甲基对硫磷水解酶结构和功能的研究

本研究以本实验室分离的有机磷农药高效降解菌Pseudomonas sp．WBC-3为材料，通过X-射线晶体学研究确定了甲基对硫磷水解酶（MPH）的三维结构，并在结构基础上探讨了甲基对硫磷水解酶的结构与功能的关系。利用生物信息学手段对Pseudomonas sP.WBC-3中的甲基对硫磷水解酶基因进行分析，推测论H的结构基因的编码序列为398-1393 bp，蛋白大小为331个氨基酸，且具有一个由35个氨基酸组成的信号肤。同时发现，MPH是一个不同于具有相似生物学功能的有机磷水解酶（OPH）的蛋白质，而且在PDB库中尚无与MPH同源性较高的蛋白结构。晶体的生长依赖于高纯度的蛋白质的获得。在本研究中，我们采用阳离子交换树脂和凝胶过滤两步纯化获得了纯度达95％以上的MPH溶液，并采用等离子体质谱仪测定MPH为含锌的金属酶。采用悬滴蒸汽扩散法获得了PI和P43212两种晶型的晶体以及硒标记的MPH晶体。在获得单晶以后，最终利用尸43212晶型的晶体通过多波长反常散射法（MAD）解析了MPH的三维结构。MPH的晶体结构为同源二聚体，具有与OPH类似的二价金属离子组成的活性中心：其中一个单体含有两个锌离子，另一个单体含有一个锌离子和一个锅离子；每个单体的两个金属离子通过AsP 151、His 152、His 302、His 147、His 149、His 234和A印255与蛋白质相连，一个H2O分子桥连于两个金属离子，还有一个H2O分子只与一个金属离子配位。在MPH三维结构知识的基础上，利用分子生物学手段对MPH活性中心附近可能的底物结合氨基酸位点进行了研究。通过定点突变获得了针对Trp179，Phe 196和Phe 119三个位点的六个突变体W179F、W179A、F196W、F196A、FllgW和Fll9A，系统比较了突变体与野生酶的催化动力学特点。结果表明Trp 179，Phel％是MPH活性中心的底物结合部位的关键氨基酸。而Phe 119在与底物结合中的作用不明显。

沈阳城市森林环境效益的生理生态学基础研究

为了对沈阳市绿化树种的合理配置及城市森林环境效益的定量评价提供科学依据，本文以沈阳典型城市森林功能类型为试验区，利用L工一6400光合作用测定系统，采用自然条件下定位观测和室内分析相结合的方法，在典型城市森林功能类型主要绿化树种光合与蒸腾生理生态特性分析的基础上，首次对沈阳市城市森林固碳释氧和降温增湿生态环境效益进行了系统研究。典型城市森林功能类型主要树种的光合与蒸腾日变化曲线多呈单峰型，春季和夏季公园主要树种以双峰型曲线居多。光合速率与蒸腾速率季节变化趋势主要表现为夏季＞秋季＞春季。利用多元逐步回归分析方法，首次建立了沈阳市典型功能类型主要树种光合速率和蒸腾速率与生理生态因子的关系模型，确定了各季节影响光合与蒸腾速率的主要因子。典型城市森林功能类型乔木树种单位叶面积日固碳释氧能力为：白榆＞京桃＞旱柳＞银中杨＞刺槐＞油松＞银杏，降温增湿能力为：白榆＞京桃）银中杨＞旱柳＞刺槐＞油松＞银杏；灌木树种日固碳释氧与降温增湿能力均为：金钟连翘＞重瓣榆叶梅＞紫丁香。碳氧平衡分析表明，沈阳市城市森林年总固碳量205.20万吨，总释氧量147.88万吨，沈阳市耗氧量为1 463.04万吨，森林释氧量为其耗氧量的10.11％。

生物转化合成磷霉素菌株的筛选与转化特性研究

本研究从磷霉素（FOM）生产车间和储存仓库附近土壤中筛选手性环氧化顺式丙基磷酸（cPA）合成FOM的高效生物转化细菌。采用两种筛选模型，从土壤样品中分离到了183株待选细菌，其中147株为FOM抗性细菌，36株为cPA利用细菌。采用改进的琼脂块培养法，初筛获得了22株生物转化合成FOM菌株；再经振荡培养法，复筛获得3株生物转化活力较高的菌株，分别为FB3212、FB4211和FB7912。通过培养特征、生理生化特征性试验和16SrRNA序列分析鉴定，确定FB3212为赤红球菌（Rhodococcusruber），FB4211属于De沂ia菌属，FB7912为梭形芽抱杆菌（Bacillusfusformis），皆为新发现的生物转化合成FOM菌种。通过转化特性试验，FB3211、FB42n和FB7912的FOM转化合成均属于VO3-依赖型。甘油与Co2+对转化有明显的促进作用。在分批培养实验中FoM浓度在72h内随时间延一长而增高。底物cPA浓度对转化的影响最大，在三株菌中，FB7912的底物的抑制效应最小，转化活性最高，当cPA浓度为10mg／mL时，转化效果最佳，磷霉素转化产量为1.15mg/mL，转化率为10.17％。