Entwicklung, Aufbau und Charakterisierung eines neuartigen Ionenfallen-Massenspektrometers für Aerosolpartikel (AIMS)

Im Rahmen der Arbeit wurde ein neuartiges Aerosol-Ionenfallen-Massenspektrometer (AIMS) aufgebaut und umfassend charakterisiert. Mit dem AIMS kann die chemische Zusammensetzung der verdampfbaren Komponente (bei etwa 600 °C) von Aerosolpartikeln quantitativ und on-line bestimmt werden. Die Durchmesser der Teilchen, die analysiert werden können, liegen zwischen etwa 30 und 500 nm. Der experimentelle Aufbau greift auf ein bereits gut charakterisiertes Einlasssystem des Aerodyne Aerosol-Massenspektrometers (AMS) zurück, das einen Partikeleinlass, bestehend aus einer kritischen Düse und einer aerodynamischen Linse, einen Verdampfer für die Aerosolteilchen und eine Elektronenstoß-Ionenquelle enthält. Das kommerzielle AMS verwendet entweder ein lineares Quadrupol-Massenfilter (Q-AMS) oder ein Flugzeit-Massenspektrometer (ToF-AMS). Im AIMS hingegen wird eine dreidimensionale Ionenfalle als Massenanalysator eingesetzt. Dadurch eröffnen sich unter anderem Möglichkeiten zur Durchführung von MSn-Studien und Ionen/Molekül-Reaktionsstudien. Das Massenspektrometer und wichtige Teile der Steuerungselektronik wurden am Max-Planck-Institut für Chemie in Mainz entworfen und hergestellt. Das AIMS wird von einem PC und einer Software, die in der Programmiersprache LabVIEW verfasst ist, gesteuert. Aufgrund seiner Kompaktheit ist das Instrument auch für den Feldeinsatz geeignet. Mit der Software Simion 7.0 wurden umfangreiche Simulationsstudien durchgeführt. Diese Studien beinhalten Simulationen zur Ermittlung der optimalen Spannungseinstellungen für den Ionentransfer von der Ionenquelle in die Ionenfalle und eine Abschätzung der Sammeleffizienz der Ionenfalle, die gut mit einem gemessenen Wert übereinstimmt. Charakterisierungsstudien zeigen einige instrumentelle Merkmale des AIMS auf. Es wurde beispielsweise ein Massenauflösungsvermögen von 807 für m/z 121 gefunden, wenn eine Analyserate von 1780 amu/s verwendet wird. Wird die Analyserate verringert, dann lässt sich das Massenauflösungsvermögen noch erheblich steigern. Bei m/z 43 kann dann ein Wert von > 1500 erzielt werden, wodurch sich Ionenfragmente wie C2H3O+ (m/z 43.0184) und C3H7+ (m/z 43.0548) voneinander trennen lassen. Der Massenbereich des AIMS lässt sich durch resonante Anregung erweitern; dies wurde bis zu einer Masse von 1000 amu getestet. Kalibrationsmessungen mit laborgenerierten Partikeln zeigen eine hervorragende Linearität zwischen gemessenen Signalstärken und erzeugten Aerosol-Massenkonzentrationen. Diese Studien belegen im Zusammenhang mit den gefundenen Nachweisgrenzen von Nitrat (0.16 μg/m³) und Sulfat (0.65 μg/m³) aus Aerosolpartikeln, dass das AIMS für quantitative Messungen von atmosphärischem Aerosol geeignet ist. Ein Vergleich zwischen dem AIMS und dem Q-AMS für Nitrat in städtischem Aerosol zeigt eine gute Übereinstimmung der gefundenen Messwerte. Für laborgenerierte Polystyren-Latexpartikel wurde eine MS/MS-Studie unter der Anwendung von collision induced dissociation (CID) durchgeführt. Das Verhältnis von Fragmentionen zu Analytionen wurde zu einem Wert von > 60% bestimmt. In der Zukunft können ähnliche MS/MS-Studien auch für atmosphärische Aerosolpartikel angewandt werden, wodurch sich neue Perspektiven für die Speziation von Aerosolbestandteilen eröffnen. Dann sollen vor allem Kondensationsprozesse, das heißt die Bildung von sekundärem Aerosol, detailliert untersucht werden.

Phylogeny and historical biogeography of the Australian Camphorosmeae (Chenopodiaceae)

Diese Studie befasst sich mit der Phylogenie und Biogeographie der australischen Camphorosmeae, die ein wichtiges Element der Flora arider Gebiete Australiens sind. Die molekularen Phylogenien wurden mit Hilfe Bayes’scher Statistik und „maximum likelihood”berechnet. Um das Alter der Gruppe und interner Linien abzuschätzen, wurden die Methoden „Nonparametric rate smoothing” und “penalized likelihood” benutzt. Morphologische Merkmale wurden nach Kriterien der Parsimonie auf den molekularen Baum aufgetragen. „Brooks parsimony analysis”, „cladistic analysis of distributions and endemism”, „dispersal-vicariance analysis”,„ancestral area analysis” und „weighted ancestral area analysis” wurden angewandt, um Abfolge und Richtungen der Ausbreitung der Gruppe in Australien zu analysieren.Von sieben getesteten Markern hatten nur die nukleären ETS und ITS genügend Variation für die phylogenetische Analyse der Camphorosmeae. Die plastidären Marker trnL-trnF spacer,trnP-psaJ spacer, rpS16 intron, rpL16 intron und trnS-trnG spacer zeigten kein ausreichendes phylogenetisches Signal. Die gefundenen phylogenetischen Hypothesen widersprechen der jetzigen Taxonomie der Gruppe. Neobassia, Threlkeldia, Osteocarpum und Enchylaena sollten den Gattungen Sclerolaena bzw. Maireana zugeordnet werden. Die kladistische Analyse der Fruchtanhängsel unterstützt die taxonomischen Ergebnisse der auf DNA basierenden Phylogenie. Allerdings hat die Behaarung, die bei anderen Gruppen der Chenopodiaceae als wichtiges taxonomisches Merkmal herangezogen wird, die Phylogenie nicht unterstützt. Vorfahren der heutigen Camphorosmeen sind im Miozän, vor ca. 8-14 Millionen Jahren, durch Fernausbreitung vermutlich aus Asien in Australien eingewandert. Anfängliche Diversifizierung fand während des späten Miozäns bis in das frühe Pliozän vor ca. 4-7 Millionen Jahren statt. Am Ende des Pliozäns existierten schon 45% - 72% der Abstammungslinien der jetzigen Camphorosmeen. Dies weist auf eine schnelle Ausbreitung hin. Das Alter stimmt mit dem Einsetzen der Aridisierung Australiens überein, und deutet darauf hin, dass die Ausbreitung der ariden Gebiete eine große Rolle bei der Diversifizierung der Gruppe spielte. Die Vorfahren der australischen Camphorosmeae scheinen die Südküste Australiens zuerst besiedeln zu haben. Dies geschah vor dem Einsetzen der Aridisierung des Kontinents. Die anschließende Ausbreitung erfolgte in verschiedene Richtungen und folgte der fortschreitenden Austrocknung im späten Tertiär und im ganzen Quartär. Durch ihre Anpassung an Trockenheit ist der Erfolg der Camphorosmeae in den ariden Gebieten zu erklären.Die Abwesenheit von klaren phylogenetischen und artspezifischen Signalen zwischen Arten der australischen Camphorosmeae ist auf das junge Alter und die schnelle Diversifizierung der Gruppe zurückzuführen, welche die Häufung von Mutationen und eine starke morphologische Differenzierung nicht zugelassen haben.

Identifizierung und interindividuelle Expressionsvariabilität der hepatischen Doxorubizin-Reduktase im Menschen

Die in dieser Arbeit beschriebenen Untersuchungen befassen sich mit der Identifizierung des haupt-metabolisierenden Enzyms für die Reaktion von dem Zytostatikum Doxorubizin zu dem Alkohol-Metaboliten Doxorubizinol in humanem Leberzytosol. Der Metabolismus dieser Reaktion wurde in einer humanen Leberbank analysiert, welcher eine große interindividuelle Variabilität zeigte. Da die maximale Umsatzrate häufig proportional zu der Expression des umsetzenden Enzyms in Leber ist, wurden in dieser Arbeit die Expressionsmuster der Kandidatenenzyme, verschiedene Carbonyl reduzierende Enzyme (AKRs und CBRs), ermittelt und des Weiteren der Umsatz von Doxorubizin zu Doxorubizinol in verschiedenen humanen Organen gemessen. Die metabolische Clearance der Reaktion als auch die Affinität zu Doxorubizin war am höchsten in Dünndarm, Leber und Niere, während die anderen Organe wesentlich geringere Werte zeigten. Dies steht im Einklang mit der prominenten Rolle dieser Organe in der Detoxifizierung von Fremdstoffen. Auch der Umsatz von Doxorubizin zu Doxorubizinol wurde von den verschiedenen Enzymen in sehr unterschiedlichem Maß katalysiert. AKR1C3 und CBR1 zeigten einen ausgeprägten Metabolismus von Doxorubizin während AKR1A1, AKR1B1, AKR1B10 und AKR1C4 nur geringen Maximalumsatz zeigten. Auch die Affinität von CBR1 und AKR1C3 zu Doxorubizin war wesentlich höher als die der anderen Enzyme. Inhibitoruntersuchungen zeigten weiterhin, dass ein spezifischer CBR1-Inhibitor die untersuchte Reaktion durch CBR1 als auch durch humanes Leberzytosol in gleichem Maße hemmte. Dieses Ergebnis deutet auf CBR1 als Haupt-Doxorubizin-Reduktase hin. Dies wurde in anfangs erwähnter humaner Leberbank weiter untersucht. Der Gehalt von CBR1-Protein wurde bestimmt und mit der gemessenen spezifischen Aktivität korreliert. Der Proteingehalt korrelierte mit der gemessenen spezifischen Aktivität in sechs von neun Western Blots. Dieses Ergebnis unterstützt die Vermutung, dass CBR1 als Haupt-Doxorubizin-Reduktase in humaner Leber betrachtet werden kann. Die Analyse des CBR1-Gens zeigte zwei Haplotypen, die einen signifikant verschiedenen Km-Wert zeigten als die übrigen Haplotypen. Diese Haplotypen konnten jedoch nur einen geringen Teil der Variabilität des Doxorubizin-Metabolismus erklären. Da aber ein starker interindividueller Doxorubizin-Metabolismus in humaner Leber beobachtet wird, deutet dies auf eine starke epigenetische Regulation des CBR1-Gens hin. Analysen der Promoterregion zeigten viele Bindungsstellen für Transkriptionsfaktoren; eine Aktivierung durch xenobiotische Substanzen kann vermutet werden. Der Metabolismus von Doxorubizin kann zu einer Deaktivierung des Medikaments und damit zu einer verminderten chemotherapeutischen Wirkung führen. Durch die Charakterisierung der humanen Doxorubizin-Reduktase in Leber ist die gezielte Suche nach Hemmstoffen für dieses Enzym möglich. Dies eröffnet die Möglichkeit, die Bildung von Doxorubizin zu Doxorubizinol zu verringern und die Inaktivierung der antineoplastischen Wirkung zu vermeiden. Eine Dosisverminderung und bessere Verträglichkeit des Medikaments kann erreicht, die schweren Nebenwirkungen reduziert werden. Die Identifizierung der verantwortlichen hepatischen Doxorubizin-Reduktase im Menschen kann somit einen wichtigen Beitrag leisten, die Krebstherapie in Zukunft verträglicher und nebenwirkungsfreier zu gestalten und Resistenzbildungen vorzubeugen.

Funktionelle Analyse der beiden Zinkfinger-Homöodomänentranskriptionsfaktoren Zfh-1 und Zfh-2 während der Entwicklung des Nervensystems von Drosophila melanogaster

Diese Arbeit charakterisiert die Funktion und das Expressionmuster der beiden Zinkfinger-Homöodomänentranskriptionsfaktoren zfh1 und zfh2 von Drosophila melanogaster. Das zfh2 Gen wurde hierbei vor allem molekular charakterisiert. Es wurden eine Vielzahl möglicher Spleißformen identifiziert, welche das regulatorische Potential von Zfh2 enorm erweitern. Für Überexpressionsexperimente wurde zudem erstmalig die cDNA des längsten zfh2-Transkriptes kloniert. Durch Analysen an zfh1 Mutanten konnte gezeigt werden, dass zfh1 sowohl notwendig ist für die embryonale Entwicklung von Motoneuronen, als auch das larvale Wachstum motoneuronaler Endplatten reguliert. Wegen weit reichender pleiotroper Effekte, die zfh1 Funktionsverlustmutanten haben, war es notwendig, neben dem Einsatz hypomorpher Allele auf die Analyse genetischer Mosaike auszuweichen. Die als MARCM-Technik (Lee und Luo, 1999) bezeichnete Methode zur Erzeugung genetischer Mosaike wurde modifiziert um in dieser Arbeit erstmals für die Analyse mutanter larvaler Motoneurone eingesetzt werden zu können. Weitergehend konnte gezeigt werden, dass Zfh1 notwendig ist für die larvale Expression des Neuropeptides FMRFamid. Anhand von Sequenzvergleichen und durch Verwendung eines fmrfamid-Promoterkonstruktes (Benveniste et al., 1998) konnten Hinweise dafür gesammelt werden, dass die Zfh1-abhängige Regulation sehr wahrscheinlich direkter Natur ist. Bei fmrfamid handelt es sich somit um das erste identifizierte neurale Zielgen von Zfh1, an dem sich zudem modellhaft der molekulare Wirkmechanismus von Zfh1 erforschen lässt.

Ausbreitung von Nitroaromaten über das Sickerwasser der ehemaligen Espagit AG in Hallschlag

Die in den Jahren 1915-1923 erfolgte Produktion von Sprengstoffen und Vernichtung von Munition am Rüstungsaltstandort Hallschlag (Eifel) führte zu einer Nitroaromatenbelastung des Bodens, die bis heute nachgewiesen werden kann. Im Rahmen vorliegender Studie wurde das Sickerwasser außerhalb des Schadensherdes über einen Zeitraum von rund zwei Jahren mit Saugkerzensystemen beprobt und auf Nitroaromaten untersucht. Weiterhin wurde die klimatische Wasserbilanz für den Standort berechnet und Pegeldaten einer im Rahmen der Standortsicherung errichteten Sickerwassersammelleitung ausgewertet. Mit Hilfe dieses Datenmaterials konnte die mittlere Nitroaromatenkonzentration im Sickerwasser innerhalb und außerhalb des Schadensherdes ermittelt und die im hydrologischen Jahr 2004 ausgetragene Nitroaromatenmenge abgeschätzt werden.

Modulation der Genexpression und des neuronalen Zelltods durch das Amyloid-Vorläufer-Protein (APP)

Das Amyloid-Vorläufer-Protein (APP) spielt eine zentrale Rolle in der Entstehung und Entwicklung von Morbus Alzheimer. Hierbei ist die proteolytische Prozessierung von APP von entscheidender Bedeutung. Das Verhältnis von neurotoxischen und neuroprotektiven Spaltprodukten, die über den amyloidogenen und nicht-amyloidogenen Weg der APP-Prozessierung gebildeten werden, ist für das Überleben von Neuronen und deren Resistenz gegen zytotoxische Stress-Stimuli von hoher Relevanz. Störungen der Calcium-Homöostase sind ein bekanntes Phänomen bei Morbus Alzheimer. Im ersten Teil der vorliegenden Arbeit wurde die Rolle von überexprimiertem APP in der Regulation des neuronalen Zelltods nach Calcium Freisetzung untersucht. Die Calcium Freisetzung aus dem endoplasmatischen Retikulum wurde durch die Inhibition der sarko- und endoplasmatischen Calcium-ATPasen (SERCA) ausgelöst. Dies führt zur Induktion der sogenannten „unfolded protein response“ (UPR) und zu einer Aktivierung von Effektor-Caspasen. Für APP-überexprimierende PC12 Zellen konnte bereits zuvor eine im Vergleich zur Kontrolle nach der durch Calcium Freisetzung-induzierten Apoptose eine erhöhte intrazelluläre Calcium Konzentration nachgewiesen werden. Über die Messung der Aktivierung von Effektor-Caspasen konnte zudem ein gesteigerter Zelltod in den APP-überexprimierenden Zellen gemessen werden. Zudem konnte gezeigt werden, dass der pro-apoptotische Transkriptionsfaktor CHOP, nicht aber die klassischen UPR-Zielgene spezifisch hochreguliert wurden. Die APP-modulierte gesteigerte Induktion von Apoptose nach Calcium Freisezung konnte durch Komplexierung der intrazellulären Calcium Ionen und durch Knockdown von CHOP im Vergleich zur Kontrolle gänzlich unterdrückt werden. Ferner bewirkte die Inhibition der Speicher-aktivierten Calcium-Kanälen (SOCC) eine signifikante Unterdrückung der beobachteten erhöhten intrazellulären Calcium Konzentration und der gesteigerten Apoptose in den APP-überexprimierenden PC12 Zellen. In diesem Teil der Arbeit konnte eindeutig gezeigt werden, dass APP in der Lage ist den durch Calcium-Freisetzung-induzierten Zelltod zu potenzieren. Diese Modulation durch APP verläuft in einer UPR-unabhängigen Reaktion über die Aktivierung von SOCC’s, einer erhöhten Aufnahme von extrazellulärem Calcium und durch erhöhte Induktion des pro-apoptotischen Transkriptionsfaktors CHOP. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde die sAPPα-vermittelte Neuroprotektion untersucht. Dabei handelt es sich um die N-terminale Ektodomäne von APP, die über die Aktivität der α-Sekretase prozessiert wird und anschließend extrazellulär abgegeben wird. Ziel dieser Versuchsreihe war die neuroprotektive physiologische Funktion von APP im Hinblick auf den Schutz von neuronalen Zellen vor diversen für Morbus Alzheimer relevanten Stress-Stimuli bzw. Apoptose-Stimuli zu untersuchen. Durch die Analyse der Effektor-Caspasen konnte gezeigt werden, dass sAPPα in der Lage ist PC12 Zellen potent vor oxidativem Stress, DNA-Schäden, Hypoxie, proteasomalem Stress und Calcium-Freisetzung zu schützen. Außerdem konnte gezeigt werden, dass sAPPα in der Lage ist den pro-apoptotischen Stress-induzierten JNK/Akt-Signalweg zu inhibieren. Eine Beteiligung des anti-apoptotischen PI3K/Akt-Signalwegs bei der sAPPα-vermittelten Protektion konnte über die Inhibition der PI3-Kinase ebenfalls demonstriert werden, die eine Aufhebung der sAPPα-vermittelten Neuroprotektion bewirkte. Diese Daten zeigen neue molekulare Mechanismen auf, die dem sAPPα-vermittelten Schutz vor pathophysiologisch relevanten Stress-Stimuli in neuronalen Zellen zugrunde liegen. Im letzten Teil der Arbeit wurden verschieden Gruppen von pharmakologischen Substanzen im Hinblick auf ihre neuroprotektive Wirkung untersucht und mit ihren Effekten auf den APP-Metabolismus korreliert. Die Untersuchungen ergaben, dass Galantamin, ein schwacher Acetycholinesterase Inhibitor und allosterisch potenzierender Ligand von nikotinischen Acetylcholin-Rezeptoren in der Lage war, naive, und mit noch höherer Effizienz APP-überexprimierende Zelllinien vor dem Stress-induzierten Zelltod zu schützen. Zudem bewirkte Galantamin in APP-überexprimierenden HEK293 Zellen eine rasche Erhöhung der sAPPα Sekretion, so dass hier von einer Rezeptor-vermittelten Modulation des APP Metabolismus ausgegangen werden kann. Omega-3 Fettsäuren wirken sich positiv auf die Membranfluidität von Zellen aus und es konnte bereits gezeigt werden, dass die Bildung des toxischen Aβ Peptids hierdurch vermindert wird. In Analogie zu Galantamin schützte die Omega-3 Fettsäure Docosahexaensäure (DHA) neuronale Zellen vor dem Stress-induzierten Zelltod, wobei der Schutz in APP-überexprimierenden Zellen besonders effizient war. Diese Daten legen nahe, dass die Aktivierung des antiamyloidogenen Wegs der APP-Prozessierung ein viel versprechender Ansatz für die Entwicklung neuer Therapien gegen Morbus Alzheimer sein könnte.

Impact of folate absorption and transport for nutrition and drug targeting

In this thesis, interactions of folic acid with tea and tea components at the level of intestinal absorption have been investigated. Firstly, the interaction between folic acid and tea as well as tea catechins was studied in vitro, using Caco-2 cell monolayers and secondly, a clinical trial was designed and carried out. In addition, targeting of folic acid conjugated nanoparticles to FR expressing Caco-2 cells was studied in order to evaluate the principle of nutrient-receptor-coupled transport for drug targeting. In the first part of this work, it was shown that EGCG and ECG (gallated catechins) inhibit folic acid uptake (IC50 of 34.8 and 30.8 µmol/L) comparable to MTX (methotrexate) under these experimental conditions. Moreover, commercial green and black tea extracts inhibited folic acid uptake with IC50 values of approximately 7.5 and 3.6 mg/mL, respectively. These results clearly indicate an interaction between folic acid and green tea catechins at the level of intestinal uptake. The mechanism responsible for the inhibition process might be the inhibition of the influx transport routes for folates such as via RFC and/or PCFT. For understanding the in vivo relevance of this in vitro interaction, a phase one, open-labeled, randomized, cross-over clinical study in seven healthy volunteers was designed. For the 0.4 mg folic acid dose, the mean Cmax decreased by 39.2% and 38.6% and the mean AUC0 decreased by 26.6% and 17.9% by green tea and black tea, respectively. For the 5 mg folic acid dose, the mean Cmax decreased by 27.4% and mean AUC0 decreased by 39.9% when taken with green tea. The results of the clinical study confirm the interaction between tea and folic acid in vivo leading to lower bioavailabilities of folic acid. In the second part of the thesis, targeting studies using folic acid conjugated nanoparticles were conducted. Folic acid conjugated nanoparticles were shown to be internalized by the cell via FR (folate receptor) mediated endocytosis. DNA block copolymer micelles equipped with 2, 11 and 28 folic acid units respectively were applied on FR expressing Caco-2 cells. There was a direct proportion in the amount of internalized nanoparticle and the number of folic acid units on the periphery of the nanoparticle. To sum up, throughout this thesis, the importance of folic acid for nutrition and nutrient and drug related interactions of folic acid at intestinal level was shown. Furthermore, significance of FRs in targeting for cancer chemotherapy was demonstrated in in vitro cell culture experiments. Folic acid conjugated DNA block copolymer micelles were suggested as efficient nanoparticles for targeted drug delivery.

Rolle von NFATc2 in einem murinen Asthmamodell

Nuclear factor of activated T cells (NFAT) ist eine Familie der Transkriptionsfaktoren, welche eine wichtige Rolle bei der Regulation der T-Zellvermittelten Signalkaskade in der Lymphozytenpopulation spielt. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass Nuclear Factor of Activated T cells-2 (NFATc2) defiziente Mäuse einen erhöhten Atemwegswiderstand, einen pathologische Veränderung der Lunge und einen erhöhten IgE Spiegel im Vergleich zu den Wildtypen vorweisen. Die NFATc2 Defizienz konnte ebenfalls sowohl mit einer erhöhten Anzahl an Th2 und Th17 Zellen, die eine erhöhte Proliferation vorweisen, als auch einer erniedrigten Anzahl an CD8+ CD122- T-Zellen, die geringere Mengen an IFN-g produzieren, in Verbindung gebracht werden. Die aus den NFATc2(-/-) Mäusen isolierten CD4+ T-Zellen zeigen im Vergleich zu denen der Wildtypen neben der erhöhten Proliferation einen vermehrte Aktivierung (CD4higCD44highCD69high). Weiterhin konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass in Anwesenheit eines Allergens, die NFATc2(-/-) Mäuse eine erhöhte Anzahl an regulatorischen T-Zellen (CD4+CD25+Foxp3+GITR++) in der Lunge vorweisen, die wiederum die Effektorzellen in diesen hemmen. Ein Grund für die geringere Freisetzung an IFN-g durch die CD8+ T-Zellen in den NFATc2 defizienten Mäusen ist eine erhöhte Subpopulation von CD8+CD122+ (IL-2Rb Kette) CD127hi (IL-7Ra Kette) „long-lived memory Zellen“ in den NFATc2(-/-) Mäusen. Diese besitzen einen regulatorischen Effekt, so dass immundefiziente SCID Mäuse, die in einem adoptiven Transfer mit OVA-spezifischen CD8+ und CD4+ T-Zellen, welchen aus NFATc2(-/-) Mäuse isoliert werden, behandelt wurden, eine erhöhten Atemwegswiderstand, eine erhöhte IL-17 und eine erniedrigte IFN-g Produktion vorweisen. Eine Depletion der memory CD8+CD122+IL-7Rhigh T-Zellen hebt dagegen die verringerte IFN-g Produktion der CD8+CD122- T-Zellen auf und führt zu einer Erniedrigung des Atemwegswiderstandes in einem SCID Model Zusammenfassend zeigen unsere Untersuchungen, dass sowohl die IFN-g Produktion der CD8+ Effektor T-Zellen als auch die Anzahl an CD4+CD25+Foxp3+GITR++ regulatorischen T-Zellen die Entwicklung der Th2 und Th17 als auch die Höhe des Atemwegswiderstandes unterdrückt.

Einfluss einer pharmazeutischen Betreuung auf den klinischen Verlauf und die Behandlungsergebnisse von Diabetikern mit Diabetischem Fußsyndrom (DFS)

Einfluss einer Pharmazeutischen Betreuung auf den klinischen Verlauf und die Behandlungsergebnisse von Diabetikern mit Diabetischem Fußsyndrom (DFS) Hintergrund/Rationale: In Deutschland gibt es etwa 6 Millionen Diabetiker und die Tendenz ist steigend. Das Diabetische Fußsyndrom (DFS) stellt eine häufige und besonders gravierende Folgeerkrankung des Diabetes mellitus dar. Jährlich werden in Deutschland ca. 45.000 Amputationen aufgrund des DFS bei Diabetikern durchgeführt. Es verursacht bei den Patienten physische und psychische Beeinträchtigungen und produziert hohe Krankheitskosten. Der Prävention, der Behandlung und der Rezidivprophylaxe des DFS kommt daher ein hoher Stellenwert zu. Ziel dieser Arbeit war es, ein klinisch-pharmazeutisches Betreuungsprogramm für Patienten mit DFS zu erarbeiten und den Einfluss der Pharmazeutischen Betreuung, speziell einer intensivierten Patientenschulung, auf klinische und soziale Behandlungsergebnisse hin zu untersuchen. Es sollte geklärt werden, ob eine zusätzliche pharmazeutische Betreuung Einfluss auf den Wundheilungsverlauf und die Abheilungsrate der Fußläsionen von Diabetikern mit DFS nehmen kann. Methoden: 52 Patienten mit DFS wurden in eine randomisierte, kontrollierte Studie eingeschlossen und im Verhältnis 1:1 einer Interventions- oder Kontrollgruppe zugeteilt. Die Interventionsgruppe wurde kontinuierlich durch einen Apotheker zusätzlich individuell betreut (Anleitung zum sachgerechten Umgang mit Arzneimitteln, Medizinprodukten und Therapiemaßnahmen), die Kontrollgruppe erhielt die übliche medizinische Betreuung. Die Auswirkungen der Intervention auf den klinischen Verlauf der beobachteten Fußläsionen, die Rezidivfreiheit und Rehospitalisierungsrate, aber auch auf die Patientenzufriedenheit, das Patientenwissen und die Lebensqualität wurden untersucht. Jeder Patient wurde über einen Zeitraum von 12 Monaten beobachtet. Ergebnisse: Die Studienergebnisse belegen einen positiven Einfluss der Pharmazeutischen Betreuung auf die klinischen Endpunkte der Diabetiker mit DFS. Die Wundheilung der Läsionen in der Interventionsgruppe, bezogen auf Abheilungsdauer und -rate, konnte klinisch positiv beeinflusst werden. Des weiteren konnte in der Interventionsgruppe die Anzahl an neu aufgetretenen Läsionen, sowie weiterer Krankenhausaufenthalte um jeweils fast 50% verringert werden. Durch die Pharmazeutische Betreuung konnte die Patientenzufriedenheit mit der Behandlung deutlich gesteigert werden. Entsprechendes fand sich für das Patientenwissen und die Lebensqualität.

SANS (USH1G) in USH-Proteinnetzwerken von Photorezeptorzellen der Vertebratenretina

Das Usher Syndrom (USH) führt beim Menschen zur häufigsten Form erblicher Taub-Blindheit und wird aufgrund klinischer Merkmale in drei Typen unterteilt (USH1-3). Das Ziel dieser Arbeit war die Analyse der Expression und subzellulären Lokalisation des USH1G-Proteins SANS („Scaffold protein containing Ankyrin repeats and SAM domain“) in der Retina. Ein weiterer Fokus lag auf der Identifikation neuer Interaktionspartner zur funktionellen Charakterisierung von SANS. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit konnte ein USH-Proteinnetzwerk identifiziert werden, das im Verbindungscilium und benachbarter Struktur, dem apikalen Innensegment von Photorezeptorzellen lokalisiert ist. Als Netzwerkkomponenten konnten die USH-Proteine SANS, USH2A Isoform b (USH2A), VLGR1b („Very Large G-protein coupled Receptor 1b“, USH2C) sowie Whirlin (USH2D) ermittelt werden. Innerhalb dieses Netzwerkes interagieren die Gerüstproteine SANS und Whirlin direkt miteinander. Die Transmembranproteine USH2A Isoform b und VLGR1b sind durch die direkte Interaktion mit Whirlin in ciliären-periciliären Membranen verankert und projizieren mit ihren langen Ektodomänen in den extrazellulären Spalt zwischen Verbindungscilium und apikalem Innensegment. Darüber hinaus konnte die Partizipation von SANS an Mikrotubuli-assoziiertem Vesikeltransport durch Identifikation neuer Interaktionspartner, wie dem MAGUK-Protein MAGI-2 („Membrane-Associated Guanylate Kinase Inverted-2“) sowie Dynaktin-1 (p150Glued) eruiert werden. Die Funktion des ciliären-periciliären USH-Proteinnetzwerkes könnte demnach in der Aufrechterhaltung benachbarter Membranstrukturen sowie der Beteiligung der Positionierung und Fusion von Transportvesikeln liegen.

Funktionelle Bedeutung von P-Glykoprotein für Wirkungen und Nebenwirkungen von Antipsychotika

Therapeutisches Drug Monitoring (TDM) ist eine Maßnahme, bei der durch Messung der Medikamentenspiegel im Blut die Dosis ermittelt wird, bei der mit höchster Wahrscheinlichkeit mit Therapieansprechen gerechnet werden kann. Dabei wird angenommen, dass die Konzentrationen im Blut mit denen im Wirkkompartiment korrelieren. Für Antipsychotika wurde gezeigt, dass die Konzentrationen im Blut direkt mit denen im Gehirn korrelieren, die Verteilung zwischen den beiden Kompartimenten ist jedoch für die verschiedenen Antipsychotika sehr unterschiedlich. Die Distribution von Arzneistoffen zwischen Blut und Gehirn wird durch Effluxtransporter in der Blut-Hirn-Schranke kontrolliert. Welche Rolle dabei P-Glykoprotein (P-gp) für die Verteilung von atypischen Antipsychotika spielt und wie die Pharmakokinetik und –dynamik durch diesen Transporter beeinflusst werden, sollte in dieser Arbeit untersucht werden. Für die Messung des neu eingeführten Antipsychotikums Aripiprazol, sowie für seinen aktiven Metaboliten Dehydroaripiprazol, wurde eine hochleistungsflüssigchromatographische (HPLC) Methode mit Säulenschaltung und spektrophotometrischer Detektion etabliert. Die Methode wurde für die Messung von Serumproben schizophrener Patienten eingesetzt, um einen therapeutischen Bereich für Aripiprazol zu ermitteln. Aus der Analyse von 523 Patientenproben wurde herausgefunden, dass Aripiprazol-Serumkonzentrationen von 150 bis 300 ng/ml mit gutem klinischen Ansprechen und einem geringen Risiko für Nebenwirkungen einhergingen. Weiterhin wurde festgestellt, dass die Serumspiegel bei gleichzeitiger Gabe von Inhibitoren und Induktoren der Cytochrom P450 (CYP) Isoenzyme CYP2D6 und CYP3A4 erhöht bzw. gesenkt wurden. Am Modell der P-gp Knockout Maus im Vergleich zu FVB Wildtyp Mäusen wurden Konzentrationsverläufe von Antipsychotika nach i.p. Gabe von Amisulprid, Aripiprazol, Dehydroaripiprazol, Clozapin, Desmethylclozapin, Haloperidol, Olanzapin, Quetiapin, Risperidon und 9-Hydroxyrisperidon sowie der Kontrollsubstanz Domperidon im Gehirn und Blut über 24 Stunden mittels HPLC-Methoden gemessen. Welchen Einfluss eine verminderte Expression von P-gp auf die Pharmakodynamik hat, wurde in zwei Verhaltenstests untersucht. Mit Hilfe des Rotarods wurden motorische Effekte der Arzneistoffe erfasst und mittels Radial Arm Water Maze kognitive Fähigkeiten. Risperidon und sein aktiver Metabolit 9-Hydroxyrisperidon waren die stärksten Substrate von P-gp. 10-fach höhere Konzentrationen im Gehirn der P-gp Knockout Mäuse führten zu 10-fach stärkeren Beeinträchtigungen in den pharmakodynamischen Untersuchungen im Vergleich zu Wildtyp Tieren. Amisulprid, Aripiprazol, Dehydroaripiprazol, Desmethylclozapin und Quetiapin konnten ebenfalls als Substrate von P-gp identifiziert werden. Olanzapin, Haloperidol und Clozapin wurden durch P-gp wenig bzw. nicht in ihrer Pharmakokinetik und –dynamik beeinflusst. Da P-gp von Nagern und Menschen nach derzeitiger Kenntnis in ihren Substrateigenschaften weitgehend übereinstimmen, muss bei einer Behandlung von schizophrenen Patienten mit Antipsychotika, die als Substrate von P-gp identifiziert wurden, davon ausgegangen werden, dass eine Veränderung der Expression oder Aktivität von P-gp, genetisch verursacht oder durch Medikamente bedingt, für das Therapieansprechen oder das Auftreten von Nebenwirkungen bedeutsam sind.

Biomimese biologischer Membranen: Konzeptionierung, Synthese und biophysikalische Charakterisierung einer Hierarchie festkörpergestützter Mimikry biologischer Membranen

Im Rahmen dieser Arbeit wurden drei neue Modelle zur funktionellen Mimiese biologischer Membranen im Bereich der Bionanotechnologie entwickelt. Um den Rahmen der notwendigen Faktoren und Komponenten für biomimetische Membranmodelle abzustecken, wurde das biologische Vorbild im Bezug auf Zusammensetzung, Organisation und Funktion analysiert. Die daraus abgeleiteten Erkenntnisse erlauben das Erreichen von biologisch relevanten Membranwiderständen im Bereich von mehreren MOhm cm2 und eine gute lokale Fluidität. Ein weiteres Ziel dieser Arbeit war die Entwicklung einer Hierachie unterschiedlich stark von der Festkörperoberfläche entkoppelter Membranen zur Vergrößerung des submembranen Raumes. Diese Ziele konnten realisiert werden. Das auf archaealen Etherlipiden basierende DPTL-System wurde analog dem biologischen Vorbild stereoselektiv synthetisiert und ist in der Lage die Membran bei maximaler Elongation des TEG-Spacers mit mehr als 2 nm von der Oberfläche zu entkoppeln. Die erzielten Wiederstände liegen im hohen ein- bis zweistelligen MOhm-Bereich, die Kapazität entspricht mit 0,5 µF cm-2 ebenfalls dem Wert biologischer Membranen. Die Membraneigenschaften wurden mit Hilfe von SPS, EIS, IR-Spektroskopie, QCM, AFM und Kontaktwinkelmessungen charakterisiert. Die Funktionalität und lokale Fluidität der DPTL-Membran konnte anhand des Valinomycin vermittelten K+-Transports über die Membran gezeigt werden. Fluide Elektroden oder laterale Verdünnung mit TEGL erlauben den Einbau größerer Ionenkanäle. Lipo-Glycopolymere (LGP) mit unterschiedlichen Kettenlängen wurden mit Hilfe der kontrollierten radikalischen Polymerisation mit einer PD < 1.2 synthetisiert. Es zeigte sich, daß die Vororientierung der LGPs auf dem LB-Trog, gefolgt von einem LB-Übertrag auf einen funktionalisierten Träger mit photoreaktivem SAM, nach Belichten des Systems zu einer verlässlichen kovalenten Anbindung der supramolekularen LGP-Architektur führt. Da die Lipo-Glycopolymerketten am Glycopolymerterminus nur mit oberflächennahen Repetiereinheiten an die photoaktivierte Oberfläche binden, sind sie in der Lage Oberflächenrauhigkeiten des Festkörpersubstrates auszugleichen. Die photochemische Immobilisierung von funktionell orientierten supramolekularen LGP-Architekturen auf Goldoberflächen resultiert in tBLMs mit großen vertikalen Enkopplungen der Membran von der Festkörperoberfläche (>8 nm). Der funktionelle Ionentransport von Kaliumionen durch Valinomycin zeigt eine ausreichende lokale Fluidität der Membran die mit einem guten Membranwiderstand (mehrere MOhm) kombiniert ist. Große Membran-Oberflächenentkopplungen konnten mit Hilfe plasmapolymerisierter elektrophiler Polymere erreicht werden. Filmdicken von 50 nm sind mit homogener Oberfläche und Rauhigkeiten im Bereich von Nanometern möglich. Das System zeigt interessante fluide Eigenschaften mit guten Erholungsraten bei FRAP-Experimenten (Diffusionskonstanten von etwa 17 mikro m2 s-1). Die elektrischen Eigenschaften liegen mit Widerständen von wenigen kOhm unterhalb der für gute Membranmimikrie notwendigen Werte. Erstmalig konnte gezeigt werden, daß mit Hilfe dieser Methode inerte Polymere/Plastikträger (zum Beispiel Polypropylen und TOPAS) in effizienter Weise kovalent mit reaktiven Polymeroberflächen modifiziert werden können (Anwendung als DNA-Chip ist beschrieben).

Applications of remote sensing and geographic information systems in geomorphological studies: Safaga - El Quseir area, Red Sea coast, Egypt as an example

In den letzten drei Jahrzehnten sind Fernerkundung und GIS in den Geowissenschaften zunehmend wichtiger geworden, um die konventionellen Methoden von Datensammlung und zur Herstellung von Landkarten zu verbessern. Die vorliegende Arbeit befasst sich mit der Anwendung von Fernerkundung und geographischen Informationssystemen (GIS) für geomorphologische Untersuchungen. Durch die Kombination beider Techniken ist es vor allem möglich geworden, geomorphologische Formen im Überblick und dennoch detailliert zu erfassen. Als Grundlagen werden in dieser Arbeit topographische und geologische Karten, Satellitenbilder und Klimadaten benutzt. Die Arbeit besteht aus 6 Kapiteln. Das erste Kapitel gibt einen allgemeinen Überblick über den Untersuchungsraum. Dieser umfasst folgende morphologische Einheiten, klimatischen Verhältnisse, insbesondere die Ariditätsindizes der Küsten- und Gebirgslandschaft sowie das Siedlungsmuster beschrieben. Kapitel 2 befasst sich mit der regionalen Geologie und Stratigraphie des Untersuchungsraumes. Es wird versucht, die Hauptformationen mit Hilfe von ETM-Satellitenbildern zu identifizieren. Angewandt werden hierzu folgende Methoden: Colour Band Composite, Image Rationing und die sog. überwachte Klassifikation. Kapitel 3 enthält eine Beschreibung der strukturell bedingten Oberflächenformen, um die Wechselwirkung zwischen Tektonik und geomorphologischen Prozessen aufzuklären. Es geht es um die vielfältigen Methoden, zum Beispiel das sog. Image Processing, um die im Gebirgskörper vorhandenen Lineamente einwandfrei zu deuten. Spezielle Filtermethoden werden angewandt, um die wichtigsten Lineamente zu kartieren. Kapitel 4 stellt den Versuch dar, mit Hilfe von aufbereiteten SRTM-Satellitenbildern eine automatisierte Erfassung des Gewässernetzes. Es wird ausführlich diskutiert, inwieweit bei diesen Arbeitsschritten die Qualität kleinmaßstäbiger SRTM-Satellitenbilder mit großmaßstäbigen topographischen Karten vergleichbar ist. Weiterhin werden hydrologische Parameter über eine qualitative und quantitative Analyse des Abflussregimes einzelner Wadis erfasst. Der Ursprung von Entwässerungssystemen wird auf der Basis geomorphologischer und geologischer Befunde interpretiert. Kapitel 5 befasst sich mit der Abschätzung der Gefahr episodischer Wadifluten. Die Wahrscheinlichkeit ihres jährlichen Auftretens bzw. des Auftretens starker Fluten im Abstand mehrerer Jahre wird in einer historischen Betrachtung bis 1921 zurückverfolgt. Die Bedeutung von Regentiefs, die sich über dem Roten Meer entwickeln, und die für eine Abflussbildung in Frage kommen, wird mit Hilfe der IDW-Methode (Inverse Distance Weighted) untersucht. Betrachtet werden außerdem weitere, regenbringende Wetterlagen mit Hilfe von Meteosat Infrarotbildern. Genauer betrachtet wird die Periode 1990-1997, in der kräftige, Wadifluten auslösende Regenfälle auftraten. Flutereignisse und Fluthöhe werden anhand von hydrographischen Daten (Pegelmessungen) ermittelt. Auch die Landnutzung und Siedlungsstruktur im Einzugsgebiet eines Wadis wird berücksichtigt. In Kapitel 6 geht es um die unterschiedlichen Küstenformen auf der Westseite des Roten Meeres zum Beispiel die Erosionsformen, Aufbauformen, untergetauchte Formen. Im abschließenden Teil geht es um die Stratigraphie und zeitliche Zuordnung von submarinen Terrassen auf Korallenriffen sowie den Vergleich mit anderen solcher Terrassen an der ägyptischen Rotmeerküste westlich und östlich der Sinai-Halbinsel.

Aktivitätsabhängige Kontrolle der Apoptose in neonatalen kortikalen Neuronen und Etablierung eines Biosensors zur Echtzeitanalyse der Caspase-3-Aktivierung

Die Apoptose spielt eine entscheidende Rolle während der normalen Entwicklung des zentralen Nervensystems. Elektrische Aktivität und die Versorgung mit trophischen Faktoren sind ausschlaggebend für das Überleben von Neuronen. Um zu untersuchen, welche zellulären Prozesse die aktivitätsabhängige Apoptose in organotypischen Schnittkulturen des neugeborenen Neokortex beeinflussen, wurde in der vorliegenden Arbeit immunzytochemisch das Auftreten aktivierter Caspase-3, nach pharmakologischer Beeinflussung von Ionenkanälen und membranständigen Rezeptoren analysiert. Die Unterdrückung neuronaler Aktivität durch den Natriumionenkanalblocker TTX führte zu einem signifikanten Verlust kortikaler Neuronen. Ein ähnlicher Anstieg der Zahl apoptotischer Neurone konnte durch Applikation von Antagonisten ionotroper Glutamatrezeptoren, GABAA-Rezeptoren oder neuronaler Gap Junctions induziert werden. Jedoch konnte bei einigen Antagonisten die apoptosefördernde Wirkung erst nach längerer Einwirkung beobachtet werden. Im Weiteren wurde eine Methode etabliert, mit deren Hilfe eine Echtzeitanalyse der Apoptose kortikaler Neurone unter dem Entzug trophischer Faktoren in Gegenwart unterschiedlicher extrazellulärer Kaliumkonzentrationen ermöglicht wurde. Dazu wurden dissoziierte kortikale Kulturen mit dem pCaspase3-sensor Vektor transfiziert. Das durch dieses Plasmid codierte fluoreszente Protein wird Caspase-3 abhängig gespalten. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass der Caspase3-sensor spezifisch für die Aktivierung der Caspase-3 ist, und dass die Überlebensfähigkeit der transfizierten Neurone durch das Transfektionsprotokoll nicht beeinflusst wird.