Efeitos da toxicidade por metais pesados em Rhizobium leguminosarum bv. trifolii: diversidade e resposta de população isoladas de uma mina de chumbo

Nas últimas décadas verificou-se um aumento da contaminação dos solos com metais pesados resultante de processos antropogénicos. As descargas de efluentes industriais, a actividade mineira e a aplicação de lamas residuais e de fertilizantes são as principais fontes de metais pesados. Em certas regiões, a acumulação destes elementos nos solos tem atingido níveis preocupantes para o equilíbrio dos ecossistemas. Vários estudos têm demonstrado que os metais influenciam os microrganismos afectando adversamente o seu crescimento, morfologia e actividades bioquímicas resultando num decréscimo da biomassa e diversidade. Entre os microrganismos do solo, as bactérias pertencentes ao género Rhizobium têm um elevado interesse científico, económico e ecológico devido à sua capacidade para fixar azoto. Deste modo, o trabalho desenvolvido ao longo desta tese incidiu sobre o efeito da toxicidade imposta pelos metais nas bactérias fixadoras de azoto, em particular em Rhizobium leguminosarum bv. trifolii e teve como principais objectivos: determinar o efeito dos metais pesados na sobrevivência e na capacidade de fixar azoto dos isolados de rizóbio; avaliar a influência dos metais na diversidade das populações de rizóbio isoladas de solos contaminados; determinar os níveis de tolerância do rizóbio a diferentes metais e analisar a resposta ao stresse oxidativo imposto pelo cádmio. A Mina do Braçal foi o local de estudo escolhido uma vez que os seus solos estão muito contaminados com metais em resultado da extracção de minério durante mais de 100 anos. Foram escolhidos 3 solos com diferentes graus de contaminação, o solo BC com concentrações reduzidas de metais, escolhido por estar numa zona já fora da mina e designado por solo controlo e os solos BD e BA considerados medianamente e muito contaminados, respectivamente. O Pb e o Cd foram os metais predominantes nestes solos, assim como o metalóide As, cujas concentrações ultrapassaram largamente os limites previstos na lei. Sendo as enzimas do solo boas indicadoras da qualidade do mesmo, foi determinada a actividade de algumas como a desidrogenase (DHA) e a catalase (CAT). Ambas as enzimas correlacionaramse negativamente com as concentrações de metais nos solos. A dimensão das populações indígenas de rizóbio nos solos contaminados (BD e BA) foi bastante baixa, 9,1 bactérias g-1 de solo e 7,3 bactérias g-1 de solo, respectivamente, quando em comparação com a população do solo BC (4,24x104 bactérias g-1 de solo). Estes resultados parecem estar relacionados com o elevado conteúdo em metais e com o pH ácido dos solos. A capacidade simbiótica também foi afectada pela presença de metais, uma vez que os isolados originários do solo BD mostraram menor capacidade em fixar azoto do que os isolados do solo controlo. A diversidade das populações de rizóbio foi determinada com recurso à análise dos perfis de plasmídeos, perfis de REP e ERIC-PCR de DNA genómico e perfis de proteínas e lipopolissacarídeos. No conjunto dos 35 isolados analisados foram identificados 11 plasmídeos com pesos moleculares entre 669 kb e 56 kb. Embora a incidência de plasmídeos tenha sido superior nos isolados do solo BC verificou-se maior diversidade plasmídica na população isolada do solo BD. Resultados similares foram obtidos com os perfis de REP e ERIC-PCR e perfis de proteínas, que indicaram maior diversidade nas populações dos solos contaminados (BD e BA), contrariamente ao verificado por outros autores. O grau de tolerância aos metais pesados e ao arsénio dos vários isolados testados dependeu do metal e do local de origem. No geral, os isolados do solo BD mostraram maior tolerância aos metais do que os isolados do solo controlo, o que está de acordo com o esperado uma vez que geralmente as populações dos locais contaminados são mais tolerantes. Contudo, os isolados do local mais contaminado (BA) foram muito tolerantes apenas ao chumbo mostrando-se sensíveis aos restantes metais. A inoculação dos solos BC, BD e BA após irradiação com estirpes seleccionadas de rizóbio permitiu avaliar a sua sobrevivência ao longo de 12 meses em condições mais realistas. Verificou-se que após um decréscimo inicial, os isolados inoculados no solo BC conseguiram recuperar a dimensão das suas populações para números similares aos inicialmente introduzidos, contrariamente ao verificado no solo BD onde o número de rizóbios decresceu ao longo dos 12 meses. As condições adversas do solo BA apenas permitiram a sobrevivência de 4 isolados até aos 3 meses e apenas dois deles conseguiram sobreviver após 12 meses, designadamente C 3-1 e A 17-3. Estes isolados possuem um plasmídeo de 669 kb que poderá estar na base da sobrevivência destas estirpes. Por outro lado, o último isolado é originário do solo contaminado e por isso estará também mais adaptado a sobreviver às elevadas concentrações de Pb existentes no solo BA. Por fim, constatou-se que o cádmio, um dos metais presente em concentrações mais elevadas nos solos em estudo, é um indutor de stresse oxidativo nos isolados de rizóbio menos tolerantes o que foi confirmado pelo aumento de ROS e danos celulares ao nível dos lípidos.

In the last decades, an increased in soil metal contamination, resulting from anthropogenic processes has been observed. Industrial effluent discharges, mining activities and the applications of industrial sludge and fertilizers are the main sources of heavy metal contamination. In some regions, the build-up of these elements has been reaching disturbing levels that may threaten the ecosystem’s equilibrium. Several studies showed that metals can influence microorganisms, adversely affecting their growth, morphology and biochemical activities, hence resulting in a decrease in biomass and diversity. Among soil microorganisms, bacteria from the genus Rhizobium have a high scientific, economical and ecological interest, due to their ability to fix nitrogen. Under this context, the work developed throughout this thesis focused on the effects of metal toxicity on nitrogen fixation bacteria, particularly in Rhizobium leguminosarum bv. trifolii and had the following goals: to determine the effect of heavy metals on the survival and nitrogen fixing abilities of rhizobia, evaluate the influence of heavy metals in the diversity of Rhizobium populations isolated from contaminated soils, to determine the levels of tolerance to different metals and to analyze the response to the oxidative stress imposed by cadmium. Braçal mine was the chosen study location, since their soils are very contaminated with metals as a result of the mining extractions undertaken during over 100 years. Three soils with different degrees of contamination were chosen, BC soil, with reduced metal contamination, collected from the periphery of the mine and considered the control soil and BD and BA soils, with median and high metal contamination, respectively. Pb and Cd were the predominant metals in these soils, as well as the metalloid As, that presented concentrations high above the limits predicted by law. Since soil enzymes are good indicators of soil quality, the activity of some enzymes such as desidrogenase (DHA) and catalase (CAT) were studied. Both enzymes were negatively correlated with soil metal concentrations. The dimension of Rhizobium indigenous populations in the contaminated soils (BD and BA) was very low, 9.1 bacteria g-1 soil and 7.3 bacteria g-1soil, respectively, in comparison to BC soil (4.24x104 bacteria g-1 soil). These results seem to be related to the high metal content and the acid pH of soils. The symbiotic ability was also affected by metal contamination, since the isolates from BD soils showed a lower ability to fix nitrogen when compared to controls. The diversity of Rhizobium populations was determined with plasmid profile analysis, REP and ERIC-PCR from genomic DNA and protein and lipopolysaccharide profiles. From the 35 analyzed isolates, 11 plasmids were identified, with molecular weights ranging from 669 and 56 kb. Although plasmid incidence was higher on BC soils isolates, higher plasmid diversity was observed in BD isolates. Similar results were obtained with REP and ERIC-PCR and protein profiles which indicated a higher diversity of populations isolated from the contaminated soils (BD and BA), which was contrary to results observed by other authors. Isolate metal tolerance levels was dependent on the metal and strain origin. Generally, isolates from BD soils showed higher metal tolerance than control isolates, as was expected, since populations from contaminated soils usually present higher tolerance. Nonetheless, the isolates from the most contaminated soil (BA) presented higher tolerance to Pb but high sensitivity to the other metals. The inoculation of soils BC, BD and BA after irradiation, with selected Rhizobium strains allowed us to evaluate their survival throughout 12 months in more realistic conditions. It was observed that after an initial decrease, isolates from BC soils were able to recover the size of their populations the initial population sizes, unlike BD soils, where the number of Rhizobium cells decreased throughout the 12 months. The adverse conditions in BA soils only allowed the survival of 4 isolates up to 3 months and only two were able to survive the 12 months (C 3-1 and A 17-3). These isolates presented a 669 kb plasmid that could be the basis of these strain’s survival. Moreover, the strain A17-3 was isolated from the contaminated soil and for this reason could be more adapted and survive to high concentrations of Pb presented in BA soil. Finally, it was observed that cadmium, one of the metals presented in higher concentrations in soils, is an inducer of oxidative stress in the less tolerant Rhizobium isolates, which was confirmed by ROS increase and lipid cellular damage.

Doutoramento em Biologia

FCT/FSE - SFRH/BD/18843/2004

SFRH/BD/18843/2004