentração de NaCl (0,014±0,001 g.L-1 .d-1 e 0,015±0,002 g.L-1 .d-1 , respectivamente). A maior produtividade em carboidratos nos cultivos de Spirulina platensis LEB 52 (0,116±0,002 g.L-1 .d-1 ) foi verificada no experimento no qual a microalga foi cultivada nas menores concentrações de NaNO3 e NaCl. A microalga Spirulina platensis LEB 52 apresentou maior produtividade em carboidratos quando comparada à microalga Chlorella homosphaera. A microalga Chlorella minutissima cultivada em meio Basal, com adição de 0,125 g.L-1 do componente nitrogenado (KNO3) e sem adição dos componentes fosfatados (K2HPO4 e KH2PO4) apresentou a maior produtividade em carboidratos nos cultivos (0,030±0,002 g.L-1 .d-1 ). O ensaio com biomassa de Spirulina sp. LEB 18 com adição de glicose apresentou eficiência superior na formação de etanol e produtividade em etanol (68,487±2,592% e 1,182±0,051g.L-1 .h-1 , respectivamente).

Síntese, extração e caracterização de biopolímeros de origem microalgal para desenvolvimento de nanofibras

Pesquisas com microalgas estão crescendo devido aos possíveis bioprodutos oriundos de sua biomassa, bem como as suas diferentes aplicabilidades. Microalgas podem ser cultivadas para a produção de biopolímeros com características de biocompatibilidade e biodegradabilidade. Nanofibras produzidas por electrospinning a partir de poli-β-hidroxibutirato (PHB) geram produtos com aplicabilidade na área de alimentos e médica. O objetivo deste trabalho foi selecionar microalgas com maior potencial para síntese de biopolímeros, em diferentes meios de cultivo, bem como purificar poli-β-hidroxibutirato e desenvolver nanofibras. Este trabalho foi dividido em cinco artigos: (1) Seleção de microalgas produtoras de biopolímeros; (2) Produção de biopolímeros pela microalga Spirulina sp. LEB 18 em cultivo com diferentes fontes de carbono e redução de nitrogênio; (3) Síntese de biopolímeros pela microalga Spirulina sp. LEB 18 em cultivos autotróficos e mixotróficos; (4) Purificação de poli-β- hidroxibutirato extraído da microalga Spirulina sp. LEB 18; e (5) Produção de nanofibras a partir de poli-β-hidroxibutirato de origem microalgal. Foram estudadas as microalgas Cyanobium sp., Nostoc ellipsosporum, Spirulina sp. LEB 18 e Synechococcus nidulans. Os biopolímeros foram extraídos nos tempos de 5, 10, 15, 20 e 25 d de cultivo a partir de digestão diferencial. Para os experimentos com diferentes nutrientes, foi utilizado como fonte de carbono, bicarbonato de sódio, acetato de sódio, glicose e glicerina modificando-se as concentrações de nitrogênio e fósforo. Os cultivos foram realizados em fotobiorreatores fechados de 2 L. A concentração inicial de inóculo foi 0,15 g.L-1 e os ensaios foram mantidos em estufa termostatizada a 30 ºC com iluminância de 41,6 µmolfótons.m -2 .s -1 e fotoperíodo 12 h claro/escuro. Para a purificação de PHB, foi utilizada a biomassa da cianobactéria Spirulina sp. LEB 18, cultivada em meio Zarrouk. Após a extração do biopolímero bruto, a amostra foi desengordurada com hexano e purificada com 1,2-carbonato de propileno. Foram determinadas as purezas e as propriedades térmicas no PHB purificado. O biopolímero utilizado para produzir as nanofibras apresentava 70 % de pureza. A técnica para produção de nanofibras foi o electrospinning. As microalgas que apresentaram máxima produtividade foram Nostoc ellipsosporum e Spirulina sp. LEB 18 com rendimento de biopolímero 19,27 e 20,62 % em 10 e 15 d, respectivamente, na fase de máximo crescimento celular. O maior rendimento de biopolímeros (54,48 %) foi obtido quando se utilizou 8,4 g.L-1 de NaHCO3, 0,05 g.L-1 de NaNO3 e 0,1 g.L-1 de K2HPO4. A condição que proporcionou maior pureza do PHB foi a 130 ºC e 5 min de contato entre o solvente (1,2-carbonato de propileno) e o PHB. As análises térmicas para todas as amostras foram semelhantes em relação ao PHB padrão (Sigma-Aldrich). A purificação com 1,2-carbonato de propileno foi eficiente para o PHB extraído de microalga, alcançando pureza acima de 90 %. A condição que apresentou menores diâmetros de nanofibras foi ao utilizar solução contendo 20 % de biopolímero solubilizado em clorofórmio. As condições do electrospinning que apresentou nanofibras com diâmetros de 470 e 537 nm foram, vazão 150 µL.h-1 , diâmetro do capilar 0,45 mm e voltagens entre 24,1 e 29,6 kV, respectivamente. A microalga Spirulina sp. LEB 18 produz PHB ao utilizar menores concentrações de nutrientes no meio de cultivo, que pode ser purificado com 1,2-carbonato de propileno. Este biopolímero possui aplicabilidade para produção de nanofibras.

MULTIPLICAÇÃO E ALONGAMENTO IN VITRO DE CLONES HÍBRIDOS DE Eucalyptus globulus

Os híbridos de Eucalyptus globulus representam uma excelente alternativa para o setor de celulose e papel, em razão dos ganhos em qualidade da madeira para a fabricação de celulose. Entretanto, estes híbridos têm apresentado recalcitrância ao enraizamento adventício. Assim, a micropropagação é apontada como a técnica para o rejuvenescimento desses híbridos adultos, viabilizando a propagação clonal dos mesmos. O presente trabalho avaliou o cultivo in vitro de três clones de Eucalyptus grandis x Eucalyptus globulus e de três clones de Eucalyptus urophylla x Eucalyptus globulus, em relação à multiplicação in vitro, no meio MS suplementado com 0,5 mg L-1 de BAP e 0,01 mg L-1 de ANA, bem como o efeito das concentrações de 0,25; 0,50; 0,75 e 1,0 mg L-1 de AIB e dos meios de cultura MS e JADS no alongamento in vitro das brotações. Os clones diferiram quanto à multiplicação in vitro das brotações e apresentaram uma taxa de multiplicação média dos clones de 3,0 tufos de brotações em cada subcultivo, ao longo dos 25 subcultivos realizados. No alongamento in vitro, os clones diferiram quanto às concentrações de AIB adequadas para provocar o alongamento, bem como em relação aos meios de cultura MS e JADS. O intervalo médio entre 0,40 e 0,80 mg L-1 de AIB proporcionou o maior número e comprimento das brotações alongadas in vitro e com maior vigor.