Ursachen der unterschiedlichen Oligomerisierung von Lichtsammelproteinen

Die verschiedenen Lichtsammelproteine (Lhc-Proteine) höherer Pflanzen unterscheiden sich im Oligomerisierungsverhalten. Im Photosystem II existieren 6 Lhc-Proteine, die entweder die monomeren Lichtsammelkomplexe (LHC) CP24 (Lhcb6), CP26 (Lhcb5) und CP29 (Lhcb4) oder den trimeren LHCII (Lhcb1, Lhcb2 und Lhcb3) bilden. Im Photosystem I sind laut Kristallstruktur vier Lhc-Proteine lokalisiert, die als Heterodimere organisiert vorliegen. Der schwerpunktmäßig untersuchte LHCI-730 setzt sich aus Lhca1 und Lhca4 zusammen, während der LHCI-680 aus Lhca2 und Lhca3 besteht. Das Ziel der Arbeit bestand in der Identifizierung der für das unterschiedliche Oligomerisierungsverhalten verantwortlichen Proteinbereiche und Aminosäuren. Die für diese Arbeit generierten Consensussequenzalignments verschiedener Lhca- und Lhcb-Proteine vieler Arten unterstützen die Folgerungen aus Strukturdaten und anderen Sequenzalignments, dass den LHCs eine gemeinsame Monomerstruktur zu Grunde liegt. Die Helices 1 und 3 weisen weitgehend sehr hohe Sequenzidentitäten auf, während die N- und C-Termini, die zwei Schleifenregionen und die Helix 2 nur schwach konserviert sind. Falls die Bereiche mit hoher Sequenzübereinstimmung für das Zustandekommen ähnlicher monomerer LHC-Strukturen verantwortlich sind, könnten in den schwach konservierten Domänen die Ursachen für das unterschiedliche Oligomerisierungsverhalten lokalisiert sein. Aufgrund dessen wurden die schwach konservierten Domänen des monomerisierenden Lhcb4, des mit dem Lhca1 dimerisierenden Lhca4 und des Trimere bildenden Lhcb1 gegen die entsprechenden Domänen der anderen Proteine ausgetauscht und bezüglich ihres Oligomerisierungsverhaltens untersucht. Im Lhca4 konnten mit der Helix 2 und der stromalen Schleife zwei für eine Heterodimerisierung essentielle Domänen gefunden werden. Im Lhcb1 waren neben dem N-Terminus auch die 2. Helix und die stromale Schleifendomäne unentbehrlich für eine Trimerisierung. Zusätzlich waren Dimerisierung und Trimerisierung bei Austausch der luminalen Schleife beeinträchtigt. Ein geringer Beitrag zur Lhcb1-Trimerisierung konnte auch für den C-Terminus belegt werden. Ein zusätzliches Ziel der Arbeit sollte der Transfer der Oligomerisierungseigenschaften durch umfangreichen Domänentausch von einem auf ein anderes Protein sein. Der Transfer der Fähigkeit zur Dimerbildung durch Substitution gegen essentielle Lhca4-Domänen (50% luminale Schleife, 100% Helix 2 und 100% stromale Schleife) gelang beim Lhcb4, nicht aber beim Lhcb1. Der Transfer der Trimerisierungsfähigkeit auf Lhca4 und Lhcb4 scheiterte. Eine Lhca1-Mutante mit allen für eine Dimerisierung essentiellen Lhca4-Domänen, die durch Interaktion einzelner Moleküle untereinander multimere LHCs bilden sollte, war bereits in ihrer Monomerbildung beeinträchtigt. Eine Übertragung der Oligomerisierungsfähigkeit auf andere Proteine durch massiven Domänentransfer gestaltete sich somit schwierig, da vermutlich im mutierten Protein immer noch ursprüngliche Tertiärstrukturanteile enthalten waren, die nicht mit den transferierten Proteinbestandteilen kompatibel sind. Bei zukünftigen Experimenten zur Klärung der Transferierbarkeit der Oligomerisierungseigenschaft sollten deswegen neben dem unberücksichtigten 1. Teil der luminalen Schleife auch wenig konservierte Aminosäuren in der 1. und 3. Helix Beachtung finden. Ein weiteres Ziel dieser Arbeit war es, die LHCI-730-Dimerisierung im Detail zu untersuchen. Mutationsanalysen bestätigten den von früheren Untersuchungen bekannten Einfluss des Isoleucins 103 und Histidins 99. Letzteres geht möglicherweise durch sein gebundenes Chlorophyll eine Interaktion mit dem Lhca1 ein. Das Phenylalanin 95 stellte sich ebenfalls als ein wichtiger Interaktionspartner heraus und könnte in Wechselwirkung mit einem zwischen Lhca1 und Lhca4 lokalisierten Phosphatidylglycerin treten. Das ebenfalls an der Dimerbildung beteiligte Serin 88 des Lhca4 könnte auf Grund der räumlichen Nähe bei Modellierungen direkt mit dem am C-Terminus des Lhca1 lokalisierten Glycin 190 interagieren. Darüber hinaus wurde ein in der luminalen Lhca4-Schleife lokalisiertes Phenylalanin 84 als Interaktionspartner des Tryptophans 185 im C-Terminus von Lhca1 identifiziert. Der simultane Austausch des Isoleucins 109 und Lysins 110 in der stromalen Schleife des Lhca4, konnte deren Einfluss auf die Dimerisierung belegen. Nachdem bislang an der Dimerbildung beteiligte Aminosäuren am N- und C-Terminus des Lhca1 und Lhca4 identifiziert werden konnten, wurden in dieser Arbeit viele an einer Dimerbildung beteiligten Proteinbereiche und Aminosäuren in der Helix 2 und den Schleifenregionen des Lhca4 identifiziert. Um alle an der Lhca1-Lhca4-Interaktion beteiligten Aminosäuren aufzuklären, müssten durch Mutationsanalysen die in der stromalen Lhca4-Schleife vermuteten Interaktionspartner des für die Dimerisierung wichtigen Tryptophans 4 am N-Terminus von Lhca1 identifiziert, und die in der Helix 3 des Lhca1 vermuteten Interaktionspartner der Helix 2 des Lhca4 ermittelt werden.

Funktionsanalyse von Gamma2-Adaptin: ein zellulärer Adaptor der Hepatitis-B-Virus-Morphogenese

Im Replikationszyklus umhüllter Viren entstehen neue Viruspartikel durch die Knospung an Membranen der Wirtszelle. An diesem Prozess sind verschiedene zelluläre Faktoren und Mechanismen beteiligt, speziell die ESCRT-Proteinkomplexe, welche die Vesikelbildung an den MVBs steuern. Auch bei HBV ist davon auszugehen, dass Komponenten der Wirtszelle an der Umhüllung und Freisetzung der Virionen beteiligt sind, allerdings sind diese noch weitgehend unbekannt. Ziel dieser Arbeit war es daher, die zellulären Faktoren genauer zu charakterisieren und ihre Funktion bei der Virusumhüllung aufzuklären. Den Ausgangspunkt für die hier durchgeführten Untersuchungen bildeten vorangegangene Arbeiten, in denen die spezifische Interaktion des L-Hüllproteins von HBV mit g2-Adaptin nachgewiesen werden konnte. Diese ist für die Morphogenese von HBV essentiell, allerdings ist die zelluläre ebenso wie die virusspezifische Funktion von g2-Adaptin bislang unbekannt. Im Rahmen dieser Arbeit sollte daher untersucht werden, wo und wie g2-Adaptin in der Zelle funktionell ist, um daraus Rückschlüsse auf die Vorgänge bei der Morphogenese von HBV ziehen zu können. Die Grundlage für die Charakterisierung von g2-Adaptin bildete seine Ähnlichkeit zu zellulären Clathrin-Adaptorproteinen. So konnte hier gezeigt werden, dass auch g2-Adaptin ein Clathrin-Bindungsmotiv besitzt, welches eine Interaktion mit Clathrin ermöglicht. Außerdem konnte ein Ubiquitin-Interaktions-Motiv (UIM) identifiziert werden, das die Bindung an ubiquitinierte Proteine vermittelt. Diese Beobachtung deutet darauf hin, dass g2-Adaptin zu einer Gruppe monomerer Adaptorproteine zählen könnte, welche als Ubiquitin-Rezeptoren in der Zelle funktionell sind. Die folgenden Analysen zeigten eine weitere Gemeinsamkeit, da auch g2-Adaptin selbst durch Ubiquitin modifiziert wird, wobei die Ubiquitinierung von einem intakten UIM abhängt. Dieser als Coupled Monoubiquitination bezeichnete Prozess wird hierbei durch die Ubiquitin-Ligase Nedd4 vermittelt, die direkt mit g2-Adaptin interagiert. Dabei konnte nachgewiesen werden, dass die C2-Domäne von Nedd4 ebenfalls mit Ubiquitin modifiziert ist, wodurch der Kontakt zum UIM von g2-Adaptin erfolgt. Die meisten der bislang bekannten Ubiquitin-bindenden Adaptorproteine, spielen bei der Vesikelentstehung an verschiedenen zellulären Membranen eine Rolle, wo sie an der Sortierung der vorwiegend ubiquitinierten Membranproteine beteiligt sind und zelluläre Komponenten rekrutieren, welche die Vesikelabschnürung vermitteln. Die Adaptorproteine sind dabei meist mit der jeweiligen Membran assoziiert, was auch für g2-Adaptin nachgewiesen werden konnte. Diese Membranbindung wird durch den N-terminalen Proteinbereich von g2-Adaptin vermittelt und erfolgt unabhängig von den Ubiquitin-bindenden Eigenschaften und von Nedd4. Allerdings scheint die Ubiquitin-Modifikation von g2-Adaptin ausschließlich in membrangebundener Form zu erfolgen. An welchen Membranen g2-Adaptin lokalisiert ist, wurde in Immunfluoreszenzstudien untersucht, wobei eine enge Assoziation von g2-Adaptin mit späten Endosomen bzw. MVBs zu beobachten war. Bei weiteren Analysen konnte auch ein funktioneller Einfluss auf die Vesikelentstehung an den MVBs nachgewiesen werden, da durch die Depletion von g2-Adaptin stark vergrößerte, defekte MVBs induziert wurden. Dies deutet darauf hin, dass g2-Adaptin als Ubiquitin-Rezeptor an diesen Prozessen beteiligt sein könnte. Ebenso wie andere Adaptorproteine könnte es hier an die Cargo-Proteine binden, diese durch den Kontakt zu Clathrin lokal konzentrieren und die Vesikelabschnürung durch die Rekrutierung der MVB-Maschinerie vermitteln. Möglicherweise stellt g2-Adaptin hierbei den bislang nicht identifizierten Adaptor dar, der die Verbindung zwischen Nedd4 und der MVB-Kaskade herstellt. Eine ähnliche Funktion für g2-Adaptin ist auch bei der Morphogenese von HBV denkbar. Aufgrund der durchgeführten Lokalisationsstudien ist anzunehmen, dass die Umhüllung der HBV-Partikel direkt an den MVBs erfolgt. Vermutlich bindet g2-Adaptin hier an das L-Hüllprotein, wobei es durch die Rekrutierung von Clathrin zu einer lokalen Anreicherung der Hüllproteine kommt. g2-Adaptin interagiert zudem in UIM-abhängiger Weise mit dem Nukleokapsid, wobei der Kontakt direkt erfolgen könnte oder durch die Ubiquitin-Ligase Nedd4 vermittelt wird, welche über eine Late-Domäne ebenfalls mit dem Nukleokapsid verbunden ist. Anscheinend gelangt das Nukleokapsid durch den Einfluss von g2-Adaptin und Nedd4 zum Ort der Virusmorphogenese, wo die eigentliche Umhüllung und die Abschnürung der Viruspartikel erfolgen. Vermutlich sind auch hier Komponenten der MVB-Maschinerie beteiligt, die womöglich durch g2-Adaptin rekrutiert werden.

An alternative blocking layer for titanium dioxide (TiO 2) solar cell applications

In hybrid organic solar cells a blocking layer between transparent electrode and nanocrystalline titania particles is essential to prevent short-circuiting and current loss through recombination at the electrode interface. Here the preparation of a uniform hybrid blocking layer which is composed of conducting titania nanoparticles embedded in an insulating polymer derived ceramic is presented. This blocking layer is prepared by sol-gel chemistry where an amphiphilic block copolymer is used as a templating agent. A novel poly(dimethylsiloxane) containing amphiphilic block copolymer poly(ethyleneglycol)methylethermethacrylate-block-poly(dimethylsiloxane)-block-poly(ethyleneglycol)methylethermethacrylate has been synthesized to act as the templating agent. Plasma treatment uncovered titania surface from any polymer. Annealing at 450°C under nitrogen resulted in anatase titania with polymer derived silicon oxycarbide ceramic. Electrical characterization by conductive scanning probe microscopy experiments revealed a percolating titania network separated by an insulating ceramic matrix. Scanning Kelvin probe force microscopy showed predominant presence of titania particles on the surface creating a large surface area for dye absorption. The uniformity of the percolating structures was proven by microbeam grazing incidence small angle x-ray scattering. First applications in hybrid organic solar cells in comparison with conventional titanium dioxide blocking layer containing devices revealed 15 fold increases in corresponding efficiencies. Poly(dimethylsiloxane)-block-poly(ethyleneglycol)methylethermethacrylate and poly(ethyleneoxide)-poly(dimethylsiloxane)methylmethacrylate diblock copolymers were also synthesized. Their titania nanocomposite films were compared with the integrated blocking layer. Liner poly(ethyleneoxide) containing diblock copolymer resulted in highly ordered foam like structures. The effect of heating temperature rise to 600°C and 1000°C on titania morphology was investigated by scanning electron and force microscopy and x-ray scattering. Sol-gel contents, hydrochloric acid, titania precursor and amphiphilic triblock copolymer were altered to see their effect on titania morphology. Increase in block copolymer content resulted in titania particles of diameter 15-20 nm.

Synthetische Glycopeptide mit Sulfatyl-Lewis X-Struktur als potenzielle Inhibitoren der Zelladhäsion

Zelladhäsionsprozesse sind von großer Bedeutung für zahlreiche biologische Prozesse, wie etwa die Immunantwort, die Wundheilung und die Embryogenese. Außerdem spielen sie eine entscheidende Rolle im Verlauf inflammatorischer Prozesse. An der Zelladhäsion sind verschiedene Klassen von Adhäsionsmolekülen beteiligt. Die erste leichte „rollende“ Adhäsion von Leukozyten am Ort einer Entzündung wird durch die Selektine vermittelt. Diese binden über die Kohlenhydrat-Strukturen Sialyl-Lewisx und Sialyl-Lewisa über eine calciumabhängige Kohlenhydrat-Protein-Bindung an ihre spezifischen Liganden und vermitteln so den ersten Zellkontakt, bevor andere Adhäsionsmoleküle (Cadherine, Integrine) die feste Adhäsion und den Durchtritt durch das Endothel bewirken. Bei einer pathogenen Überexpression der Selektine kommt es jedoch zu zahlreichen chronischen Erkrankungen wie z. B. rheumatoider Arthritis, Erkrankungen der Herzkranzgefäße oder dem Reperfusions-syndrom. Außerdem wird eine Beteiligung der durch die Selektine vermittelten Zellkontakte bei der Metastasierung von Karzinomzellen angenommen. Ein Ansatzpunkt für die Behandlung der oben genannten Erkrankungen ist die Gabe löslicher kompetitiver Inhibitoren für die Selektine. Ziel der Arbeit war die Modifikation des Sialyl-Lewisx-Leitmotivs zur Steigerung der metabolischen Stabilität und dessen Einbau in die Peptidsequenz aus der für die Bindung verantwortlichen Domäne des endogenen Selektin-Liganden PSGL-1. Dazu wurden mit einer modifizierten Lewisx-Struktur glycosylierte Aminosäurebausteine dargestellt (Abb.1). Die Verwendung von Arabinose und des Sulfatrestes anstelle von Fusose und Sialinsäure sollte außerdem zu einer gesteigerten metabolischen Stabilität des synthetischen Liganden beitragen. Die so erhaltenen Glycosylaminosäuren sollten nun in die Festphasenpeptidsynthese eingesetzt werden. Aufgrund der großen säurelabilität konnte hier nicht auf das Standartverfahren (Wang-Harz, Abspaltung mit TFA) zurückgegriffen werden. Deshalb kam ein neuartiges UV-labiles Ankersystem zum Einsatz. Dazu wurde ein Protokoll für die Synthese und Abspaltung von Peptiden an diesem neuen System entwickelt. Daran gelang die Synthese des nichtglycosylierten Peptidrückgrats sowie eines mit der dem sulfatierten Lewisx-Motiv versehenen Glycopeptids. Ein vierfach sulfatiertes Glycopeptid, welches durch den Einsatz von im Vorfeld chemisch sulfatierer Tyrosin-Bausteinen dargestellt werden sollte, konnte massenspektrometrisch nachgewiesen werden.

Untersuchungen zur Rolle des BH3-only-Proteins Bid bei der Stress-induzierten Apoptose in Karzinomzelllinien

Als BH3-only Protein gehört Bid zu den proapoptotischen Mitgliedern der Bcl-2 Familie, die während der Apoptose die Freisetzung Caspase-aktivierender Proteine aus den Mitochondrien kontrollieren. Bid zählt zu den potentesten BH3-only Proteinen und wird von vielen transformierten und nichttransformierten Zellen konstitutiv exprimiert. Ziel dieser Arbeit war es, Bid durch RNA-Interferenz stabil zu depletieren, um Bid-abhängige Apoptosewege in HeLa Zervixkarzinomzellen zu identifizieren, die von intrinsischen Stressstimuli sowie von konventionellen und neuartigen Chemotherapeutika induziert werden. Da Bid im Todesrezeptor-vermittelten Signalweg der Apoptose durch Caspase-8 gespalten und aktiviert wird, waren die Bid-depletierten Zellen signifikant vor der Fas/CD95-, TRAIL- oder TNF-α-induzierten Apoptose geschützt und zeigten nach Exposition mit allen drei Todesrezeptorliganden eine drastisch reduzierte Effektorcaspase-Aktivität und eine höhere Proliferationsrate als die Kontrollzellen. Eine ektopische Bidexpression in Bid knock down (kd) Zellen hob die Protektion vor der Fas- und TRAIL-induzierten Apoptose auf. Der Proteasominhibitor Epoxomicin, der Proteinkinase-Inhibitor Staurosporin oder die ER Stress-induzierenden Agenzien Tunicamycin, Thapsigargin und Brefeldin A lösten hingegen einen Bid-unabhängigen Zelltod aus. Allerdings konnten subletale Tunicamycin- oder Thapsigarginkonzentrationen HeLa Zellen für die TRAIL-induzierte Apoptose sensitivieren. Da der Synergieeffekt auf einer ER Stress-vermittelten Amplifizierung des Todesrezeptorwegs beruhte, zu der eine Tunicamycin-induzierte Steigerung der Expression des Todesrezeptors DR5 signifikant beitrug, erfolgte diese Sensitivierung nur in Bid-profizienten Zellen. Bid war in HeLa Zellen außerdem an der apoptotischen Signalkaskade beteiligt, die von den DNA-schädigenden Agenzien Etoposid, Doxorubicin und Oxaliplatin (Oxa) ausgelöst wird. Nach Behandlung mit Oxa zeigten die Bid kd Zellen eine verzögerte Caspase-2, -3, -8 und -9 Aktivierung, einen geringeren Verlust des mitochondrialen Membranpotentials sowie eine reduzierte Apoptose- und eine höhere Proliferationsrate als Bid-profiziente Zellen. Neben Bid war ein weiteres BH3-only Protein, Puma, an der Oxa-induzierten Effektorcaspase-Aktivierung beteiligt, da eine Puma-spezifische siRNA unabhängig vom Bidstatus der Zellen antiapoptotisch wirkte. Im letzten Teil der Arbeit wurde untersucht, welche Proteasen für die durch gentoxische Agenzien induzierte Spaltung und Aktivierung von Bid verantwortlich sind. Obwohl Caspasen für die Exekutionphase der Oxa-induzierten Apoptose notwendig waren, trugen sie weder zur initialen Bidaktivierung noch zur mitochondrialen Depolarisierung bei, da sie erst postmitochondrial aktiviert wurden. Konventionelle Calpaine hingegen wurden nach DNA-Schädigung bereits stromaufwärts der Mitochondrien aktiviert und der Calpaininhibitor Calpeptin reduzierte nicht nur die Bid- und Caspasespaltung, sondern auch die mitochondriale Depolarisierung signifikant. Diese Protektion durch Calpeptin fiel in Bid-depletierten Zellen signifikant geringer als in Bid-profizienten Kontrollzellen aus. Auch war in Oxa-behandelten Bid kd Zellen, die eine durch Caspase-2, -3 und -8 nicht spaltbare Bidmutante exprimierten, trunkiertes Bid nachweisbar, dessen Generierung durch Calpain-, aber nicht durch Caspaseinhibierung verhindert werden konnte. Zusammenfassend deuten diese Ergebnisse auf eine Calpain-abhängige Bidaktivierung stromaufwärts der Mitochondrien hin und zeigen, dass die BH3-only Proteine Bid und Puma wichtige Vermittler der Oxa-induzierten Apoptose in HeLa Zellen darstellen.

Untersuchungen zum Mechanismus der Zytotoxizität von alkylierenden Agenzien in malignen Melanomzellen

Maligne Melanome sind gegenüber Chemotherapeutika relativ resistent. Das methylierende Alkylanz Temozolomid sowie das chlorethylierende und DNA-Interstrand Crosslink (ICL) bildende Alkylanz Fotemustin kommen bei der Behandlung des malignen Melanoms als Mittel erster Wahl zum Einsatz. In der vorliegenden Arbeit konnte das erste Mal nachgewiesen werden, dass die zytotoxische Wirkung von Temozolomid und Fotemustin in Melanomzellen durch Apoptose vermittelt wird. Unter Verwendung klinisch relevanter Dosen der beiden Alkylantien konnte die Induktion von Apoptose durch vier unabhängige Methoden (Bestimmung der SubG1-Fraktion und der Apoptose- / Nekrose-Frequenz, Aktivierung der Effektorcaspasen-3 und -7 sowie Spaltung von PARP-1) nachgewiesen werden. Die Alkylierungen an der O6-Position des Guanins, welche durch beide Agenzien induziert werden, sind auch in Melanomzellen die wichtigsten Zytotoxizität-bewirkenden Läsionen in der DNA, und die O6-Methylguanin-DNA-Methyltransferase (MGMT) ist folglich ein herausragender Resistenzmarker. Eine der verwendeten Zelllinien (D05) exprimierte p53-Wildtypprotein. Diese Zelllinie war resistenter als alle anderen Zelllinien gegenüber Temozolomid und Fotemustin. Dies weist darauf hin, dass p53 nicht die Apoptoseinduktion in Melanomzellen verstärkt. Die Prozessierung des O6MeG erfolgt über die Mismatch-Reparatur (MMR) unter Generierung von DNA-Doppelstrangbrüchen (DSBs). Die Untersuchung der durch Temozolomid induzierten DSBs, nachgewiesen durch gammaH2AX-Induktion, korrelierte direkt mit der apoptotischen Antwort von Melanomzelllinien und DSBs können somit als eine entscheidende apoptoseauslösende Größe angesehen werden. Eine Resistenz gegenüber dem methylierenden Temozolomid in der Zelllinie MZ7 konnte auf einen Defekt in der MMR-Schadenserkennung auf der Ebene des MutSalpha-Komplexes zurückgeführt werden. Dieser Defekt hatte keinen Einfluss auf die Fotemustin-vermittelte Apoptoseinduktion. Neben MGMT konnte somit die MMR als Resistenzfaktor gegenüber methylierenden Agenzien in Melanomen identifiziert werden. Die Fotemustin-induzierte Apoptose wurde in Melanomzelllinien im Detail untersucht. Es konnte erstmals gezeigt werden, dass Fotemustin-bedingte ICLs in Zellen einen G2/M-Arrest im Behandlungszyklus induzieren. Wie anhand G1-arretierter Zellen nachgewiesen werden konnte, war das Durchlaufen der DNA-Replikation vor Erreichen des Arrests für die Induktion der Apoptose notwendig. Die Prozessierung von ICLs ist im Vergleich zu Methylierungen der DNA deutlich komplexer. Dies könnte erklären, warum in Melanomzellen die durch gammaH2AX-Induktion repräsentierten DSBs nicht mit der Sensitivität der einzelnen Zelllinien korreliert. Die Untersuchung unterschiedlich sensitiver Zelllinien zeigte ein vergleichbares Schadensniveau an ICLs und eine ebenso vergleichbare initiale Prozessierung derselben unter Generierung von DSBs. Die Prozessierung dieser sekundären Läsionen, welche anhand der Abnahme von gammaH2AX-Foci untersucht wurde, war hingegen in der sensitiveren Melanomzelllinie deutlich weniger effektiv. Es konnte weiterhin nachgewiesen werden, dass eine uneffektive Prozessierung der sekundären Läsionen einhergeht mit einer verstärkten und länger anhaltenden Aktivierung der in der DSB-Detektion beteiligten Kinase ATM und der Checkpoint Kinase 1. Es wäre daher denkbar, dass eine verstärkte Aktivität dieser Kinasen proapoptotische Signale vermittelt. Unterschiede in der Prozessierung der sekundären Läsionen könnten somit ein wichtiger Marker der ICL-induzierten Apoptose darstellen. Des weitern konnte nachgewiesen werden, dass nach Fotemustingabe die mitochondrial-vermittelte Apoptose einen effektiven Exekutionsweg in Melanomen darstellt. Während Cytochrom C-Freigabe, Bcl-2-Abnahme an den Mitochondrien, Bax-Rekrutierung und Caspase-9 Aktivität nachgewiesen werden konnten, wurden keine Hinweise auf eine Fas-Rezeptor-vermittelte Apoptose gefunden. Die Unfähigkeit, Rezeptor-vermittelte Apoptose zu unterlaufen, könnte die Bedeutungslosigkeit des p53-Gens in Melanomen begründen, da gerade dieser Weg in der Alkylantien-induzierten Apoptose in anderen Zellsystemen eine große Relevanz besitzt. Bei der Suche nach einem alternativen proapoptotischen Signalweg konnten Hinweise für die Beteiligung des Rb/E2F-1-Wegs, welcher über p73 agiert, in einer p53-mutierten Melanomzelllinie gefunden werden. Einen Einfluss der Proteine Survivin und XIAP als Resistenzfaktoren auf die Fotemustin-induzierte Apoptose wurde hingegen nicht nachgewiesen.

Funktionelle Rolle von SNARE-Proteinen bei der Myelinisierung

Die Hauptfunktion der Oligodendrozyten im zentralen Nervensystem ist die Myelinisierung. Dabei umwickelt die Zelle mit Ausläufern ihrer Plasmamembran mehrmals die Axone. In den Phasen der aktiven Myelinisierung produziert ein Oligodendrozyt eine Fläche von 5000-50000 µm2 Myelin pro Tag, wobei große Mengen der Myelinkomponenten über vesikulären Transport zur Zelloberfläche transportiert werden müssen. Die Fusion der Vesikel mit ihrer Zielmembran wird duch SNARE-Proteine (soluble N-ethylmaleimide-sensitive-factor attachment protein receptor proteins) kontrolliert, die durch spezifische Interaktionen zwischen R- (Vesikel) und Q- (Zielmembran) SNAREs auch zur Spezifität der Fusion beitragen. Um die SNAREs den oligodendroglialen Transportrouten zuzuordnen, wurde deren Expression, Regulation und subzelluläre Lokalisation in primären Oligodendrozyten, in Oli-neu Zellen und im Myelin untersucht. Die Plasmamembran-Q-SNAREs Syntaxin 3, Syntaxin 4 und SNAP23, sowie das endosomale R-SNAREs VAMP3 zeigten eine zunehmende Expression im Verlauf der Oligodendrozytenreifung, die Expression von SNAP29 hingegen verminderte sich. Zudem akkumulierten die SNARE-Proteine Syntaxin 2, Syntaxin 3, Syntaxin 4 und VAMP7 im adulten Myelin, was für ihre Beteiligung an der Myelinisierung spricht. Co-Immunpräzipitationen ergaben u.a. Interaktionen zwischen den SNARE-Proteinen VAMP3 (R), Syntaxin 4 (Qa) und SNAP23 (Qbc). Anhand der beschriebenen Analyse konnten die SNARE-Proteine den oligodendroglialen Transportwegen zugeordnet werden. Immunzytochemische Analysen zeigten, dass das Hauptmyelinprotein PLP mit dem R-SNARE des Recycling Endosoms VAMP3, und mit dem spät endosomal, lysosomalen SNARE VAMP7 kolokalisiert. Um deren Rolle im PLP-Transport zu untersuchen, wurden verschiedene VAMP3- bzw. VAMP7-Silencing-Experimente durchgeführt. In beiden Fällen führte dies zu einer reduzierten Menge an PLP an der Zelloberfläche. Die Ergebnisse lassen somit auf zwei unabhängige Transportwege für PLP zur Plasmamembran von Oligodendrozyten schließen. Der VAMP7-abhängige PLP-Transport wurde zusätzlich in vivo in AP3-defizienten Mäusen, welche VAMP7 fehlsortieren, überprüft. Die Gehirne der mutanten Mäuse enthielten weniger Myelin, das isolierte Myelin enthielt weniger PLP und CNP. VAMP7 scheint also bei der Myelinisierung die Fusion von PLP- und CNP-enthaltenden Vesikeln mit der Myelinmembran zu vermitteln.

Spezifische Inhibition des Wnt-Signalwegs und die Analyse der Konsequenzen auf zellbiologischer Ebene

Der kanonische Wnt Signalweg ist durch Regulation einer Vielzahl von Zielgenen in unterschiedliche Prozesse wie Entwicklung, Wachstum und Differenzierung involviert. Fehlregulation des Signalwegs kann zur Tumorentstehung führen. Die exakte Rolle des Wnt Signalwegs und seiner Zielgene in der karzinogenen Kaskade ist noch nicht genau bekannt. In dieser Arbeit sollte die Beteiligung der Wnt Zielgene c-MYC, CCND1 (kodiert Cyclin D1) und VEGF an der Karzinogenese untersucht werden. Um die Funktionen der Wnt Zielgene und ihre zellulären Effekte unabhängig voneinander untersuchen zu können, wurden die Mengen der entsprechenden Transkriptionsprodukte durch siRNA (short interfering RNA) gezielt verringert. Die Konsequenzen der Inaktivierung wurden in Kolon- und Zervixkarzinomzelllinien untersucht, wobei die zellulären Parameter Proliferation, Apoptose, Metabolismus sowie Migration und Adhäsion untersucht wurden. Dabei konnte beobachtet werden, dass der Wnt Signalweg mit seinen Zielgenen Cyclin D1 und c-MYC die Proliferation mit dem Energiemetabolismus von Tumorzellen verknüpft. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass Cyclin D1 an der Regulation der zelluläre Migration und Adhäsion beteiligt ist, während VEGF die Apoptose abhängig vom zellulären Kontext inhibiert. Diese Ergebnisse liefern erste Hinweise auf die funktionelle Rolle der verschiedenen Zielgene im Prozess der Karzinogenese in Tumoren mit aktiviertem Wnt Signalweg. Damit ist diese Arbeit ein möglicher Ausgangspunkt für Studien mit dem Ziel der gezielten therapeutischen Beeinflussung des Wnt Signalwegs auf Ebene der Zielgene.

Transkriptionelle Kontrolle der Entwicklung und Funktion natürlich vorkommender CD4 + CD25 + regulatorischer T-Zellen

CD4+CD25+ natürlich vorkommende regulatorische T-Zellen (nTregs) repräsentieren in Menschen und Mäusen etwa 5-10% aller peripheren CD4+ T-Zellen und besitzen eine wichtige Aufgabe im Immunsystem. nTregs sind entscheidend an der peripheren Toleranz beteiligt, da sie potenziell autoaggressive T-Zellen in ihrer Cytokinproduktion und Proliferation hemmen. Trotzdem ist der molekulare Mechanismus der nTreg-vermittelten Suppression und der Entwicklung dieser nTregs noch weitestgehend unbekannt. Vor einigen Jahren wurde der Transkriptionsfaktor FoxP3 (Forkhead Box P3) als der „Hauptregulator“ für die Entwicklung und Funktion von nTregs identifiziert. Um die suppressiven Fähigkeiten von nTregs optimal für therapeutische Zwecke einsetzen zu können, ist es daher von großer Notwendigkeit den zugrundeliegenden molekularen Mechanismus zu verstehen und Moleküle zu identifizieren, die an der Regulation des nTreg-spezifischen Faktors FoxP3 beteiligt sind. Ein Teil dieser Arbeit beschäftigt sich mit der microRNA155 (miR155) bei der nTreg-vermittelten Suppression. Es konnte gezeigt werden, dass die ektopische Expression der miR155 in konventionellen CD4+ T-Zellen zu einer Erhöhung der IL-2 Produktion führte, so dass die Zellen resistenter gegenüber der nTreg-vermittelten Suppression wurden. Die transiente Aufhebung der Suppression durch die miR155 bietet somit einen möglichen therapeutischen Einsatz bei der Behandlung von Tumorerkrankungen. Weiterhin konnte in dieser Arbeit demonstriert werden, dass der Transkriptionsfaktor HELIOS, oder vielmehr seine lange Isoform, HELIOS_long, eine entscheidende Rolle bei der Regulation der FoxP3 Expression einnimmt. Im Vergleich zu konventionellen CD4+ T-Zellen exprimieren nTregs hohe Mengen an HELIOS. In in vitro Studien zeigte sich, dass endogenes HELIOS in nTregs an den FoxP3 Promotor binden und diesen aktivieren kann. Die ektopische Expression von HELIOS_long führte in konventionellen CD4+ T-Zellen (HELIOSlowFoxP3-) nur in Gegenwart der Cytokine IL-2 und TGF-β zu einer gesteigerten FoxP3 Promotor Aktivität. Neben der Aktivierung konnte auch eine gesteigerte FoxP3 Protein Expression detektiert werden. Diese in vitro Daten konnten auch in einem in vivo Mausmodell verifiziert werden. Der adoptive Transfer HELIOS_long transfizierter CD4+ T-Zellen (HELIOSlowFoxP3-) in T-Zell-defiziente Mäuse führte zu der Induktion FoxP3+ T-Zellen mit suppressiven Fähigkeiten sowohl ex vivo als auch in vivo. Zusammengefasst zeigte sich, dass der Transkriptionsfaktor HELIOS einen stark fördernden Einfluss auf die Expression von FoxP3 besitzt. Diese Beobachtung bietet eine Möglichkeit für die Induktion stabiler regulatorischer T-Zellen als therapeutischen Einsatz für die Behandlung von Autoimmunerkrankungen.

Das moderne Buch: Harry Graf Kesslers Ästhetik der Lebenskunst im Spiegel der Großherzog Wilhelm Ernst Ausgabe deutscher Klassiker

Die Großherzog Wilhelm Ernst Ausgabe deutscher Klassiker wurde seit 1904 bis in die Zwanziger Jahre hinein im Insel Verlag in Leipzig publiziert. Die Buchreihe hat nicht nur für den Verlag und die Druckerei Poeschel in der sie gedruckt wurde eine ganze Reihe von Neuerungen nach sich gezogen, auch für den deutschen Buchmarkt hat die Klassikerausgabe einen Meilenstein bedeutet. Sie hat einige Eigenschaften des Taschenbuches vorweggenommen. Sie orientierte sich an der Qualität bibliophiler Buchpublikationen, aber war dennoch preislich erschwinglich. Zeitgenössische Klassikerausgaben erschienen zumeist mit einem Kommentar. Nicht so die Großherzog Wilhelm Ernst Ausgabe. Der Text wurde zwar von führenden Wissenschaftlern editiert, aber sie war dennoch unkommentiert. Der Text war in einer Jenson-Antiqua gesetzt obwohl die Debatte um individuell gestaltete Künstlerschriften und die Diskussion um die als deutsche Schrift begriffene Fraktur unter den wichtigsten Protagonisten des deutschen Buchgewerbes ihren Höhepunkt noch nicht erreicht hatte. Ziel für die Klassikerausgabe war darüber hinaus, das zur Jahrhundertwende leicht angestaubte Image der Stadt Weimar aufzupolieren. Über das Patronat des Großherzogs hinaus hätte man die Gewinne aus dem Verkauf der Bücher der Permanenten Ausstellung für die Anschaffung von modernen Kunstobjekten zur Verfügung stellen wollen, die unter der Leitung von Harry Graf Kessler stand. Sieht man den Inhalt der Werke der in der Klassikerreihe erschienen Dichter Goethe, Schiller und Körner in einem ästhetischen Kontext mit dem der Philosophen Schopenhauer und Kant, wird im Spiegel der Formalästhetik der Klassikerausgabe Graf Kesslers Bildungs- und Kulturbegriff erkennbar, der sich in den Jahren nach der Jahrhundertwende zu seinem Lebenskunstideal verdichtete. Der zerrütteten Existenz der Zeitgenossen, wie Friedrich Nietzsche sie beschrieben hatte, sollte der Inhalt der Ausgabe in seiner modernen Form eine moderne Wertehaltung entgegensetzen. Die Lektüre der Klassiker sollte den deutschen Philister „entkrampfen“ und ihm ein Stück der verloren geglaubten Lebensfreude wieder zurück bringen, in dem dieser auch die Facetten des Lebensleids als normal hinnehmen und akzeptieren lernte. Die Klassikerausgabe repräsentierte aus diesem Grund auch den kulturellen und politischen Reformwillen und die gesellschaftlichen Vorstellungen die der Graf für ein modernes Deutschland als überfällig erachtete. Die Buchreihe war aus diesem Grund auch ein politisches Statement gegen die Beharrungskräfte im deutschen Kaiserreich. Die Klassikerreihe wurde in der buchhistorischen Forschung zwar als bedeutender Meilenstein charakterisiert und als „wichtiges“ oder gar „revolutionäres“ Werk der Zeit hervorgehoben, die Ergebnisse der Forschung kann man überspitzt aber in der Aussage zusammenfassen, dass es sich bei der Großherzog Wilhelm Ernst Ausgabe um einen „zufälligen Glückstreffer“ deutscher Buchgestaltung zu handeln scheint. Zumindest lassen die Aussagen, die bisher in dieser Hinsicht gemacht wurden, keine eindeutige Einordnung zu, außer vielleicht der, dass die Klassiker von der englischen Lebensreform inspiriert wurden und Henry van de Velde und William Morris einen Einfluss auf ihre äußere Form hatten. Gerade die Gedankenansätze dieser Beiden nutzte Graf Kessler aber für eigene Überlegungen, die ihn schließlich auch zu eigenen Vorstellungen von idealer Buchgestaltung brachten. Da für Kessler auch Gebrauchsgegenstände Kunst sein konnten, wird das Konzept der Klassikerausgabe bis zur Umsetzung in ihrer `bahnbrechenden´ Form in das ideengeschichtliche und ästhetische Denken des Grafen eingeordnet. Die Klassiker werden zwar in buchhistorischen Einzeluntersuchungen bezüglich ihrer Komponenten, dem Dünndruckpapier, ihrem Einband oder der Schrifttype exponiert. In buchwissenschaftlichen Überblicksdarstellungen wird ihr Einfluss hingegen weniger beachtet, denn verschiedene Kritiker bezogen sie seit ihrem ersten Erscheinen nicht als deutsches Kulturgut mit ein, denn sie lehnten sowohl die englischen Mitarbeiter Emery Walker, Edward Johnston, Eric Gill und Douglas Cockerell wie auch ihre Gestaltung als „welsche“ Buchausgabe ab. Richtig ist, die Großherzog Wilhelm Ernst Ausgabe hatte dieselbe Funktion wie die von Graf Kessler in Weimar konzipierten Kunstausstellungen und die dortige Kunstschule unter der Leitung seines Freundes Henry van de Velde. Auch das für Weimar geplante Theater, das unter der Leitung von Hugo von Hofmannsthal hätte stehen sollen und die Großherzog Wilhelm Ernst Schule, hätten dieselben Ideen der Moderne mit anderen Mitteln transportieren sollen, wie die Großherzog Wilhelm Ernst Ausgabe deutscher Klassiker.

Phylogenie und Biogeographie der Linoideae (Linaceae) - Evolution von Heterostylie, Homostylie in Linum

Die Linaceae-Linoideae, vor allem die Gattung Linum, wurden unter Verwendung von zwei molekularen Markern (rbcL und ITS) bzgl. ihrer Phylogenie und Biogeographie untersucht. Die Linaceae entstanden während der mittleren Kreide in den frühen tropischen Regenwäldern, von wo aus sich die monophyletischen Linoideae vor etwa 51-46 Mill. Jahren über die temperaten Gebiete der Nordhemisphäre ausbreiteten. Während die drei basal abspaltenden Gattungen Anisadenia, Reinwardtia und Tirpitzia bzgl. ihrer Verbreitung auf Südostasien beschränkt sind, ist die Gattung Linum heute auf allen Kontinenten vertreten. Der Ursprung von Linum liegt wahrscheinlich in Südwestasien bzw. dem östlichen Mediterraneum, wo es im Oligozän zur Aufspaltung in zwei Entwicklungslinien kam ('Blaue Gruppe' und 'Gelbe Gruppe'). Während die überwiegend blaublühenden Linum-Arten ('Blaue Gruppe') vor allem in Europa und Südwestasien vorkommen, weisen die Vertreter der 'Gelben Gruppe' ein wesentlich größeres Verbreitungsgebiet auf. Gelbblühende Linum Arten findet man auf allen Kontinenten mit Diversitätszentren in Nordostamerika und Südwestasien. Interessanterweise wurde Amerika zweimal unabhängig voneinander besiedelt. Während die gelbblühenden Arten vor etwa 22-20 Mill. Jahren von Westeuropa über den Atlantik den amerikanischen Kontinent erreichten, wanderten Vertreter der 'Blauen Gruppe' im Pliozän (vor 3.78-3.33 Mill Jahren) über die Bering-Landbrücke in die Neue Welt ein. Auch in Südafrika sind einige gelbblühende Linum-Arten zu verzeichnen, die nicht über Nordafrika (wo einige Arten der 'Gelben Gruppe' beheimatet sind) die südliche Spitze des Kontinents erreichten, sondern von Amerika aus. Die molekularphylogenetischen Ergebnisse legen eine Eingliederung der Gattungen Cliococca, Hesperolinon, Radiola und Sclerolinon in Linum nahe, die durch morphologische Merkmale gestützt wird. Linopsis, die artenreichste Sektion der Gattung Linum, bedarf einiger Umstrukturierungen auf der Basis der molekularen und morphologischen Daten. Ein interessantes Phänomen innerhalb der Linaceae ist das Vorkommen von heterostylen und homostylen Arten innerhalb der Familie. Die Kombination der molekular-phylogenetischen Ergebnisse mit morphologischen Beobachtungen des Reproduktionssystems lassen darauf schließen, dass sich Homostylie innerhalb von Linum mehrfach unabhängig voneinander entwickelt hat. Das Modell von Primula wurde als Grundlage verwendet, um Aufschluss über die Entstehung der Homostylie innerhalb von Linum zu erlangen. Aus Primula ist bekannt, dass eine Kopplungsgruppe aus mindestens drei Genen an der Vererbung von Heterostylie beteiligt ist: G/g kodiert hierbei die Griffellänge und die Selbstinkompatibilitäts-reaktion der Narbe, A/a die Länge der Filamente und P/p die Selbst-inkompatibilitätsreaktion des Pollens. Umfangreiche Kreuzungs-experimente einer homostylen und einer heterostylen Linum-Art deuten darauf hin, dass die Genotypen der beiden Blütenformen in heterostylen Linum-Arten denen in Primula entsprechen. Langgriffel sind hiernach homozygot rezessiv (gpa/gpa), während die Kurzgriffel heterozygot sind (GPA/gpa). Selbstkompatible, homostyle Arten können theoretisch durch verschiedene Rekombinations-ereignisse entstehen. Erste Ergebnisse der rasterelektronen-mikroskopischen Betrachtung der Pollenkornoberflächen und Narbenpapillen deuten darauf hin, dass innerhalb von Linum Homostylie durch unterschiedliche Rekombinations-ereignisse mehrfach aus heterostylen Arten entstanden ist. So besitzt die homostyle Linum leonii den Genotyp gPA/gPA, während für die homostylen L. tenuifolium und L. nodiflorum der Genotyp Gpa/Gpa wahrscheinlich ist.

Evaluation der Langzeitcompliance lebertransplantierter Patienten mit der immunsuppressiven Therapie und eines Betreuungsmodells zur intersektoralen kooperativen pharmazeutischen Betreuung durch eine Krankenhausapotheke und öffentliche Apotheken

Ein wichtiger Baustein für den langfristigen Erfolg einer Lebertransplantation ist die Compliance mit der lebenslang einzunehmenden immunsuppressiven Therapie. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde erstmals mittels MEMS® die Compliance bei lebertransplantierten Patienten untersucht, deren Transplantation einige Jahre zurücklag. Rekrutiert wurden Patienten, die vor 2, 5, 7 oder 10 Jahren (Gruppe 2 y.p.t., 5 y.p.t., 7 y.p.t., 10 y.p.t.) in der Universitätsmedizin Mainz lebertransplantiert wurden. 39 Patienten nahmen an der prospektiven Anwendungsbeobachtung teil. Die Compliance wurde mittels MEMS® über eine Beobachtungszeit von 6 Monaten erfasst. Bei der MEMS®-Auswertung war zu vermuten, dass 10 Patienten diese nicht wie vorgesehen verwendet hatten. Folglich konnten die mittels MEMS® gemessenen Compliance-Parameter nur für 29 Patienten valide ermittelt werden. Die mittlere Dosing Compliance betrug 81 ± 21 %, wobei die Gruppe 2 y.p.t. mit 86 ± 14 % bessere Werte zu verzeichnen hatte als die Gruppe 5 y.p.t. (75 ± 27 %) und 7 y.p.t. (74 ± 28 %). Die Ergebnisse waren jedoch nicht signifikant unterschiedlich (p=0,335, Kruskal-Wallis-Test). Unter Einbeziehung aller mittels MEMS® gemessenen Compliance-Parameter wurden 19 von 29 Patienten (66 %) als compliant eingestuft. Bei der Analyse der Gesamtcompliance basierend auf den subjektiven Compliance-Messmethoden (Morisky-Fragebogen, MESI-Fragebogen, Selbsteinschätzung), der Arzneimittel-Blutspiegel und der Anzahl an Abstoßungsreaktionen, in der alle 39 Patienten einbezogen werden konnten, wurden 35 Patienten (90 %) als compliant eingestuft. rnIm zweiten Teil der Arbeit wurde die Etablierung und Bewertung eines intersektoralen Pharmazeutischen Betreuungskonzepts für lebertransplantierte Patienten untersucht. Erstmals wurden anhand eines entwickelten schnittstellenübergreifenden, integrierten Betreuungskonzepts niedergelassene Apotheker in die Pharmazeutische Betreuung lebertransplantierter Patienten eingebunden. 20 Patienten wurden rekrutiert und während ihres stationären Aufenthaltes nach Transplantation pharmazeutisch betreut. Die Betreuung umfasste eine intensive Patientenschulung mit drei bis vier Gesprächen durch einen Krankenhausapotheker. Während des stationären Aufenthaltes wurden arzneimittelbezogene Probleme erkannt, gelöst und dokumentiert. Bei Entlassung stellte der Krankenhausapotheker einen Medikationsplan für den Hausarzt sowie für den niedergelassenen Apotheker aus und führte mit den Patienten ein ausführliches Entlassungsgespräch. Darüber hinaus wurden den Patienten Arzneimitteleinnahmepläne und eine Patienteninformation über ihr immunsuppressives Arzneimittel übergeben. 15 Patienten konnten daraufhin ambulant von niedergelassenen Apothekern pharmazeutisch weiterbetreut werden. Das kooperierende pharmazeutische Personal wurde durch ein eigens für die Studie erstelltes Manual zur Pharmazeutischen Betreuung lebertransplantierter Patienten geschult und unterstützt. Die niedergelassenen Apotheker sollten die Patienten in ihrer Arzneimitteltherapie begleiten, indem Beratungsgespräche geführt und arzneimittelbezogene Probleme erkannt und gelöst wurden. Die Nutzeffekte der intensiven Pharmazeutischen Betreuung konnte anhand verschiedener Erhebungsinstrumente dargelegt werden. Im Ergebnis resultierte eine hohe Zufriedenheit der Patienten und Apotheker mit dem Betreuungskonzept, die mittels Selbstbeurteilungsfragebögen ermittelt wurde. Die Compliance der Patienten wurde anhand des Morisky- und MESI-Fragebogens, der Selbsteinschätzung der Patienten, Blutspiegelbestimmungen sowie der Einschätzung durch den niedergelassenen Apotheker bestimmt. 86 % der Patienten wurden als compliant eingeordnet. Die Kenntnisse der Patienten über ihre immunsuppressive Therapie, welche anhand von Interviews erfragt wurden, lagen auf einem sehr hohen Niveau. Abschließend kann festgestellt werden, dass die Pharmazeutische Betreuung lebertransplantierter Patienten in den niedergelassenen Apotheken durchführbar ist. Anhand der Dokumentationsprotokolle lässt sich allerdings nur sehr schwer beurteilen, in welchem Maße die Betreuung tatsächlich erfolgte. Das tatsächliche vorliegen einer mangelnden Betreuung oder aber eine lückenhafte Dokumentation der Betreuungsleistung war nicht zu differenzieren. Ein limitierender Faktor für die intensivierte Betreuung ist sicherlich der erhebliche Aufwand für nur einen Patienten mit einem seltenen Krankheitsbild. Das Erkennen und Lösen von 48 ABP durch den Krankenhausapotheker und 32 ABP durch die niedergelassenen Apotheker, d. h. insgesamt 4,5 ABP pro Patient zeigt, dass die Pharmazeutische Betreuung einen wichtigen Beitrag für eine qualitätsgesicherte Arzneimitteltherapie leistet. Die intersektorale Pharmazeutische Betreuung stellt eine wesentliche Hilfe und Unterstützung der Patienten im sicheren Umgang mit ihrer Arzneimitteltherapie dar.rn

Die Rolle der Mastzelle bei der Entstehung einer allergischen Atemwegserkrankung

In der vorliegenden Arbeit wurde die Rolle der Mastzelle und deren Mediatoren für die Entstehung einer allergischen Atemwegsentzündung untersucht. Anhand von zwei mastzelldefizienten Mausstämmen (C57BL/6-KitWsh/Wsh und WBB6FI-KitW/Wv), konnte gezeigt werden, dass Mastzellen an der Entstehung einer allergischen Entzündung und Atemwegsüberempfindlichkeit beteiligt sind. Durch die Rekonstitution von mastzelldefizienten Tieren mit aus Knochenmark gewonnenen Mastzellen (BMMC) von Wildtyp-Spendern konnte die wichtige Funktion der Mastzelle in diesem Model bestätigt werden. Überdies konnte durch die Rekonstitution mit TNF-defizienten BMMC eine wichtige Rolle für diesen mastzellproduzierten Mediator im allergischen Modell demonstriert werden. Weiterhin konnte die Arbeit zeigen, dass Mastzellen wichtig für die Migration von antigenbeladenen Dendritischen Zellen aus der Lunge in die regionalen Lymphknoten sind. Dieses stellt einen wichtigen Schritt für die Ausbildung einer lokalen allergischen Antwort dar. Im Gegensatz dazu war die Entstehung einer allergischen Atemwegserkrankung nach Transfer von in vitro generierten DC und Allergenprovokation nicht mastzellabhängig. Diese Ergebnisse zeigen, dass es auf die Wahl des Sensibilisierungs- und Provokationsmodels ankommt, um mastzellspezifische Effekte zu demonstrieren. Die vorliegende Arbeit zeigt die wichtige Rolle der Mastzelle und von mastzellproduziertem TNF bei der Ausbildung einer allergischen Entzündung der Atemwege. Die Mastzelle und deren Mediatoren stellen somit mögliche Ziele für die therapeutische Behandlung der allergischen Entzündung der Atemwege dar.

Gen knockdown der Metalloproteasen Meprin alpha 1, alpha 2 und beta im Zebrabärbling Danio rerio

Die Metalloproteasen Meprin α und β übernehmen Schlüsselfunktionen in vielen (patho-) physiologischenrnProzessen. So sind sie beteiligt an der Umstrukturierung der extrazellulären Matrix, an immunologischenrnReaktionen oder an entzündlichen Gewebserkrankungen. Die beiden Enzyme kommenrnhauptsächlich in den Bürstensaummembranen von Niere und Darm sowie in der Haut von Vertebratenrnvor. Für die Erforschung der biologischen Aktivität der Meprine wurde in dieser Arbeit der ModellorganismusrnDanio rerio verwendet, der vor allem durch die Möglichkeit der gentechnischen Manipulationrnprädestiniert ist. Im Fisch konnten drei homologe Enzyme (Meprin α1, α2 und β) nachgewiesenrnwerden. Während mRNA-Analysen eine nahezu ubiquitäre Verteilung der Meprine offenbarten,rnkonnte ich mittels spezifischer Antikörper die Expression auf Proteinebene nachweisen. WährendrnMeprin α1 und β verstärkt im Darmepithel und in der Epidermis lokalisiert sind, konnte Meprinrnα2 ausschließlich in der Lamina propria des Darms identifiziert werden.rnDer Hauptteil der vorliegenden Arbeit zielt auf die spezifische Reduzierung des Expressionslevels derrnMeprine in Embryonen des Zebrabärblings. Dies wurde durch die Mikroinjektion von sogenanntenrnMorpholinos in die Zygote erzielt. Morpholinos sind RNA-Moleküle, die spezifisch an die mRNA desrnZielproteins binden können und die Translation verhindern. Die auftretenden Effekte durch das Fehlenrnder Meprine lassen so Rückschlüsse auf ihre physiologische Funktion zu. Nach der Injektion vonrnMorpholinos gegen Meprin α1 zeigten sich lediglich leichte epidermale Deformationen. Bei Meprin βrnhingegen kam es zu einer massiven Fehlbildung von Organen im Rumpf- und Schwanzbereich. Diesesrnführte zu erheblichen Defekten; die Embryonen starben innerhalb der ersten 24 Stunden nach derrnBefruchtung. Demzufolge müssen Meprin α1 und Meprin β insbesondere an der Gewebsdifferenzierungrnbeteiligt sein. Dies korreliert mit verschiedenen Experimenten, u.a. an knockout Mäusen, ausrndenen hervorgeht, dass die Prozessierung und Aktivierung der Cytokine Interleukin-1β oder Interleukin-rn18 durch Meprin β erfolgen kann.rnDie Injektion von Meprin α2-Morpholinos erbrachte ein weiteres, eindrucksvolles Ergebnis: Das Blutgefäßsystemrnvon injizierten Embryonen war vollständig unterbrochen und es sammelten sich Erythrozytenrnim Bereich der Caudalvene an. Diese Phänotypen gleichen den knockdown-Experimenten mitrndem vascular endothelial growth factor VEGF-A, dem entscheidenden Wachstumsfaktor in der Angiogenesern(Blutgefäßbildung). Eine Inkubation des humanen VEGF-A mit (humanem) rekombinantemrnMeprin α bzw. β führte zu einer differenzierten Prozessierung des Moleküls. Diese Ergebnisse legenrnnahe, dass Meprin α pro-angiogenetisch wirkt, indem es VEGF-A prozessiert und damit die Gefäßbildungrnaktiviert. Aus den Daten dieser Arbeit wird die hohe Signifikanz der Meprine für die Proliferationrnund Differenzierung spezieller Gewebe deutlich, welche somit eine wichtige Grundlage für Studienrnan höheren Vertebraten darstellt.

Methodische Untersuchung zur Diagnostik der bronchialen Hyperreagibilität mit Hilfe eines inhalativen Methacholin-Provokationstests

Die unspezifische Provokation mit Methacholin ist die am weitesten verbreitete und akzeptierte Methode zur Diagnose bzw. zum Ausschluss der bronchialen Hyperreagibilität bei Patienten mit Verdacht auf ein Asthma bronchiale und zu dessen Therapiekontrolle. Um die Sicherheit und die Genauigkeit der Methode weiter zu verbessern, wurde daher ein Dosimeterprotokoll entwickelt, das die inhalierte Methacholin-Dosis anstatt durch die Erhöhung, d.h. in der Regel Verdoppelung, der Methacholinkonzentrationen nur durch Erhöhung der Anzahl der Inhalationen bei konstanter, niedriger Konzentration der Methacholinlösung steigert. Dieses neue Protokoll wurde verglichen mit anderen weit verbreiteten Methacholin-Provokationsprotokollen. Die Methacholinchlorid-Lösung (1,75 mg/ml) wurde mit Hilfe des Dosimetersystems ZAN 200 ProvAir II sowie des Verneblertopfes DeVilbiss 646 vernebelt. 15 Asthmapatienten mit einer vor der Provokation normalen Lungenfunktion (FEV1 98 +/- 9 % PN) und 18 Lungengesunde (FEV1 110 +/- 12 % PN) nahmen an der Testreihe teil. Begonnen wurde mit einer Dosis von 20 μg Methacholinchlorid (= eine Inhalation); beendet wurde der Versuch bei einer Kumulativdosis von 2000 μg Methacholinchlorid, wenn nicht vorher ein Kriterium für einen positiven Test und damit für einen Versuchsabbruch erfüllt wurde. Abbruchkriterien waren entweder ein Abfall der FEV1 um 20 % des Ausgangswertes oder ein Anstieg des totalen Atemwegswiderstandes auf ≥ 0,5 kPa*s/l. Mittels linearer Regression wurden die Provokationsdosen PD 20 FEV1 und PD Rtot ≥ 0,5 berechnet. Im Vergleich mit anderen Protokollen zeigte sich, dass auch das neue Protokoll zuverlässig und sicher zwischen gesund und krank unterscheidet. Der Median der PD 20 FEV1 liegt in der Gruppe der Asthmatiker bei 222 μg, bei den Lungengesunden bei 2000 μg; daraus ergibt sich ein p-Wert von < 0,001. In Bezug auf die PD Rtot ≥ 0,5 liegt der Median bei den Asthmatikern bei 122 μg, in der Gruppe der Lungengesunden bei 2000 μg; hieraus errechnet sich ebenfalls ein p-Wert von < 0,001. Sensitivität und Spezifität der Methode wurden mittels ROC-Kurven untersucht. Basierend auf der PD 20 FEV1 liefert die Methode für die Diagnose einer bronchialen Hyperreagibilität bei einer Enddosis von 1000 μg Methacholinchlorid eine Sensitivität von über 93 % und eine Spezifität von 83 %; basierend auf der PD Rtot ≥ 0,5 liegt die Sensitivität bei einer Dosis von 1000 μg bei 90 %, die Spezifität bei 89 %. Für die gemeinsame Betrachtung der parameterspezifischen Provokationsdosen PD 20 FEV1 und PD Rtot ≥ 0,5, der PD Minimal, bei 1000 μg liegt die Sensitivität bei über 93 % und die Spezifität bei 83 %. Daher können 1000 μg als Schwellendosis für den Ausschluss einer bronchialen Hyperreagibilität zum Untersuchungszeitpunkt angesehen werden, und der Test darf an diesem Punkt abgebrochen werden. Grundsätzlich ist festzustellen, dass die Diagnostik der bronchialen Hyperreagibilität sicher und genau mit Hilfe eines Dosimeterprotokolls erfolgen kann, das die Methacholin-Dosis nur durch die Steigerung der Inhalationen bei gleichbleibender Konzentration der Methacholinlösung erhöht. Die Schwellendosis zwischen normaler und pathologischer bronchialer Reaktion, Sensitivität und Spezifität sowie die Trennschärfe der Methode sind sehr gut vergleichbar mit anderen bisher etablierten Protokollen.