role of SLO in aGVHD : alterando o paradigma de allo-activação das células T, The

A indução da doença do transplante contra o hospedeiro (GVHD) depende da activação das células dadoras T pelas células do hospedeiro que apresentamantigenio (APCs). A teoria prevalecente descreve que estas interacções ocorrem nos órgãos linfáticos secundários (SLO), tais como os nóduloslinfáticos (LN), as placas de Peyer’s (PP) e o baço (SP). Esta hipótese foi testada usando ratinhos homozigóticos aly/aly (alinfoplasia) que não têm LN nem PP, usando como controlo os ratinhos heterozigóticos (aly/+) da mesma ninhada. Os dois grupos foram irradiados com dose letal após a remoção do baço aos ratinhos aly/aly (LN/PP/SP-/-), enquanto nos ratinhos aly/+ o baço foi deslocado e recolocado. Ambos receberam transplante de medula óssea (BMT) de ratinhos dadores singénicos (aly/aly, H-2b) ou de ratinhos alogénicos, com diferente complexo principal de histocompatibilidade (MHC) (BALB/c, H-2dou B10.BR, H-2k). A severidade de GVHD foi medida pela sobrevivência,e pelo sistema de pontuação, bem estabelecido, quer de doença clínica quer de doença dos órgãos alvo. Surpreendentemente, todos os ratinhos LN/PP/SP-/-sobreviveram, desenvolvendo GVHD clinicamente significativo, comparável,em severidade, com o observado nos ratinhos LN/PP/SP+/+. Além disso, asanálises histopatológicas demonstraram que os ratinhos LN/PP/SP-/-receptores de BMTdesenvolveram significativamente mais GVHD no fígado,no intestino, e na pele quando comparados com os animais singénicos decontrolo. Os ratinhos LN/PP/SP-/-desenvolveram também GVHD hepático mais severo quando comparados com os ratinhos de controlo LN/PP/SP+/+. Diferenças semelhantes foram ainda observadas, logo ao 7º dia, para o GVHDhepático entre os grupos alogénicos. Para identificar quais os órgãos extra-linfáticos do receptor que poderão servir como sítios iniciais de exposição a antigenios alogénicos, na ausência de SLO, foi examinada a expansão das células T (CD3+), a sua activação (CD69+), e a sua proliferação (CFSE) na medula óssea, 3 dias depois do BMT. Em cada caso, os ratinhos LN/PP/SP-/-transplantados com medula de dadores alogénicos apresentaram númerosabsolutos significativamente maiores quer de células, quer de divisõescelulares, se comparados com os LN/PP/SP+/+. Para garantir que as diferenças experimentais observadas nos animais aly/aly, no sistema díspar do MHC, não são apenas um fenómeno dependente da estirpe de ratinho, foramtransplantados ratinhos sem baço FucT dko (LN/PP/SP-/-), previamente tratados com o anticorpo monoclonal (mAb) anti-MadCAM-1. Após o BMT estes ratinhos apresentaram elevada pontuação clínica de GVHD, mostrando que os SLO não são necessários para a indução de GVHD. Em estudos de transplante-versus-leucemia usando hospedeiros homozigóticos (LN/PP/SP-/-) estes ratinhos morreram devido a expansão tumoral e não devido a GVHD.Estudos in vitro mostraram que a capacidade das APCs, quer das célulasdendríticas (DCs) esplénicas, quer das DCs derivadas da medula óssea, dosratinhos aly/aly e aly/+ eramcomparável. Colectivamente, estes resultados são consistentes com a noção de que os SLO não são necessários para a activação alogénica das celulas T, sugerindo que a medula óssea pode ser umlocal alternativo, embora menos eficiente, para o reconhecimento alogénico deantígenos e consequente activação das células dadoras T. Estas observações desafiam o paradigma de que os tecidos linfáticos secundários sãonecessários para a indução de GVHD.

Efeitos da toxicidade por metais pesados em Rhizobium leguminosarum bv. trifolii: diversidade e resposta de população isoladas de uma mina de chumbo

Nas últimas décadas verificou-se um aumento da contaminação dos solos com metais pesados resultante de processos antropogénicos. As descargas de efluentes industriais, a actividade mineira e a aplicação de lamas residuais e de fertilizantes são as principais fontes de metais pesados. Em certas regiões, a acumulação destes elementos nos solos tem atingido níveis preocupantes para o equilíbrio dos ecossistemas. Vários estudos têm demonstrado que os metais influenciam os microrganismos afectando adversamente o seu crescimento, morfologia e actividades bioquímicas resultando num decréscimo da biomassa e diversidade. Entre os microrganismos do solo, as bactérias pertencentes ao género Rhizobium têm um elevado interesse científico, económico e ecológico devido à sua capacidade para fixar azoto. Deste modo, o trabalho desenvolvido ao longo desta tese incidiu sobre o efeito da toxicidade imposta pelos metais nas bactérias fixadoras de azoto, em particular em Rhizobium leguminosarum bv. trifolii e teve como principais objectivos: determinar o efeito dos metais pesados na sobrevivência e na capacidade de fixar azoto dos isolados de rizóbio; avaliar a influência dos metais na diversidade das populações de rizóbio isoladas de solos contaminados; determinar os níveis de tolerância do rizóbio a diferentes metais e analisar a resposta ao stresse oxidativo imposto pelo cádmio. A Mina do Braçal foi o local de estudo escolhido uma vez que os seus solos estão muito contaminados com metais em resultado da extracção de minério durante mais de 100 anos. Foram escolhidos 3 solos com diferentes graus de contaminação, o solo BC com concentrações reduzidas de metais, escolhido por estar numa zona já fora da mina e designado por solo controlo e os solos BD e BA considerados medianamente e muito contaminados, respectivamente. O Pb e o Cd foram os metais predominantes nestes solos, assim como o metalóide As, cujas concentrações ultrapassaram largamente os limites previstos na lei. Sendo as enzimas do solo boas indicadoras da qualidade do mesmo, foi determinada a actividade de algumas como a desidrogenase (DHA) e a catalase (CAT). Ambas as enzimas correlacionaramse negativamente com as concentrações de metais nos solos. A dimensão das populações indígenas de rizóbio nos solos contaminados (BD e BA) foi bastante baixa, 9,1 bactérias g-1 de solo e 7,3 bactérias g-1 de solo, respectivamente, quando em comparação com a população do solo BC (4,24x104 bactérias g-1 de solo). Estes resultados parecem estar relacionados com o elevado conteúdo em metais e com o pH ácido dos solos. A capacidade simbiótica também foi afectada pela presença de metais, uma vez que os isolados originários do solo BD mostraram menor capacidade em fixar azoto do que os isolados do solo controlo. A diversidade das populações de rizóbio foi determinada com recurso à análise dos perfis de plasmídeos, perfis de REP e ERIC-PCR de DNA genómico e perfis de proteínas e lipopolissacarídeos. No conjunto dos 35 isolados analisados foram identificados 11 plasmídeos com pesos moleculares entre 669 kb e 56 kb. Embora a incidência de plasmídeos tenha sido superior nos isolados do solo BC verificou-se maior diversidade plasmídica na população isolada do solo BD. Resultados similares foram obtidos com os perfis de REP e ERIC-PCR e perfis de proteínas, que indicaram maior diversidade nas populações dos solos contaminados (BD e BA), contrariamente ao verificado por outros autores. O grau de tolerância aos metais pesados e ao arsénio dos vários isolados testados dependeu do metal e do local de origem. No geral, os isolados do solo BD mostraram maior tolerância aos metais do que os isolados do solo controlo, o que está de acordo com o esperado uma vez que geralmente as populações dos locais contaminados são mais tolerantes. Contudo, os isolados do local mais contaminado (BA) foram muito tolerantes apenas ao chumbo mostrando-se sensíveis aos restantes metais. A inoculação dos solos BC, BD e BA após irradiação com estirpes seleccionadas de rizóbio permitiu avaliar a sua sobrevivência ao longo de 12 meses em condições mais realistas. Verificou-se que após um decréscimo inicial, os isolados inoculados no solo BC conseguiram recuperar a dimensão das suas populações para números similares aos inicialmente introduzidos, contrariamente ao verificado no solo BD onde o número de rizóbios decresceu ao longo dos 12 meses. As condições adversas do solo BA apenas permitiram a sobrevivência de 4 isolados até aos 3 meses e apenas dois deles conseguiram sobreviver após 12 meses, designadamente C 3-1 e A 17-3. Estes isolados possuem um plasmídeo de 669 kb que poderá estar na base da sobrevivência destas estirpes. Por outro lado, o último isolado é originário do solo contaminado e por isso estará também mais adaptado a sobreviver às elevadas concentrações de Pb existentes no solo BA. Por fim, constatou-se que o cádmio, um dos metais presente em concentrações mais elevadas nos solos em estudo, é um indutor de stresse oxidativo nos isolados de rizóbio menos tolerantes o que foi confirmado pelo aumento de ROS e danos celulares ao nível dos lípidos.

Progesterone actions in protein phosphorylation in the central nervous system

O presente trabalho propõe-se esclarecer o papel que a progesterona e os seus metabolitos exercem no sistema nervoso central. Nos últimos anos, com a descoberta da síntese local de esteróides no cérebro, a progesterona, assim como outras hormonas sexuais, ganharam uma relevância crescente em fenómenos tais como plasticidade neuronal e neuroprotecção. Ainda que já se comece a entender o papel de muitas hormonas no cérebro, tal como o estrogénio, o papel da progesterona continua menos conhecido. Deste modo, o nosso trabalho centrou-se na elucidação dos efeitos da progesterona em fenómenos de sobrevivência celular, plasticidade neuronal/sináptica. Graças à colaboração com um grupo pioneiro em estudos sobre hormonas sexuais neuroactivas, o presente trabalho fornece uma importante contribuição ao entendimento do papel desta hormona no sistema nervoso central. Este trabalho fornece novos dados, relativamente ao papel da progesterona e dos seus metabolitos reduzidos na regulação de vias de sinalização associadas com sobrevivência celular, tal como Akt/PI3K e ERK. Também é analisado o efeito do tratamento hormonal na expressão e estado de fosforilação da proteína Tau, sendo ainda motivo de estudo cinases e fosfatases envolvidas nestes mecanismos.

Preparação e caracterização de materiais com constante dieléctrica colossal baseados em CCTO

A procura de materiais com elevada constante dieléctrica (E’) motivou nos últimos anos uma intensa pesquisa neste domínio. Entre as várias aplicações destes materiais destacam-se os dispositivos de memória baseados em componentes capacitivos, como as DRAM, em que o valor da constante dieléctrica estática (Es) determina o seu nível de miniaturização. Entre estes materiais, o CaCu3Ti4O12 (CCTO) tem sido apontado como sendo bastante interessante na perspectiva das aplicações tecnológicas e do ponto de vista científico. O CCTO tem a estrutura da perovsquite, apresentando valores elevados de E’ e uma grande estabilidade numa vasta gama de temperaturas (100 – 400 K) e frequências (100 Hz – 1 MHz). Contudo, as elevadas perdas dieléctricas (tan ) têm sido um entrave à sua aplicação tecnológica. Neste trabalho foram preparados materiais derivados do CCTO pelos métodos de reacção do estado sólido, sol-gel e fusão de zona com laser, com o principal objectivo de optimizar as amostras preparadas ao nível estrutural e morfológico, de modo a reduzir tan e aumentar a gama de frequências na qual se verifique E’colossal. Do ponto de vista da sua caracterização estrutural e morfológica usaram-se técnicas de difracção de raios X, microscopia electrónica de varrimento, espectroscopia de dispersão de raios X e espectroscopia de Raman. Para a caracterização eléctrica foram medidas a condutividade ac e dc, a impedância complexa e E’ em função da temperatura e frequência. As medidas dieléctricas mostraram a existência de mecanismos de relaxação, que foram ajustados usando o modelo de Cole-Cole. Discutiu-se a correlação entre os parâmetros de relaxação obtidos e os resultados estruturais das amostras. Atendendo a que o mecanismo de polarização que está na origem das propriedades incomuns do CCTO ainda permanece em discussão, foram produzidas amostras com uma grande diversidade morfológica, variando as condições de síntese. Foram ainda dopadas amostras de CCTO com os óxidos TeO2 e GeO2. Constatou-se que a resposta dieléctrica das amostras de CCTO policristalinas é muito dependente do tamanho de grão. Em regra, verificou-se o aumento de Es e a diminuição da resistência dos grãos e fronteiras de grão com o aumento do tamanho de grão.

Calix[4]pirróis: síntese e aplicação como sensores de aniões

A presente dissertação descreve, essencialmente, o desenvolvimento de novos métodos de funcionalização de calix[4]pirróis. O uso desses calix[4]pirróis, bem como o de porfirinas e ftalocianinas, como sensores de aniões, incluindo a determinação das suas constantes de afinidade é igualmente discutido. Esta dissertação encontra-se dividida em três partes distintas. Na primeira é feita uma revisão bibliográfica acerca das metodologias de síntese dos calix[4]pirróis, bem como das suas características e aplicações. A segunda parte encontra-se subdividida em diversos pontos de acordo com o tipo de funcionalização realizada nos calix[4]pirróis. No primeiro ponto desta parte encontram-se discutidos a síntese e a caracterização do mesooctametilcalix[ 4]pirrol-2-carbaldeído e do 3-(meso-octametilcalix[4]pirrol-2- il)propenal bem como os resultados obtidos da funcionalização destes aldeídos por reacções de cicloadição 1,3-dipolar. Esses aldeídos foram usados para gerar iletos de azometino, os quais foram “apanhados” com diversos dipolarófilos, tais como o fumaronitrilo, o fumarato de dimetilo, a N-(4- metoxifenil)maleimida, a 1,4-benzoquinona e a 1,4-naftoquinona. Ambos os calixpirróis com grupo formilo deram origem a aductos de cicloadição 1,3- dipolar com rendimentos moderados ou bons, principalmente quando se utilizou fumaronitrilo, fumarato de dimetilo ou N-(4-metoxifenil)maleimida como dipolarófilos. Neste estudo verificou-se que quando as quinonas eram utilizadas como dipolarófilos apenas eram obtidos os cicloaductos do 3-(mesooctametilcalix[ 4]pirrol-2-il)propenal. No segundo ponto descrevem-se as reacções de condensação aldólica e de Knoevenagel do mesooctametilcalix[ 4]pirrol-2-carbaldeído e do 3-(meso-octametilcalix[4]pirrol-2- il)propenal. Verificou-se a ausência de resultados para as reacções de condensação aldólica mas resultados muito satisfatórios para as reacções de Knoevenagel. Foram utilizados como compostos metilénicos activados a indano-1,3-diona, o 1,3-bis(dicianometilideno)indeno, o malononitrilo, o cianoacetato de etilo, o malonato de dietilo e o ácido de Meldrum. No penúltimo ponto encontram-se discutidas as reacções dos dois aldeídos com aminas bem como a sua redução e posterior tentativa de funcionalização dos calixpirróis com grupo hidroxilo. Em ambas as tentativas os resultados foram pouco satisfatórios. No último ponto da segunda parte descrevem-se, pormenorizadamente, os métodos de síntese, purificação e caracterização estrutural dos diversos compostos sintetizados. Na terceira parte são descritos os testes dos novos calix[4]pirróis sintetizados e também de outros derivados tetrapirrólicos, nomeadamente porfirinas e ftalocianinas, com aniões. Os calix[4]pirróis sintetizados demonstraram capacidade de interagir com diferentes aniões, e a sua capacidade de interacção é dependente dos grupos funcionais introduzidos. Verificou-se que os compostos com grupos ciano conjugados com um anel pirrólico do macrociclo apresentam constantes de afinidade mais elevadas para os aniões. A concluir esta dissertação encontra-se uma revisão da literatura sobre a utilização de porfirinas como sensores de aniões. Apresentam-se também os resultados obtidos com duas porfirinas e uma ftalocianina em tal aplicação. As porfirinas testadas apresentam elevadas constantes de afinidade com os iões fluoreto e di-hidrogenofosfato. No caso da ftalocianina verificou-se que esta interage com vários aniões, bem como com metanol e sulfóxido dimetílico, originando soluções de cores muito diferentes.

Relação do aroma e da espuma dos vinhos espumantes com o potencial enológico das uvas e dos vinhos

Os espumantes produzidos segundo o método Champanhês são obtidos após uma segunda fermentação em garrafa. Quando o vinho é vertido no copo, o CO2 produzido é libertado, sendo a espuma formada o resultado da sua interacção com os constituintes do vinho. A quantidade e a estabilidade da espuma do vinho espumante estão relacionadas com a sua composição química. Para além da espuma, o aroma é também um parâmetro importante de qualidade na apreciação geral de um vinho espumante. O aroma de um vinho espumante provém do contributo das uvas assim como do processo fermentativo. Dependendo do estado de maturação da uva, o contributo dos compostos voláteis para o aroma é diferente. Em virtude da vindima para os vinhos espumantes ser realizada antes da vindima para os vinhos maduros, dependendo da variedade, as uvas poderão não ser colhidas na expressão máxima do seu aroma, podendo verificar-se uma perda significativa do seu potencial varietal volátil. O objectivo desta dissertação é relacionar o aroma e a espuma dos vinhos espumantes com o potencial enológico das uvas e dos vinhos. Para isso, foi estudada a composição volátil das duas castas principais da Bairrada, a casta branca Fernão-Pires (FP) e a casta tinta Baga (BG), sendo estas duas das castas usadas para a produção de espumante. Para estudar a composição volátil das uvas durante a maturação, com vista a avaliar este efeito na expressão máxima de compostos voláteis, foi optimizada para este propósito a metodologia de microextracção em fase sólida em espaço de cabeça (HS-SPME). As uvas foram colhidas semanalmente, em duas vinhas, do pintor à pós-maturidade sendo posteriormente analisadas pela metodologia de HS-SPME seguida de cromatografia de gás acoplada à espectrometria de massa com quadrupolo (GC–qMS). No caso das uvas BG, observou-se um aumento acentuado na expressão máxima de compostos voláteis próximo da maturidade da uva determinada pelo teor em açúcar e acidez titulável, mantendo-se constante durante a pós-maturidade. Na determinação do perfil volátil das uvas ao longo da maturação foram identificados 66 compostos varietais nas uvas provenientes de uma vinha (Pedralvites) e 45 da outra vinha (Colégio). Em ambas as vinhas foram identificados 23 sesquiterpenóides, 13 monoterpenóides, 6 norisoprenóides, 2 álcoois aromáticos e 1 diterpenóide. Os sesquiterpenóides, devido à sua abundância em número e em área cromatográfica, podem ser considerados marcadores da casta BG. As uvas FP apresentaram um comportamento diferente do das uvas BG, sendo a expressão máxima de compostos voláteis expressa durante um curto período de tempo (1 semana), que coincide com a maturidade da uva. Depois de atingido este pico, observa-se uma diminuição drástica logo na semana seguinte. Este comportamento foi observado em ambas as vinhas, onde foram identificados 20 compostos voláteis varietais e 5 pré-fermentativos (álcoois e aldeídos em C6). Estes resultados mostram que quando estas castas são colhidas precocemente (1 semana antes da maturidade) para a produção de espumante, é observada uma redução significativa do potencial volátil que é expresso na maturidade. Para a análise da composição volátil dos vinhos espumantes foi optimizada uma metodologia de microextracção que permite usar uma maior quantidade de fase estacionária, a extracção sorptiva em barra de agitação (SBSE). O método foi optimizado usando 10 padrões de compostos voláteis representativos das principais famílias químicas presentes no vinho, nomeadamente, ésteres, monoterpenóides, sesquiterpenóides, norisoprenóides em C13 e álcoois. O método proposto apresenta uma boa linearidade (r2 > 0,982) e a reprodutibilidade varia entre 8,9 e 17,8%. Os limites de detecção para a maioria dos compostos é bastante baixo, entre 0,05 e 9,09 μg L-1. O método foi aplicado para a análise da composição volátil dos vinhos espumantes. Dentro dos vinhos espumantes analisados, foi estudada a influência da casta, do tipo de solo e do estado de maturação das uvas na sua composição volátil. A casta FP pode dar origem a vinhos com maior potencial de aroma do que a casta BG. Relativamente à avaliação dos diferentes estados de maturação, verificou-se que as uvas da maturidade e as da colheita tardia (uma semana depois da maturidade) deram origem aos vinhos com maior quantidade de compostos voláteis. Para os três tipos de solo estudados (arenoso, argiloso e argilo-calcário), o vinho obtido a partir de uvas colhidas no solo argilo-calcário foi o que mostrou a maior concentração de compostos voláteis varietais. A espuma destes vinhos espumantes foi também avaliada quanto à sua quantidade máxima (HM) e tempo de estabilidade (TS). O vinho espumante que apresentou um maior TS foi o vinho produzido a partir da casta FP proveniente de uma colheita tardia e solo argiloso. Os vinhos provenientes dos solos arenosos e argilo-calcários são os que apresentaram valores mais baixos de TS. Com vista a avaliar quais os conjuntos de moléculas do vinho que estão relacionados com as propriedades da espuma e possíveis sinergismos entre eles, para cada vinho espumante foi separada a fracção hidrofóbica de baixo peso molecular (MeLMW), a fracção de elevado peso molecular (HMW) e duas fracções de peso molecular intermédio (AqIMW e MeIMW). As propriedades da espuma dos vinhos modelo, reconstituídos com estas fracções e suas misturas, foram avaliadas. A combinação da fracção HMW com a MeLMW aumentou o TS 2,7 vezes quando comparado com o observado para a fracção HMW isoladamente, produzindo um efeito sinergético. Este aumento do TS ainda foi maior quando se combinou a fracção HMW com as subfracções obtidas a partir da fracção MeLMW, principalmente para as fracções menos apolares. A subfracção hidrofóbica menos apolar foi caracterizada por espectrometria de massa de ionização por electrospray (ESI-MS/MS) tendo sido identificada uma série de oligómeros de polietileno glicol e um potencial composto tensioactivo, o 8-hidroxi-tridecanoato de dietilenoglicolglicerilacetato. A fracção MeLMW foi também isolada da espuma do vinho espumante e caracterizada por ESI-MS/MS, permitindo identificar vários compostos potenciais tensioactivos, nomeadamente, dois monoacilgliceróis e quatro derivados de ácidos gordos com gliceriletilenoglicol. Estes resultados confirmam que estes compostos relacionados com a estabilidade da espuma existem em maior número na espuma do que no vinho. O vinho foi ainda fraccionado em 12 grupos de moléculas: 3 fracções de manoproteínas, 3 de arabinogalactanas, 3 de misturas de polissacarídeos, proteínas e compostos fenólicos e 3 fracções de peso molecular intermédio e baixo, compostas por uma mistura de hidratos de carbono, peptídeos e compostos fenólicos. Foram usados vinhos modelo reconstituídos com cada uma das fracções isoladas na concentração em que estas se encontraram no vinho. Foram também efectuados ensaios com soluções modelo dez vezes mais concentradas e com misturas de algumas das fracções. Todas as soluções formadas foram avaliadas quanto às propriedades da espuma. O aumento da concentração para dez vezes faz com que a solução contendo a fracção rica em manoproteínas (MP1) aumente para mais do dobro a HM e 7,4 vezes mais o TS. A combinação entre a fracção MP1 e a MeLMW produziu um aumento significativo nos parâmetros de HM e TS. A combinação da fracção HMW (manoproteínas com baixo teor em proteína) com a MeLMW (tensioactivos derivados de ácidos gordos com gliceriletilenoglicol) contém os compostos chave de um vinho espumante para se obter uma maior quantidade e estabilidade da espuma.

Molecular diversity and transferability of integrons from wastewaters

Na evolução bacteriana, a capacidade de explorar novos ambientes e de responder a diferentes pressões selectivas deve-se principalmente à aquisição de novos genes por transferência horizontal. Integrões são elementos genéticos bacterianos que constituem sistemas naturais de captura e expressão de cassetes de genes, sendo um dos principais mecanismos bacterianos envolvidos na aquisição de resistências a antibióticos. Estudos recentes suportam a hipótese de que os ambientes naturais constituem importantes reservatórios de integrões e cassetes de genes. Uma vez que as águas residuais são descarregadas em receptores naturais, torna-se fundamental conhecer a presença e dispersão de integrões nestes ambientes, assim como a sua associação a outros elementos genéticos móveis e a genes de resistências a antibióticos. Neste trabalho, pretendeu-se avaliar a prevalência e diversidade de integrões em águas residuais de origem animal e doméstica, bem como a sua associação a plasmídeos conjugativos, usando metodologias dependentes e independentes do cultivo de microrganismos em laboratório. Os resultados obtidos sustentam assim a hipótese de que ambientes particularmente ricos em matéria orgânica, como é o caso das águas residuais, constituem ambientes propícios à presença de integrões e à ocorrência de transferência horizontal de genes de resistência a antibióticos, embora a sua prevalência e diversidade seja influenciada pelo tipo de efluente em questão. A presença de integrões em estações de tratamento de águas residuais, e em especial nos efluentes tratados, constitui assim um factor preocupante, uma vez que tal contribui para a sua disseminação e dispersão por outros ecossistemas aquáticos, nomeadamente rios e mares. Os métodos utilizados permitiram também detectar uma elevada diversidade de cassetes de genes associadas a integrões, sendo possível que algumas dessas sequências codifiquem para proteínas que desempenhem um importante papel na adaptação bacteriana às intensas pressões selectivas características deste tipo de ambientes. Assim, é possível concluir que as comunidades bacterianas presentes em águas residuais reúnem diferentes tipos de elementos geneticamente móveis que desempenham um importante papel não só na adaptação bacteriana, mas também na disseminação de determinantes genéticos de resistência para ambientes naturais. Adicionalmente, a presença de potenciais proteínas com possíveis aplicações biotecnológicas reforça a importância das águas residuais como fontes de diversidade funcional. Este trabalho incluiu também a criação e implementação da base de dados INTEGRALL, desenvolvida com o intuito de congregar informação acerca de integrões e de uniformizar a nomenclatura de cassetes de genes.

Aluminium toxicity in wheat and rye

Com o presente trabalho pretendeu-se determinar e compreender melhor quais os alvos do Alumínio (Al) nas plantas, e contribuir para um melhor entendimento dos mecanismos de tolerância presentes em genótipos com elevado grau de tolerância ao Al. O Al é um dos maiores constituintes do solo e torna-se biodisponível em solos com baixo pH. Nesses casos, a exposição ao Al afecta negativamente o crescimento das plantas conduzindo a uma diminuição da produção. Estes factos são especialmente visíveis nos cereais, sendo a exposição ao Al uma das principais causas das quebras de produção nestas espécies. O Capítulo I consiste numa revisão geral sobre a toxicidade do Al nas plantas, apontando os seus principais alvos. Apresenta também os mecanismos de resistência, que inclui Al-destoxificação externa e interna, em diferentes espécies. O Capítulo II aborda os estudos sobre a exposição de curto prazo ao Al em duas espécies de cereais: Triticum aestivum L. e Secale cereale L., tendo-se sempre utilizado um genótipo Al-tolerante e um Al-sensível para cada espécie. Este capítulo está dividido em três estudos: no Capítulo II.1 realça-se o efeito da exposição a 185 μM de Al no equilíbrio nutricional em trigo. Verificou-se que em ambos os genótipos (sensível e tolerante) o perfil de macro e micro nutrientes se alterou, tendo uma interferência negativa, sobretudo no nível de P, Mg e K. Além disso, registaram-se diferenças na diferenciação da endoderme consoante o grau de tolerância/sensibilidade do genótipo. No Capítulo II.2 apresenta-se uma visão mais abrangente dos efeitos da exposição a 185 μM de Al em trigo, incluindo parâmetros fisiológicos, estruturais, citológicos e genotóxicos. Demonstra-se, pela primeira vez, que a progressão do ciclo celular é diferentemente regulada, dependendo da tolerância/sensibilidade do genótipo e que, mesmo em zonas já diferenciadas da raiz a exposição ao Al leva à deposição de calose. O Capítulo II.3 aborda os efeitos da exposição de 1.1 mM de Al em centeio, numa perspectiva bastante alargada. Apresenta-se o desequilíbrio nutricional, sobretudo no genótipo sensível, assim como a translocação de Al para a parte aérea nesse mesmo genótipo. Analisa-se também o comportamento de ambos os genótipos no que se refere ao ciclo celular, diferenciação da endoderme, crescimento radicular, reservas de hidratos de carbono, entre outros. Os resultados apontam para estratégias bem definidas adoptadas pelo genótipo tolerante de forma a minimizar a acção do Al no sistema radicular. O Capítulo III compreende a exposição longa ao Al. Dois genótipos de centeio com diferentes graus de tolerância ao Al foram expostos a 1.11 mM e 1.85 mM de Al durante 21 dias, tendo sido usados dois pontos de amostragem (15 e 21 dias). Este capítulo está dividido em dois estudos: No Capítulo III. 1 analisamse os mecanismos antioxidantes (folhas e raízes) como resposta à exposição ao Al, dando-se especial atenção ao ciclo do ascorbato-glutationas. A exposição ao Al levou a stress oxidativo e a alterações na actividade de enzimas antioxidantes e no conteúdo de antioxidantes não-enzimáticos. Demonstra-se que os dois órgãos apresentam respostas diferentes à exposição ao Al e que a capacidade de sobreviver em ambientes ricos em Al depende da eficácia da resposta antioxidante. Para além disso, a resposta do ciclo ascorbato-glutationas parece estar dependente do tipo de órgão, grau de tolerância e do tempo de exposição ao Al. No Capítulo III. 2 analisam-se os efeitos da exposição ao Al na fotossíntese. Verificou-se que o Al afecta negativamente a taxa fotossintética em ambos os genótipos, embora as alterações que o Al provoca nas trocas gasosas e no Ciclo de Calvin sejam dependentes do genótipo. Verificou-se também que os danos no genótipo sensível surgem mais cedo do que no genótipo tolerante, mas que ambos apresentam susceptibilidade ao Al após exposição de longo termo. Por fim, no Capítulo IV são apresentadas as conclusões da Tese de Doutoramento.

Promover a qualidade de cuidados de enfermagem a idosos dependentes

A investigação tem demonstrado que os enfermeiros tendem a interagir menos e a centrarem-se mais em cuidados físicos na prestação de cuidados a idosos dependentes, confusos e/ou desorientados. Contudo a literatura em enfermagem demonstra que a interacção social com pacientes dependentes é importante, pois permite melhoria da sua situação clínica e melhor reintegração. Este estudo exploratório procura contribuir para compreender melhor como se pode promover a qualidade dos cuidados de enfermagem a idosos dependentes em três contextos: hospital, cuidados continuados e em centro de saúde (domiciliares). Procura-se contribuir para a sensibilização e formação de enfermeiros na prestação de cuidados de qualidade a idosos dependentes e melhor definir cuidados relacionais a estas pessoas. Especificamente este estudo procura: i) identificar os cuidados de enfermagem a prestar aos pacientes idosos dependentes; ii) aprofundar o conhecimento sobre as dificuldades/obstáculos (emocionais, institucionais, relacionais, …) dos enfermeiros na promoção de uma relação de cuidados mais expressivos a idosos dependentes; iii) identificar factores que facilitam e dificultam a prestação de cuidados mais relacionais; iv) identificar modos de fomentar, sensibilizar e motivar os enfermeiros para a prestação de cuidados a pessoas idosas dependentes. A metodologia adoptada neste estudo é o PhotoVoice, aplicado a 3 grupos de enfermeiros que prestam cuidados a idosos dependentes em 3 contextos: hospital; comunidade (centro de saúde); cuidados continuados. Assim, abrangem-se os três principais contextos em que o idoso dependente pode estar inserido e o enfermeiro presta cuidados. A amostra envolve 12 enfermeiros (3 de contexto hospitalar, 3 de cuidados continuados e 6 de centro de saúde), com idades entre os 22 e 43 anos, 10 do sexo feminino. Os principais resultados sugerem que a promoção dos cuidados de enfermagem a pessoas idosas dependentes envolve: i) trabalho e decisão em equipa multidisciplinar; ii) mais recursos materiais e humanos; iii) melhores condições físicas e formação adequada. Paralelamente, o principal obstáculo à prestação de cuidados de enfermagem de qualidade nos três contextos centra-se na escassez de recursos e na desorganização, que se traduzem em falta de tempo, desordem e frustração. Além disso, os participantes salientam a importância do envolvimento da família, considerada parte da unidade de cuidado.

Aplicações das redes de Bragg na biomecânica

O presente trabalho tem como objectivo o estudo, desenvolvimento e aplicações na área da biomecânica de sensores intrínsecos baseados em redes de Bragg em fibras ópticas (FBG). As aplicações são feitas em modelos biomecânicos in vitro tais como: implantes de anca, prótese de joelho, placas de osteossíntese e implantes dentários. A optimização do desenvolvimento de próteses e respectivos elementos de fixação é actualmente dependente da geração e validação experimental de seus modelos computacionais. A validação destes modelos é normalmente feita utilizando-se dados de ensaios não invasivos e invasivos em modelos sintéticos. Em ensaios in vitro os sensores convencionais têm um princípio de funcionamento eléctrico e apresentam por vezes dimensões inadequadas. Existem situações exploradas no presente trabalho, tais como sensoriamento de superfícies irregulares e junções ou ainda análises de deformações internas, onde é recomendável a utilização de sensores FBG, pois apresentam dimensões reduzidas e flexibilidade o que permite efectuar medidas localizadas. O desenvolvimento de um protocolo de utilização de FBG e a sua aplicação no contexto apresentado demonstrou-se mais adequado, pela precisão e segurança futura oferecidas. Foi desenvolvida uma metodologia experimental para medidas de deformações utilizando FBG ao longo de uma placa de osteossíntese metálica aparafusada a um fémur sintético fracturado. Foi efectuada a monitorização da cura do cimento ósseo utilizado como fixador do prato tibial na artroplastia total do joelho através da medida da sua contracção e temperatura. Foi também desenvolvido um sistema refrigerador com resposta às leituras de temperatura com vista a evitar a necrose do osso. Foram efectuados estudos de deformação nesse cimento após a sua cura, como resultado da aplicação de cargas mecânicas estáticas. Foram efectuados estudos da cura de cimento ósseo aplicado a próteses de anca e também de deformações nestas próteses. Foi ainda efectuado o estudo comparativo de vários implantes dentários através da medida da distribuição de deformações como resposta a excitações mecânicas impulsivas. Para a desmodulação das FBG foram inicialmente utilizados sistemas comerciais. Entretanto algumas aplicações não puderam ser implementadas com estes sistemas comerciais devido à baixa reflectividade das FBG utilizadas, mas fundamentalmente devido à necessidade de executar testes com uma taxa de aquisição maior do que os 5 Hz disponíveis (cerca de 15 kHz). Por estes motivos foi desenvolvido um sistema optoelectrónico completo de desmodulação de FBG baseado num filtro sintonizável e que tem como característica principal a alta taxa de aquisição (até 1,2 MHz) mas também se destaca pela facilidade na reconfiguração dos parâmetros de leitura, pela apresentação duma interface de utilizador amigável e pela capacidade de operar com até 5 FBG na mesma fibra óptica.

Pancreatic zymogen granules: new proteins in unexpected places

Os mecanismos de biogénese, distribuição apical e secreção regulada de enzimas digestivas dos grânulos de zimogénio são, atualmente, pouco conhecidos. De modo a esclarecer e descrever estes processos de elevada importância biológica e clínica, é necessária uma melhor compreensão dos componentes da membrana granular e as funções e interações destes. Neste trabalho, através de uma abordagem proteómica, foi possível identificar novas proteínas granulares previamente associadas ao transporte vesicular sináptico. Para estudar as funções destas proteínas na génese e secreção de grânulos, foram realizados estudos de sobre-expressão, assim como estudos bioquímicos (1D, 2D, and LC-MS/MS) e morfológicos, utilizando céluas de mamífero. Entre as proteínas descobertas, cinco foram selecionadas e analisadas: RMCP-1, Piccolo, Synaptojanin-1, APP e ZG16p. Destas proteínas, confirmou-se a presença da RMCP-1 e APP nos grânulos de zimogénio. Interessantamente, o lectin ZG16p da secreção pâncreatico, encontra-se expressa no cérebro de rato, estando localizada nos terminais pós-sinápticos e em grânulos de RNA, indicando uma possível função desta proteína na formação das vesículas sinápticas. Finalmente, demonstrei que a formação de grânulos de zimogénio pode ser modulada, no modelo de células pancreáticas AR42J, pelas condições de cultura. Em contraste com as proteínas de carga neuroendocrinas, a sobreexpressão de proteínas de carga ou da membrana dos grânulos de zimogénio não foi suficiente para induzir a formação de grânulos ou de estruturas granulares em células constitutivamente secretoras, indicando diferenças na biogénese de grânulos neuroendócrinos e exócrinos.

Analytical methods to study fate of organic pollutants in environment

Environmental transport of pollutants comprises distinct processes such as volatilization, leaching and surface runoff. Sorption is one of the most important phenomena that affects leaching, and thus the fate of hydrophobic organic pollutants in soils and also control their distribution in the soil/water environment. The work developed focuses the optimization of analytical techniques for monitoring the sorption behaviour of organic pollutants, 17α- ethinylestradiol (EE2) and atrazine, and their fate in aqueous environment. Initially, the development of several analytical techniques, such as micellar electrokinetic chromatography, spectral deconvolution, using UV-Vis and fluorescence spectroscopy, and also enzyme linked immunosorbent assay was performed. Optimization, method performance and recovery tests are described and results discussed. Moreover, in order to evaluate the applicability of the previously optimized method, atrazine and EE2 sorption to soil samples was performed. The work developed provide several options, in terms of methodology to follow sorption of atrazine onto soils, however the choice depends on the laboratory conditions and on the analyst preferences. The advantages and disadvantages of each methodology should be evaluated first. The second part of this work consisted in the sorption behaviour study of those two different hydrophobic organic pollutants onto different soil samples. Soil organic matter chemical characterization, being essential to understand the binding mechanism responsible for the interactions, was made. The results of atrazine binding to organic matter pointed out that carboxyl units and aromaticrich organic matter are the most efficient binding agents for atrazine. EE2 adsorbs strongly to soil organic matter and is mainly stabilized by hydrophobic interactions, through aromatic nuclei face to face with surface and/or another EE2 molecule association. Farmyard manure soil contains higher aromatic and carboxyl units, indicating that this type of manure can be effectively used to minimize the residual toxicity of EE2 and atrazine present in soils, increasing the sorption and reducing leaching onto water resources. Since the final destination of organic pollutants can be ground, surface and/or waste water, atrazine and 17α-ethinylestradiol were quantified in several water samples.

Molecular reconstruction of a genetic code alteration

The genetic code establishes the rules that govern gene translation into proteins. It was established more than 3.5 billion years ago and it is one of the most conserved features of life. Despite this, several alterations to the standard genetic code have been discovered in both prokaryotes and eukaryotes, namely in the fungal CTG clade where a unique seryl transfer RNA (tRNACAG Ser) decodes leucine CUG codons as serine. This tRNACAG Ser appeared 272±25 million years ago through insertion of an adenosine in the middle position of the anticodon of a tRNACGA Ser gene, which changed its anticodon from 5´-CGA-3´ to 5´-CAG-3´. This most dramatic genetic event restructured the proteome of the CTG clade species, but it is not yet clear how and why such deleterious genetic event was selected and became fixed in those fungal genomes. In this study we have attempted to shed new light on the evolution of this fungal genetic code alteration by reconstructing its evolutionary pathway in vivo in the yeast Saccharomyces cerevisiae. For this, we have expressed wild type and mutant versions of the C. albicans tRNACGA Ser gene into S. cerevisiae and evaluated the impact of the mutant tRNACGA Ser on fitness, tRNA stability, translation efficiency and aminoacylation kinetics. Our data demonstrate that these mutants are expressed and misincorporate Ser at CUGs, but their expression is repressed through an unknown molecular mechanism. We further demonstrate, using in vivo forced evolution methodologies, that the tRNACAG Ser can be easily inactivated through natural mutations that prevent its recognition by the seryl-tRNA synthetase. The overall data show that repression of expression of the mistranslating tRNACAG Ser played a critical role on the evolution of CUG reassignment from Leu to Ser. In order to better understand the evolution of natural genetic code alterations, we have also engineered partial reassignment of various codons in yeast. The data confirmed that genetic code ambiguity affects fitness, induces protein aggregation, interferes with the cell cycle and results in nuclear and morphologic alterations, genome instability and gene expression deregulation. Interestingly, it also generates phenotypic variability and phenotypes that confer growth advantages in certain environmental conditions. This study provides strong evidence for direct and critical roles of the environment on the evolution of genetic code alterations.

Embryonic and larval ecology and biochemistry of offshore decapods

Understanding the biology of offshore species is hardened by the difficulties of sampling in the deep-sea environment. Additionally, due to the vastness of the open ocean, knowledge of early life histories of pelagic larvae is still relatively scarce. In decapod species with bentho-pelagic lifestyle, the transition from life in the seafloor to the water column not only is associated with drastic morphological metamorphosis, but also with changes in behavior and feeding ecology. The purpose of the present thesis was to investigate physiological, biochemical and behavioral adaptation occurring during early development of such species. The Norway lobster, Nephrops norvegicus, and the crab Monodaeus couchi were used as a model as these two species are encountered off the NE Atlantic shelf at depth greater than 300 m. Chapter 1 introduces the challenges faced by both adult and larvae inhabiting such remote habitats, including the effect of food availability on development and oceanographic processes on dispersal and recruitment. The thesis follows early life histories, starting with within-brood variability in the fatty acid (FA) profile displayed by developing N. norvegicus embryos. There were no differences in the FA composition of embryos sampled from both sides of the brooding chamber in most females. However, all females exhibited significant differences in the FA profiles of embryos sampled from different pleopods. Potential causes for the variations recorded may be differential female investment during oocyte production or shifts in FA catabolism during the incubation period promoted by embryo’s location within the brooding chamber. Next, feeding rates and digestive enzymes activity of the early stage larvae was investigated in N. norvegicus. Both stages were able to maximize food intake when larvae were scarce and showed increased feeding rate following periods of starvation. Amylase activity indicated that carbohydrates are not the primary energy reserve and that feeding may be required soon after hatching to trigger amylase activity. Protease activity indicated that protein reserves are catabolized under starvation. These results indicate that larvae may maximize prey ingestion in the presence of plankton patches with higher food abundance and minimize the deleterious effects induced by previous periods of intermittent starvation or unsuitable prey densities/types. Additionally, changes in enzymatic activity may allow newly hatched N. norvegicus larvae to metabolize protein reserves to overcome short-term starvation. Vertical migration behavior and the influence of oceanographic properties were studied next. All zoeal stages of M. couchi displayed reverse diel vertical migration. Abundance of early stages was correlated with chlorophyll a levels. An ontogenic shift in vertical distribution explained the results; earlier zoeal stages remain in the food-rich upper water column while later stages migrate to the bottom for settlement. This vertical migration behavior is likely to affect horizontal distribution of larvae. Indeed, global current patterns will result in low inter-annual variations in decapod larvae recruitment, but short term variations such as upwelling events will cause deviation from the expected dispersal pattern. Throughout development, from the embryo to metamorphosis into benthic juvenile, offshore decapods face many challenges. For the developing individual survivorship will depend heavily on food availability but also on the reserves passed on by the mother. Even though vertical migration behavior can allow the larvae to take advantage of depth varying currents for transport, the effect of general circulation pattern will superimpose local current and influence feeding conditions and affect dispersal and recruitment.

Métodos químicos de modificação superficial de nanomateriais

O objectivo geral desta tese foi investigar diversas estratégias de síntese de nanocompósitos híbridos de matriz polimérica, contendo nanopartículas inorgânicas com funcionalidades diversas. O interesse nestes nanocompósitos multifuncionais consiste no enorme potencial que apresentam para novas aplicações tecnológicas, tais como em optoelectrónica ou em medicina. No capítulo introdutório, apresenta-se uma revisão das propriedades de nanopartículas inorgânicas e nanoestruturas obtidas a partir destas, métodos de preparação e de modificação química superficial, incluindo a formação de nanocompósitos poliméricos, bem como a aplicação destas nanoestruturas em medicina e biologia. O estudo das propriedades de nanopartículas de ouro é um importante tema em Nanociência e Nanotecnologia. As propriedades singulares destas NPs apresentam uma estreita relação com o tamanho, morfologia, arranjo espacial e propriedades dieléctricas do meio circundante. No capítulo 2, é reportada a preparação de nanocompósitos utilizando miniemulsões de poli-estireno (PS) e poli-acrilato de butilo (PBA) contendo nanopartículas de ouro revestidas com moléculas orgânicas. As propriedades ópticas destas estruturas híbridas são dominadas por efeitos plasmónicos e dependem de uma forma crítica na morfologia final dos nanocompósitos. Em particular, demonstra-se aqui a possibilidade de ajustar a resposta óptica, na região do visível do espectro, através do arranjo das nanopartículas na matriz polimérica, e consequentemente o acoplamento plasmónico, utilizando nanopartículas resultantes da mesma síntese. Na generalidade, é reportada aqui uma estratégia alternativa para modificar a resposta óptica de nanocompósitos, através do controlo da morfologia do compósito final face à estratégia mais comum que envolve o controlo das características morfológicas das partículas metálicas utilizadas como materiais de partida. No Capítulo 3 apresentam-se os resultados da preparação de vários compósitos poliméricos com propriedades magnéticas de interesse prático. Em particular discute-se a síntese e propriedades magnéticas de nanopartículas de ligas metálicas de cobalto-platina (CoPt3) e ferro-platina (FePt3), assim como de óxidos de ferro (magnetite Fe3O4 e maguemite g-Fe2O3) e respectivos nanocompósitos poliméricos. A estratégia aqui descrita constitui uma via interessante de desenvolver materiais nanocompósitos com potencial aplicação em ensaios de análise de entidades biológicas in vitro, que pode ser estendido a outros materiais magnéticos. Como prova de conceito, demonstrase a bioconjugação de nanocompósitos de CoPt3/PtBA com anticorpos IgG de bovino. No capítulo 4 é descrita a preparação e propriedades ópticas de pontos quânticos (“quantum dots”, QDs) de CdSe/ZnS assim como dos seus materiais nanocompósitos poliméricos, CdSe/ZnS-PBA. Como resultado das suas propriedades ópticas singulares, os QDs têm sido extensivamente investigados como materiais inorgânicos para aplicações em dispositivos ópticos. A incorporação de QDs em matrizes poliméricas é de particular interesse, nomeadamente devido ao comportamento óptico do nanocompósito final parecer estar dependente do tipo de polímero utilizado. As propriedades ópticas dos nanocompósitos foram estudadas sistematicamente por medidas de fotoluminescência. Os nanocompósitos apresentam propriedades interessantes para potenciais aplicações biológicas em diagnóstico in vitro, funcionando como sondas biológicas luminescentes.