甲基对硫磷水解酶结构和功能的研究

本研究以本实验室分离的有机磷农药高效降解菌Pseudomonas sp．WBC-3为材料，通过X-射线晶体学研究确定了甲基对硫磷水解酶（MPH）的三维结构，并在结构基础上探讨了甲基对硫磷水解酶的结构与功能的关系。利用生物信息学手段对Pseudomonas sP.WBC-3中的甲基对硫磷水解酶基因进行分析，推测论H的结构基因的编码序列为398-1393 bp，蛋白大小为331个氨基酸，且具有一个由35个氨基酸组成的信号肤。同时发现，MPH是一个不同于具有相似生物学功能的有机磷水解酶（OPH）的蛋白质，而且在PDB库中尚无与MPH同源性较高的蛋白结构。晶体的生长依赖于高纯度的蛋白质的获得。在本研究中，我们采用阳离子交换树脂和凝胶过滤两步纯化获得了纯度达95％以上的MPH溶液，并采用等离子体质谱仪测定MPH为含锌的金属酶。采用悬滴蒸汽扩散法获得了PI和P43212两种晶型的晶体以及硒标记的MPH晶体。在获得单晶以后，最终利用尸43212晶型的晶体通过多波长反常散射法（MAD）解析了MPH的三维结构。MPH的晶体结构为同源二聚体，具有与OPH类似的二价金属离子组成的活性中心：其中一个单体含有两个锌离子，另一个单体含有一个锌离子和一个锅离子；每个单体的两个金属离子通过AsP 151、His 152、His 302、His 147、His 149、His 234和A印255与蛋白质相连，一个H2O分子桥连于两个金属离子，还有一个H2O分子只与一个金属离子配位。在MPH三维结构知识的基础上，利用分子生物学手段对MPH活性中心附近可能的底物结合氨基酸位点进行了研究。通过定点突变获得了针对Trp179，Phe 196和Phe 119三个位点的六个突变体W179F、W179A、F196W、F196A、FllgW和Fll9A，系统比较了突变体与野生酶的催化动力学特点。结果表明Trp 179，Phel％是MPH活性中心的底物结合部位的关键氨基酸。而Phe 119在与底物结合中的作用不明显。