Ursachen der unterschiedlichen Oligomerisierung von Lichtsammelproteinen

Die verschiedenen Lichtsammelproteine (Lhc-Proteine) höherer Pflanzen unterscheiden sich im Oligomerisierungsverhalten. Im Photosystem II existieren 6 Lhc-Proteine, die entweder die monomeren Lichtsammelkomplexe (LHC) CP24 (Lhcb6), CP26 (Lhcb5) und CP29 (Lhcb4) oder den trimeren LHCII (Lhcb1, Lhcb2 und Lhcb3) bilden. Im Photosystem I sind laut Kristallstruktur vier Lhc-Proteine lokalisiert, die als Heterodimere organisiert vorliegen. Der schwerpunktmäßig untersuchte LHCI-730 setzt sich aus Lhca1 und Lhca4 zusammen, während der LHCI-680 aus Lhca2 und Lhca3 besteht. Das Ziel der Arbeit bestand in der Identifizierung der für das unterschiedliche Oligomerisierungsverhalten verantwortlichen Proteinbereiche und Aminosäuren. Die für diese Arbeit generierten Consensussequenzalignments verschiedener Lhca- und Lhcb-Proteine vieler Arten unterstützen die Folgerungen aus Strukturdaten und anderen Sequenzalignments, dass den LHCs eine gemeinsame Monomerstruktur zu Grunde liegt. Die Helices 1 und 3 weisen weitgehend sehr hohe Sequenzidentitäten auf, während die N- und C-Termini, die zwei Schleifenregionen und die Helix 2 nur schwach konserviert sind. Falls die Bereiche mit hoher Sequenzübereinstimmung für das Zustandekommen ähnlicher monomerer LHC-Strukturen verantwortlich sind, könnten in den schwach konservierten Domänen die Ursachen für das unterschiedliche Oligomerisierungsverhalten lokalisiert sein. Aufgrund dessen wurden die schwach konservierten Domänen des monomerisierenden Lhcb4, des mit dem Lhca1 dimerisierenden Lhca4 und des Trimere bildenden Lhcb1 gegen die entsprechenden Domänen der anderen Proteine ausgetauscht und bezüglich ihres Oligomerisierungsverhaltens untersucht. Im Lhca4 konnten mit der Helix 2 und der stromalen Schleife zwei für eine Heterodimerisierung essentielle Domänen gefunden werden. Im Lhcb1 waren neben dem N-Terminus auch die 2. Helix und die stromale Schleifendomäne unentbehrlich für eine Trimerisierung. Zusätzlich waren Dimerisierung und Trimerisierung bei Austausch der luminalen Schleife beeinträchtigt. Ein geringer Beitrag zur Lhcb1-Trimerisierung konnte auch für den C-Terminus belegt werden. Ein zusätzliches Ziel der Arbeit sollte der Transfer der Oligomerisierungseigenschaften durch umfangreichen Domänentausch von einem auf ein anderes Protein sein. Der Transfer der Fähigkeit zur Dimerbildung durch Substitution gegen essentielle Lhca4-Domänen (50% luminale Schleife, 100% Helix 2 und 100% stromale Schleife) gelang beim Lhcb4, nicht aber beim Lhcb1. Der Transfer der Trimerisierungsfähigkeit auf Lhca4 und Lhcb4 scheiterte. Eine Lhca1-Mutante mit allen für eine Dimerisierung essentiellen Lhca4-Domänen, die durch Interaktion einzelner Moleküle untereinander multimere LHCs bilden sollte, war bereits in ihrer Monomerbildung beeinträchtigt. Eine Übertragung der Oligomerisierungsfähigkeit auf andere Proteine durch massiven Domänentransfer gestaltete sich somit schwierig, da vermutlich im mutierten Protein immer noch ursprüngliche Tertiärstrukturanteile enthalten waren, die nicht mit den transferierten Proteinbestandteilen kompatibel sind. Bei zukünftigen Experimenten zur Klärung der Transferierbarkeit der Oligomerisierungseigenschaft sollten deswegen neben dem unberücksichtigten 1. Teil der luminalen Schleife auch wenig konservierte Aminosäuren in der 1. und 3. Helix Beachtung finden. Ein weiteres Ziel dieser Arbeit war es, die LHCI-730-Dimerisierung im Detail zu untersuchen. Mutationsanalysen bestätigten den von früheren Untersuchungen bekannten Einfluss des Isoleucins 103 und Histidins 99. Letzteres geht möglicherweise durch sein gebundenes Chlorophyll eine Interaktion mit dem Lhca1 ein. Das Phenylalanin 95 stellte sich ebenfalls als ein wichtiger Interaktionspartner heraus und könnte in Wechselwirkung mit einem zwischen Lhca1 und Lhca4 lokalisierten Phosphatidylglycerin treten. Das ebenfalls an der Dimerbildung beteiligte Serin 88 des Lhca4 könnte auf Grund der räumlichen Nähe bei Modellierungen direkt mit dem am C-Terminus des Lhca1 lokalisierten Glycin 190 interagieren. Darüber hinaus wurde ein in der luminalen Lhca4-Schleife lokalisiertes Phenylalanin 84 als Interaktionspartner des Tryptophans 185 im C-Terminus von Lhca1 identifiziert. Der simultane Austausch des Isoleucins 109 und Lysins 110 in der stromalen Schleife des Lhca4, konnte deren Einfluss auf die Dimerisierung belegen. Nachdem bislang an der Dimerbildung beteiligte Aminosäuren am N- und C-Terminus des Lhca1 und Lhca4 identifiziert werden konnten, wurden in dieser Arbeit viele an einer Dimerbildung beteiligten Proteinbereiche und Aminosäuren in der Helix 2 und den Schleifenregionen des Lhca4 identifiziert. Um alle an der Lhca1-Lhca4-Interaktion beteiligten Aminosäuren aufzuklären, müssten durch Mutationsanalysen die in der stromalen Lhca4-Schleife vermuteten Interaktionspartner des für die Dimerisierung wichtigen Tryptophans 4 am N-Terminus von Lhca1 identifiziert, und die in der Helix 3 des Lhca1 vermuteten Interaktionspartner der Helix 2 des Lhca4 ermittelt werden.

Photosynthetic light-harvesting complexes (LHCs) are assembled from apoproteins (Lhc proteins) and non-covalently attached pigments. Despite a considerable amino acid sequence identity, these proteins differ in their oligomerization behavior. In Photosystem (PS) II exist 6 Lhc proteins. They either form the monomeric LHCs CP24 (Lhcb6), CP26 (Lhcb5) and CP29 (Lhcb4) or the trimeric LHCII (Lhcb1, Lhcb2, Lhcb3). According to the crystal structure of PSI, the LHCI consists of 4 Lhc-proteins, arranged as heterodimers. LHCI-730 consists of Lhca1 and Lhca4. Lhca3 and Lhca2 form the LHCI-680. The objectives were to identify protein regions and amino acid residues responsible for their different oligomerization behaviour. Lhc-protein sequences of different species were used to generate consensus sequence alignments from different Lhca- and Lhcb-proteins. The obtained data of the sequence alignments and the information of several crystal structures reveal that all Lhc-proteins share the same monomeric structure. The helices 1 and 3 show very high sequence identities. Since the N- and the C-Terminus, the loop regions and the second TMH exhibit the lowest degree of amino acid sequence conservation it can be expected that these regions play a decisive role in achieving different oligomerization. In order to verify this assumption the weakly conserved domains of the Lhcb4 (monomeric), the Lhca4 (dimeric with Lhca1) and the Lhcb1 (trimeric) were exchanged against each other and examined regarding to their oligomerization behaviour. In Lhca4 the helix 2 and the stromal loop were the essential domains for heterodimerization. In Lhcb1 the N-terminus, the helix 2 and the stromal loop were the required domains for trimerization. Additionally the substitution of the luminal loop affected heterodimerization as well as trimerization. The C-terminus of the Lhcb1 showed a less contribution to trimerization. Furthermore to confer oligomerization behaviour from one Lhc protein to another, several domains of individual Lhc proteins were exchanged simultaneously. The transfer of the heterodimerization capability by swapping the important Lhca4-domains (50% luminal loop, 100% helix 2 und 100% stromal loop) into other Lhc-proteins succeeded with Lhcb4, but not with Lhcb1. However, the ability of forming trimers could not be transferred from Lhcb1 to Lhca4 or Lhcb4. The obtained results indicate that transfer of the oligomerization behaviour from one Lhc protein to another requires extensive domain replacements. This led often to instable monomers, because the chimerical proteins presumably contained information of the original tertiary structure, which is incompatible with the transferred protein domains. Therefore future experiments to transfer the oligomerization behaviour should reconsider the first part of the lumenal loop and the weakly conserved amino acids in the 1st and 3rd helix. A detailed examination of the LHCI-730 dimerization was an additional goal of investigation. Mutational analysis confirmed the influence of the isoleucine 103 and the histidin 99 of Lhca4 from previous studies. The chlorophyll coordinated by histidin 99 is possibly interacting with Lhca1. Thus, lipids could be involved in mediating interactions emanating from phenylalanine 95. Such an assumption is in line with the positioning of phophatidylglycerine in a PSI structure obtained by modeling. The model shows, that serine 88 of Lhca4 could interact directly with the glycine 190, located in the C-terminus of Lhca1. Furthermore phenylalanine 84 of Lhca4 was identified experimentally to interact with tryptophane 185 at the C-terminus of Lhca1. Simultaneous transfers of isoleucine 109 und lysine 110 in the stromal loop of Lhca4 demonstrated the importance of this protein domain. The present work revealed the existence of additional amino acids involved in the interaction between the Lhca1 and Lhca4 subunits and provides a more detailed picture of the interaction sites in the heterodimeric LHCI-730 and partly confirmed assumptions obtained on the basis of modeling. Finally, indications were obtained that the C- and N-terminal domains of Lhca1 interact with the loop regions of Lhca4 and it will be interesting to identify the amino acid(s) involved in this interaction to get a complete picture of the interactions responsible for the formation and stabilization of LHCI-730.