Ecdysteroid-responsive genes: E75 and Retinoid X Receptor (RXR), essential molt-regulating genes in the shrimp, Fenneropenaeus chinensis

本论文主要研究两种重要的调节蜕皮过程的基因—蜕皮激素效应基因E75和RXR在中国明对虾蜕皮中的作用。利用RT-PCR和RACE技术获得了编码FcE75和FcRXR的全长cDNA序列。FcRXR包含7个内含子，在对虾中存在不同的异形体，命名为RXR-1和RXR-2。应用荧光实时定量PCR分析表明FcE75和FcRXR基因在中国明对虾蜕皮前期（D3）其转录表达量明显上调。另外，FcE75和FcRXR基因在不同组织中的转录表达存在明显的差异。利用FcE75和FcRXR基因的双链RNA注射对虾能有效降低FcE75和FcRXR的表达水平。FcE75和FcRXR的体内沉默完全抑制了对虾的蜕皮过程，并且引起对虾的死亡。对不能正常蜕皮个体进行观察的结果表明，FcE75沉默的对虾，其上皮的收缩、新的刚毛及新表皮的形成均收到限制。在FcE75双链RNA沉默后的对虾中，我们检测了与蜕皮相关的一些效应因子，如chitinase等的转录，发现这些效应因子的转录明显受到抑制，说明FcE75和FcRXR在蜕皮过程中起到非常重要的作用。本论文首次阐明了这些基因在十足目甲壳动物蜕皮过程中的功能。

牙鲆成肌因子myogenin和MRF4的研究

本文从牙鲆中克隆到其肌肉调节因子myogenin和MRF4的基因，并对它们的表达、启动子活性及功能进行分析。 研究结果表明牙鲆myogenin和MRF4都由三个外显子和两个内含子组成，其cDNA编码的氨基酸序列分别与几种鱼类的同源基因亲缘关系较近。 原位杂交显示最早在胚胎5-6个体节时体节中部的细胞检测到myogenin的表达，随着发育的进行，它的表达向体节两侧和体后延伸，最后在整个体节表达。当发育到30个体节的时候，在躯干的表达迅速下降，只在胚胎的尾部能检测到信号。 RT-PCR的结果显示，MyoD和Myf5的表达要早于myogenin，而MRF4的表达晚于myogenin，并且myogenin、MRF4只在成鱼的肌肉中表达，这进一步证明其在肌肉发育过程中的作用。 myogenin和MRF4的启动子中含有保守的肌肉特异调控序列，瞬时表达分析的结果证实两段启动子序列足以驱动GFP在斑马鱼胚胎肌肉中的特异表达。首次对鱼类MRF4启动子进行了调控序列的分析，发现在启动子的-181到-506的序列中含有调节MRF4表达的必需位点。 首次应用原核表达系统对MRF4蛋白进行重组表达，并利用纯化的重组蛋白制备多克隆抗体，通过western杂交分析显示所得到的MRF4多克隆抗体能够识别牙鲆内源性的MRF4蛋白。

栉孔扇贝CfLITAF基因的克隆与表达分析

关于无脊椎动物中是否存在细胞因子一直都存在着异议。从细胞因子本身入手，运用细胞生物学和免疫学手段，已经在软体动物、节肢动物和棘皮动物等无脊椎动物中证实了高等动物细胞因子样活性物质的存在，然而利用分子生物学手段至今没有得到任何核苷酸或蛋白序列信息，而从与细胞因子相关的分子如调控其表达的转录因子入手来研究无脊椎动物中的细胞因子样物质的存在，或许会得到意想不到的惊喜。 最近从人的单核细胞系THP-1中分离纯化出一种新型的转录因子，它可以被LPS诱导表达，产生的蛋白在TNF-α的表达过程中起着非常重要的作用，因而命名为LPS-induced TNF-α factor（LITAF）。随后该基因在小鼠和鸡中也被克隆分离出来，其编码的蛋白已经证实在TNF-α的表达过程中起着不可或缺的作用。迄今为止，在无脊椎动物中还没有相关同源基因的报道。 本研究采用大规模EST测序方法，结合锚定PCR技术从栉孔扇贝体内克隆到了高等动物LITAF基因的同源基因CfLITAF的全长cDNA序列。该cDNA全长为1240bp，其中5' 非编码区（UTR）为112 bp；开放阅读框（Open Reading Frame, ORF）包括450 bp，编码149个氨基酸残基，该多肽的理论分子量为16.08 kDa，等电点为6.77；3' UTR为678bp，包含一个poly A尾巴。SMART结构域预测发现CfLITAF蛋白含有一个保守的LITAF结构域。实时定量PCR检测CfLITAF基因在栉孔扇贝主要免疫器官中的表达分布情况，发现在所检测的六种组织血细胞、外套膜、肌肉、心、腮、性腺中均能检测到CfLITAF基因转录本的不同丰度的表达。血淋巴和肌肉中的表达量相差不大，而在心、外套膜、腮和性腺中的表达量要高于血淋巴和肌肉中的表达量，分别是血中表达量的2.45、2.82、9.23和24.93倍。 为了验证其表达量是否会受到LPS的诱导，利用QRT-PCR（quantitative real time PCR）检测了CfLITAF基因在受到LPS和PGN刺激后在血细胞中的表达规律。结果如下：在LPS刺激后3h，CfLITAF的表达量显著上调，达到了原初水平的1.5倍，随着时间的延长，其表达量逐渐恢复到刺激前水平；在用PGN刺激血细胞后的9个小时内均没有检测到CfLITAF基因mRNA表达量的显著变化。实验中所用血细胞为同一批原代培养的栉孔扇贝血淋巴细胞，细胞活力通过台盼蓝拒染实验测定。 CfLITAF基因的克隆与表达分析，不仅为进一步认识栉孔扇贝的免疫防御机制提供了实验参考，更重要的是为无脊椎动物中细胞因子样物质的研究提供了一个分子水平上的线索，为无脊椎动物中细胞因子样物质的研究奠定了理论基础。

中国明对虾体内凝结作用相关免疫基因的克隆与表达研究

对虾疾病在世界范围内的频频爆发，给地区经济造成了重大损失。然而到目前为止，我们对于对虾免疫系统的分子机制还知之甚少，深入了解其免疫应答过程，包括异物识别，信息传递以及作用方式等是从根本上解决疾病问题的关键之一。本论文从中国明对虾血细胞中分别克隆了一种C型凝集素基因（Fclectin）、参与凝结过程的谷氨酰胺转移酶基因（FcTG）以及参与凝结级联反应和酚氧化酶原激活系统的两种丝氨酸蛋白酶基因（SP-1和SP-2）和两种丝氨酸蛋白酶抑制剂基因（SPI-1和SPI-2），分析了它们的分子结构特征，预测了其可能的作用，并对它们的组织分布及应答不同病原感染的表达变化模式进行了研究。 首次从对虾中克隆了Fclectin基因，比对结果发现该基因属于C型凝集素超家族的成员之一；Northern blot和原位杂交结果显示，Fclectin基因在部分血细胞中呈组成型表达；利用毛细管电泳半定量RT-PCR方法分别研究了细菌和病毒感染后该基因的表达特征，并初步尝试了利用体外培养的原代血细胞系统研究LPS刺激后Fclectin的表达变化。该基因在感染或刺激后表达水平有明显的改变。 利用RACE技术从中国明对虾血细胞中克隆了一个FcTG基因，它与斑节对虾的谷氨酰胺转移酶基因有93%的相似性，可能编码一种具有活性的TG；原位杂交结果FcTG主要在血细胞中表达，在淋巴器官管腔的血细胞中表达尤为丰富，推断该基因可能主要在吞噬细胞中表达；病原的刺激未能使该基因的表达明显改变，但损伤（注射）的刺激会对其表达产生一定影响。 利用本组构建的对虾血液cDNA文库，克隆到了两个不同的丝氨酸蛋白酶基因，命名为SP-1和SP-2。前者为具有假clip结构域的胰蛋白酶样SP类似物（SPH），后者是一个具有完整的clip结构域的SPH，这在对虾中是首次发现。SP-1和SP-2都主要在血细胞中表达，此外SP-1在淋巴器官中的表达水平也很高；细菌的刺激对SP-1的影响不大，但会诱导SP-2表达量的增加，这两个基因的表达模式在病毒刺激后很相似，都出现先上调后下降的过程，可见病毒的感染会导致这两个基因转录的增强。 利用SMART-RACE技术结合对虾血液cDNA文库的利用，从中国明对虾血细胞中克隆到了两种SPI基因，它们分别为kazal-SPI和serpin-SPI，属于两个不同的家族。SPI-1与斑节对虾的SPI有76%的相似性，推断SPI-1可能主要对弹性蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、胰凝乳蛋白酶等有抑制作用；SPI-2为对虾中首次报道的serpin型抑制剂，它与淡水螯虾的serpin有42%的相似性，SPI-2可能主要对胰蛋白酶、酚氧化酶原激活酶、凝血酶和凝结酶有抑制活性。组织分别特征显示这两个抑制剂基因都在鳃、血细胞和淋巴器官中有高水平的表达。细菌的刺激都会导致这两个基因的表达在感染后出现下调，随后又上升至原有水平；病毒感染后，SPI-1和SPI-2的表达变化情况相似，感染后前12h基本没有明显的改变，到了感染的晚期（感染后24h和48h），随着病毒在体内大量复制，这两个基因的表达都急剧下降至接近基因关闭的状态，这可能暗示着与SPI相对应的蛋白酶的活力将很大程度的异常的增加，机体内稳定的免疫系统平衡状态可能已被破坏。

蓝藻与绿藻类胡萝卜素合成酶基因的比较基因组学及代谢调控研究

类胡萝卜素在生物体内具有重要的生理功能，其中虾青素是一类高附加值值的类胡萝卜素。本文通过比较基因组学和实验手段，探索了类胡萝卜素相关基因的转录调控，为类胡萝卜素的代谢工程奠定的了基础。 1、对已测序的18种蓝藻的类胡萝卜素合成基因进行了比较基因组学研究，发现除了Gloeobacter violaceus PCC 7421的类胡萝卜素合成途径是细菌型外，其余的蓝藻类胡萝卜合成途径均属于植物型。序列比对发现蓝藻中参与合成途径上游的酶基因在进化中保守性较高。研究还发现，一些类胡萝卜素合成酶在结构和功能上存在趋同或趋异进化，揭示它们进化上的多样性。 2、 通过比较基因组学分析，发现在集胞藻Synechocystis sp.PCC6803等几种蓝藻中，没有典型的番茄红素环化酶基因的同源基因，而存在着与绿硫细菌中的γ-carotene环化酶基因相似的基因,例如集胞藻中的sll0147和sll0659。但是研究结果显示sll0147和sll0659的突变对番茄红素环化过程影响不明显，提示在这些蓝藻中可能有其他基因参与环化过程，而sll0659基因可能参与了细胞的分裂过程。 3、 从经济绿藻雨生红球藻中克隆了参与类胡萝卜素合成途径的八氢番茄红素合成酶基因（psy）和八氢番茄红素脱氢酶基因（pds）的cDNA和基因组序列。通过基因组步移的方法克隆了这两个基因的5’侧翼序列，以本实验室建立的lacZ为报告基因的瞬间表达体系研究了这两个基因上游区域的启动子活性。 4、 通过ABA、 N饥饿和高光诱导雨生红球藻积累虾青素，利用半定量RT-PCR方法分析了在相同环境因子诱导下雨生红球藻中类胡萝卜素合成基因的表达调控模式，结果显示在虾青素积累过程中，除了番茄红素环化酶基因变化不明显，其他一些基因均存在明显的转录上调。 本研究首次利用比较基因组学的方法分析了类胡萝卜素基因的进化，发现大部分蓝藻的类胡萝卜合成途径属于植物型，一些类胡萝卜合成酶存在结构和功能的多样性。同时分离了雨生红球藻中类胡萝卜素相关基因八氢番茄红素合成酶基因（psy）和八氢番茄红素脱氢酶基因（pds）的5’上游侧翼序列，验证了它们的启动子功能，研究了雨生红球藻虾青素合成酶基因在相同环境因子诱导下的表达调控模式。本文将基础研究与实验验证相结合，为下一步研究类胡萝卜素合成的代谢工程提供了线索。

雨生红球藻中虾青素合成相关酶基因的转录调控序列分析

虾青素是一种具有极强抗氧化活性的类胡萝卜素，具有广泛的应用价值。雨生红球藻是一种单细胞绿藻，在逆境胁迫条件下能够大量合成并迅速积累虾青素，其积累量最高可达细胞干重的4%，从而成为目前首选的天然虾青素合成工具。但是，虾青素的大量积累总是发生在不适于生物量积累的环境胁迫条件下，虾青素积累与生物量积累之间成为一对矛盾，制约着虾青素大量生产。 异戊烯焦磷酸异构酶（IPI）、β-胡萝卜素酮化酶（BKT）和β-胡萝卜素氧化酶（CRTO）是虾青素合成过程中的相关酶。已有研究结果表明，这些酶基因的表达调控至少是部分发生在转录水平上的，这就为我们从转录水平上研究虾青素生物合成关键酶基因的调控机制提供了重要线索。 本文研究结果如下： 1. 利用基因组步移的方法克隆了两条异戊烯焦磷酸异构酶基因（ipi）的5’上游侧翼序列（1.8kb和2.5kb），预示着ipi的转录由不止一个启动子调控。 2. 利用上述方法克隆了两条β-胡萝卜素氧化酶基因（crtO）5'上游侧翼序列（1kb和2kb）。以lacZ为报告基因的瞬间表达实验结果表明，长度为320bp(-682/-363)的crtO 5'上游侧翼序列具有很强的启动转录活性，提示这段序列包含了启动子的结构。 3. 利用凝胶阻滞的方法研究了雨生红球藻中bkt强启动转录活性区域，即 309bp(-617/-309)启动子区域的转录因子结合位点，并发现在-396/-338的59bp区域内存在特异的核蛋白结合位点。通过序列分析，发现此59bp区域并不包含TATA或者CAAT-box，而是存在对光、缺氧、p-香豆酸及激素反应的G-box。 4. 根据国外已经获得的ipi和crtO全长cDNA序列，利用长距离PCR法从红球藻基因组中扩增到基因组序列。发现ipi和crtO均包含6个外显子和5个内含子，内含子的剪切位点基本符合GU-AG规律。并通过似然比检验（Likelihood ratio test）的方法发现两基因在进化过程中存在着正选择现象。 这些工作为下一步继续寻找与上述特定DNA调控区域特异结合的反式作用因子（蛋白质因子）奠定了基础。

中华卤虫滞育卵发育和重金属刺激相关蛋白质组学研究

卤虫(Artemia)是一种广温、耐高盐的小型甲壳动物，广泛分布于内陆盐湖和沿海盐田中。卤虫的无节幼体作为重要的蛋白优质饵料，被广泛的应用于水产养殖生产。卤虫具有特殊的生物学特性，是研究甲壳动物胚胎发育的良好的实验材料，同时也是一种研究动物抗逆机制的模式动物。卤虫有卵生和卵胎生两种繁殖后代的方式，当环境条件适宜时，卤虫倾向于采取卵胎生方式，即直接产生无节幼体；而在恶劣的环境条件下，卵生方式占主要地位，产生处于滞育状态的、具有复杂外壳的休眠卵。卤虫的滞育卵具有独特的生物学特性和特殊的生理生化特点。其发育停滞，细胞分裂停止，酶活力下降，代谢活动受到抑制并可耐受各种极端恶劣环境，如缺氧、低温、紫外线、干燥等。即使在最适的环境中滞育卵的孵化率也很低，只有受到某些特定的非生物信号的刺激才自能终止这种滞育状态，恢复生理代谢；当环境条件适宜时，能够继续发育孵化成无节幼体。因此，卤虫的滞育卵在卤虫的整个生活史中占有重要的地位。另一方面，卤虫是极端环境生物，能够抵抗各种恶劣环境胁迫刺激，因此是研究抗逆机理的良好的实验动物。 本论文利用蛋白质组学技术，研究了卤虫滞育卵及滞育卵发育过程中的蛋白质组表达情况，并研究了卤虫幼体在重金属刺激后蛋白表达的变化情况。得到如下结果： 建立了中华卤虫滞育卵可溶性总蛋白的双向凝胶电泳对照图谱。在pH 4–7、分子量10-100 kDa范围内，检测到约 233个蛋白点，并利用高效液相色谱-质谱联用（LC-ESI-MS/MS）技术鉴定了其中的48个丰度较大及感兴趣的蛋白点，根据这些蛋白的生物学功能进行分类，功能类别包括细胞防御蛋白、抗氧化蛋白、细胞骨架蛋白、代谢相关蛋白等。在卤虫滞育卵中共分离鉴定到6个分子量和等电点存在差异的小热休克蛋白p26的异构体，生物信息学分析表明该蛋白有三种不同的功能位点，分别是蛋白激酶C磷酸化位点，Casein 激酶II磷酸化位点及 N-myristoylation 位点。 采用低温脱水的方法对滞育卵进行激活刺激，并对活化卵和滞育卵蛋白表达图谱进行了对比分析。结果表明对卤虫滞育卵的激活刺激引起了其蛋白表达的明显变化。活化卵图谱中蛋白点总数比滞育卵中明显增多，特别是在pI<5.5范围内。约70个蛋白点在激活刺激后上调表达，包括部分只在激活卵中表达的蛋白；25个下调表达，包括部分只在滞育卵中表达的蛋白；其余约60％（占滞育卵蛋白点数目百分比）的蛋白点表达量基本恒定。热休克蛋白家族、抗氧化蛋白家族成员等蛋白变化明显，小热休克蛋白p26、小热休克蛋白ArHsp21蛋白以及过氧化物还原酶异构体在激活卵中特异表达。 活化卵孵化过程中不同发育时期的蛋白表达又呈现出不同的特点，分别在孵化后6h、12h、18h和24h的蛋白质组学图谱上检测到267、285、195和210个蛋白点。孵化后6h和12h休眠卵蛋白表达个数相对较多，与胚胎发育过程中的器官发生和剧烈的形态变化相适应；孵化后18h和24h休眠卵蛋白表达明显下降，部分蛋白的表达关闭，部分蛋白开始富集表达。 利用双向凝胶电泳技术分析了中华卤虫幼体受到急性硫酸铜刺激后的蛋白表达变化情况。通过图谱对比分析，检测到了5mM硫酸铜刺激24h后，卤虫幼体中14个差异表达的蛋白点。利用LC-ESI-MS/MS技术鉴定了其中的7个蛋白，其中3个蛋白上调表达，分别是热休克蛋白70（7.5倍）, 肌动蛋白（2.3倍）和伴侣分子亚基1（3.0倍）。3个蛋白下调表达，分别是：精氨酸激酶（2.8倍）, 延伸因子2 (2.0倍） 和富含甘氨酸蛋白(2.0倍）。硫酸铜刺激后特异表达的一个蛋白被鉴定为过氧化物还原酶(Peroxiredoxin，Prx)。根据质谱检测提供的蛋白肽段信息和其他生物过氧化物还原酶保守氨基酸序列设计简并引物，结合RACE技术，从中华卤虫幼体中克隆到了过氧化物还原酶基因，该基因的cDNA全长为756个碱基，其中开放阅读框为594个碱基，编码198个氨基酸，其蛋白理论分子量为22.0 kDa，理论等电点为6.98。多序列比对结果显示中华卤虫Prx基因的推导氨基酸序列与美国卤虫和中国对虾的同源性高达98%和94%。实时荧光定量PCR结果显示，硫酸铜刺激后，该基因在卤虫无节幼体中的转录水平明显升高，在24h达到正常水平的3.0倍。

文昌鱼发育相关基因GDF8/11、ACTIVIN和NM23-Bbt2的克隆、表达及分子进化分析

文昌鱼是头索动物，被认为是现存的与脊椎动物最接近的无脊椎动物，经常被看作是分析从无脊椎动物到脊椎动物进化过程的一种重要的模式动物。在本研究中，我们克隆了青岛文昌鱼的GDF8/11、ACTIVIN和NM23-Bbt2基因，并对这些基因在不同胚胎发育时期和不同成体组织中的表达情况进行了分析，同时分析了这些基因的进化情况。 文昌鱼GDF8/11的基因组全长为9.9 kb，包括五个外显子和四个内含子，比其他物种多出两个外显子和两个内含子。在多出的第三个内含子中，我们分离出一个可能的转座因子，这表明这个内含子可能来源于转座子。文昌鱼GDF8/11 cDNA编码一个419个氨基酸的前体多肽，这个前体多肽与软体动物、硬骨鱼类、鸟类和哺乳动物的MSTN以及哺乳动物和斑马鱼的GDF11具有高同源性。系统分析表明文昌鱼GDF8/11位于脊椎动物MSTN和GDF11的根部，这个结果证实MSTN/GDF11来源于同一个祖先基因，并且文昌鱼GDF8/11可能就是他们的共同祖先，产生MSTN和GDF11的基因复制事件发生在脊椎动物分离之前和文昌鱼与脊椎动物分离之后或者分离时。RT-PCR结果表明GDF8/11基因在新受精的细胞、早原肠胚和刀形胚胎中表达，这与哺乳动物中的情况不同。这表明GDF8/11在文昌鱼中除了调节肌肉生长外还可能拥有其他的功能。 文昌鱼ACTIVIN的基因组序列长为6.1 kb，启动子大约长为447 bp，其基因组包括两个外显子和一个内含子，外显子/内含子边界严格遵守GT…AG的原则。文昌鱼ACTIVIN基因编码一个410个氨基酸的前体蛋白，前体蛋白包括信号肽、N-末端结构域和C-末端结构域。文昌鱼ACTIVIN基因演绎的氨基酸序列与脊椎动物比较发现ACTIVIN基因比较保守，特别是C-末端生物活性区。系统进化分析表明脊椎动物和无脊椎动物的ACTIVIN基因分别聚在一起，文昌鱼的ACTIVIN则位于脊椎动物ACTIVIN分支的根部，这表明文昌鱼ACTIVIN基因可能是脊椎动物ACTIVIN同源基因的祖先基因。 文昌鱼NM23-Bbt2 cDNA包括一个编码171个氨基酸的开放阅读框，序列分析表明文昌鱼NM23-Bbt2与其他物种高度保守，他们都包含高度保守的基元，并且这些基元在NM23的功能中扮演着重要的角色。RT-PCR分析表明文昌鱼NM23-Bbt2在所检测的组织和胚胎发育时期中的非特异性的表达模式。系统分析表明脊椎动物和无脊椎动物NM23-H2分别聚在一起，而文昌鱼NM23-Bbt2位于脊椎动物NM23-H2分支的根部，这表明文昌鱼NM23-Bbt2可能是脊椎动物NM23-H2同源基因的祖先基因。从无脊椎动物到脊椎动物的基因组结构比较表明五个外显子和四个内含子的基因组结构可能产生在文昌鱼与脊椎动物分离之前。

黄海葵神经毒素基因和牙鲆孵化酶基因分子克隆及相关生物技术研究

聚合酶链反应（PCR）是体外 DNA 扩增技术，用于扩增确定长度的特异 DNA 片段或从少量复合性模板中扩增目的的 DNA 序列。随着聚合酶链式反应技术的不断革新和仪器设备的优化，聚合酶链式反应已经成为分子生物学领域中广泛应用的技术，并对以分子生物学为基础的相关领域产生重要影响。本文研究了利用聚合酶链式反应分别克隆黄海葵神经毒素基因和牙鲆孵化酶基因。海葵神经毒素是一类海洋多肽毒素，它们能广泛作用于可激动细胞的电压门控的钠离子通道，并且有心肌刺激活性。在所有已知海葵毒素中，来源于黄海葵的 Anthopleurin-B 拥有最强的心肌刺激活性，因此 Anthopleurin-B 被广泛认为是未来设计强心药物的理想分子模型。孵化酶是特异存在于鱼类胚胎孵化腺中的一种金属蛋白酶。由于孵化酶存在时空特异性，它被认为是从细胞水平和分子水平研究胚胎分化的良好探针，克隆其基因将促进胚胎发育与分化的系统研究。海葵组织存在大量的粘我糖物质，目前采用的许多标准方法提取海葵组织中核酸的效果均不理想。在已有的核酸提取方法的基础上，西文设计了一种新方案用于分离总 RNA 和基因组 DNA ，其要点为：用强变性剂异硫氰酸胍匀浆海葵组织，在一定离子强度下，用表面活性剂溴化十六烷基三甲基胺（CTAB）处理匀浆液，并有氯仿抽提，可将粘多糖从核酸溶液中分离；或在一定离子强度下，通过二乙胺乙基（DEAE）纤维素层析柱，将多糖和其它杂质分离。结果表明这种新组合的方法效果良好，获得的总 RNA 和基因组 DNA 在 260nm 和 280nm 紫外吸光度的比值分别为 1.96－1.97 和 1.73－1.75。同时总 RNA 的完整性良好，基因组 DNA 为大片段。根据黄海葵神经毒素 Anthopleurin-B C 末端氨基酸序列密码子简并度低的特点，本文设计了四种方案，用聚合酶链式反应扩增 Anthopleurin-B 的 cDNA 序列。其中用连接锚定聚合酶链式反应，即末端 DNA 快速扩增技术（RACE）成功扩增了 Anthopleurin-B 的全长 cDNA 序列，表明末端 DNA 快速扩增技术适合于较小的多肽或蛋白基因序列的扩增。本研究还修改了胚胎细胞总 RNA 标准提取和纯化方法，删除了胚胎细胞匀浆步骤，改为在缓冲溶液中，于 55℃ 用高浓度蛋白酶 K 裂解胚胎细胞，从而减少细胞核的破损，用苯酚／氯仿抽提将细胞核除去。获得的总 RNA 不受基因组 DNA 的污染，RNA 在 260nm 和 280nm 紫外吸光度的比值为 1.93－1.99 之间。用反转录聚合酶链式反应获得了目的基因序列，证明该方法切实可行。通过反转录聚合酶链式反应获得了牙鲆孵化酶部分 cDNA 克隆，经过 DNA 测序并且与青鳉孵化酶（HCE）比较，两者之间的以应 cDNA 序列的同源性分别为 86.0%, 推演氨基酸序列的同源性为 80.7%，由此可知，两者之间的同源性确实很高，因此，我们推测在硬骨鱼纲中，孵化酶基因可能是一类保守性很强的 DNA 序列。

微藻脂肪酸去饱和酶基因的比较基因组学分析及重要基因功能的验证

不饱和脂肪酸是机体生物膜的重要组成成分，对生物膜结构、机能、相转变、通透性的调节及相关过程的调控有重要作用。并且，它参与细胞生物化学反应、转运过程和细胞应激反应，影响脂肪代谢、寻靶作用、免疫反应、耐寒、抗氧化等生理过程。此外，不饱和脂肪酸还是哺乳动物体内生成前列腺素、凝血哑烷和白三烯等激素的前体，具有提高人体免疫力、预防心血管疾病和癌症等重要的生理功能。本文对微藻中脂肪酸去饱和酶基因进行了比较基因组学分析；分离并验证了模式绿藻莱茵衣藻中Δ12去饱和酶基因的功能；克隆了南极小球藻NJ-7不饱和脂肪酸合成途径中的内质网型Δ12、Δ15去饱和酶基因和叶绿体型Δ12基因，并对内质网型Δ12基因的功能进行了研究。 1、对已测序的37株蓝藻的脂肪酸去饱和酶基因进行比较基因组学分析，发现，丝状或固氮蓝藻中具有的脂肪酸去饱和酶的种类一般多于单细胞蓝藻；海洋来源的聚球藻和原绿球藻的酰基-脂去饱和途径明显不同于其他来源的蓝藻，这两属的蓝藻与其他蓝藻可能具有不同的系统发育史；与嗜温蓝藻相比，三个嗜热蓝藻藻株，Thermosynechococcus elongatus BP-1， Synechococcus sp. JA-2-3B'a(2-13)，sp. JA-3-3Ab只含有Δ9去饱和酶基因，这可能与它们的生长环境（温泉）有关。 2、对已测序的7株真核微藻的脂肪酸去饱和酶基因进行比较基因组学分析，发现，真核微藻不饱和脂肪酸合成途径具有多样性。绿藻衣藻和团藻，O. tauri和O. lucimarinus，硅藻三角褐指藻和伪矮海链藻中均存在两条不饱和脂肪酸合成途径，原核途径和真核途径。原核途径位于叶绿体，真核途径位于内质网，但合成的脂肪酸产物有所不同。原始红藻C. merolae只含有3个去饱和酶基因，2个Δ9基因和1个Δ12基因。不饱和脂肪酸合成缺失了一条原核途径，明显不同于其他蓝藻、绿藻、硅藻和高等植物，这可能是由于它们的特定的生长环境（酸性火山温泉）导致的。 3、通过比较基因组学分析，从模式绿藻莱茵衣藻中发现了一个可能的内质网型Δ12去饱和酶基因（135825），以酿酒酵母作为表达系统，验证了该基因的功能，为明确该模式藻的脂肪酸合成途径提供了依据。 4、从南极小球藻NJ-7中克隆了参与不饱和脂肪酸合成途径的内质网型Δ12、Δ15去饱和酶基因和叶绿体型Δ12基因的部分cDNA序列，并利用RACE方法获得了内质网型Δ12基因的全长，以酿酒酵母作为表达系统，对该基因的功能进行了研究。 本研究首次利用比较基因组学的方法分析了37株蓝藻和7株真核微藻中的不饱和脂肪酸合成途径，在此基础上研究了莱茵衣藻135825基因的功能。并从南极绿藻小球藻中克隆了参与不饱和脂肪酸合成途径的内质网型Δ12、Δ15去饱和酶基因和叶绿体型Δ12基因，为进一步研究温度调节去饱和酶表达的模式，明确微藻低温适应的分子机理奠定了基础。

文蛤（Meretrix meretrix）幼虫生长发育相关基因的克隆和功能分析

贝类养殖是我国海水养殖业中最重要的组成部分之一。贝类人工大规模养殖中的关键环节是种苗的人工繁育，早期幼虫能否正常生长发育，对幼虫变态和变态后生长率及成活率有很大的影响，直接关系到生产产量和经济效益，所以，了解幼虫发育机制对于生产实践具有重要的指导意义。 文蛤（Meretrix meretrix）是一种在东亚各国沿海和滩涂地区广泛分布的双壳贝类，是我国一种重要的经济品种。本论文以文蛤幼虫为研究对象，分别对文蛤幼虫发育过程中贝壳形成相关的铁蛋白（MmeFer）、营养及变态相关的组织蛋白酶B（MmeCB）及变态过程中细胞凋亡相关的caspase三个基因进行了克隆，分析了基因及编码蛋白在担轮幼虫期（L1）、D形幼虫期（L2）、壳顶幼虫期（L3）和稚贝期（L4）的时空表达特征，解析了其可能的功能，并研究了相应酶类的特异性抑制剂作用对幼虫发育过程的影响，进行了目标蛋白的功能验证，详述如下： 研究结果显示，在文蛤胚胎发育到原肠胚时放入不含铁离子的人工海水中培养，发育成无壳的畸形，随着人工海水中铁离子添加浓度的升高，幼虫长出壳状组织接近正常状态；而发育到L1期幼虫放入不含铁离子的人工海水中培养却可以发育出正常的壳，推测铁和铁代谢相关蛋白在幼虫贝壳初始形成有重要的作用。根据构建的文蛤幼虫cDNA文库中提供的序列信息，从文蛤中克隆了与铁离子代谢密切相关的铁蛋白（MmeFer）的全长cDNA 序列；通过Real time PCR发现，MmeFer mRNA的表达量在贝壳形成前后有明显改变；整体原位杂交结果显示MmeFer mRNA在L1期的表达部位刚好是贝壳生成的起始部位，推断文蛤铁蛋白与文蛤幼虫贝壳初始形成密切相关。 利用文蛤幼虫cDNA文库中的EST信息在幼虫中克隆到文蛤组织蛋白酶B（MmeCB）全长cDNA序列；通过整体原位杂交分析发现MmeCB mRNA在L2至L4期幼虫的消化腺部位表达，而且在L2期的幼虫表皮也有表达，说明MmeCB可能和幼虫消化相关，而且可能参与幼虫从表皮摄取营养的过程。利用MmeCB特异性抑制剂（CA074Me）处理饥饿幼虫，发现其生长受到明显抑制，验证了MmeCB参与幼虫表皮营养代谢的推论。利用免疫组织化学技术，研究了MmeCB蛋白在文蛤幼虫中的时空分布，发现其在L2期幼虫表面和胃部有阳性信号，而在L3期，MmeCB在幼虫面盘基部有强烈的表达，提示MmeCB在文蛤幼虫中不仅起到营养的作用，而且可能和幼虫附着变态有关。利用CA074Me分别处理文蛤胚胎和变态期幼虫，发现抑制MmeCB的活性对胚胎发育和幼虫变态都有显著影响。研究结果提示MmeCB在幼虫发育各阶段均具有重要的生物学功能。 根据caspase在不同物种中的保守区域设计简并引物，在文蛤幼虫中扩增到cDNA序列片段；检测有活性的caspase在文蛤幼虫各发育时期的分布部位，发现其在L1至L3期幼虫中都有分布，说明整个幼虫形态变化过程中都有caspase的参与；细胞凋亡检测结果显示，幼虫主要发生细胞凋亡的部位在L3期幼虫的面盘，即变态过程中要退化的器官，说明细胞凋亡可能是文蛤幼虫变态过程中面盘退化的主要机制；用caspase特异性抑制剂处理变态前幼虫，发现幼虫变态率下降，初步验证了caspase在文蛤幼虫变态过程中的作用。 通过对上述三种基因的研究，分别探讨了文蛤幼虫发育阶段中的几个主要事件（L1期到L2期的贝壳形成、L2到L3期的幼虫营养摄食及L3到L4期的附着变态）相关的基因及其功能，为研究贝类生长发育调控的分子机理提供了新的线索。

栉孔扇贝抗氧化酶基因的克隆与表达分析

扇贝是我国海水养殖的重要品种，但自1994年以来，养殖扇贝陆续爆发的大规模死亡，不但造成了巨大的经济损失，而且直接威胁到现有产业的生存和发展。扇贝病害的不断爆发以及病因的多样性迫切要求制定新的疾病防治措施和开发新型的抗菌物质。因此，深入研究扇贝免疫防御机制，探讨提高机体抗病力的有效途径和方法，改良种质和培育抗病品系，无疑是解决目前困扰扇贝养殖业健康可持续发展的必经之路。 抗氧化酶可以清除活性氧，是维持机体内氧环境平衡，抵抗外界环境影响的重要免疫因子。本研究采用大规模 EST 测序方法和同源克隆的方法，结合 cDNA 末端快速扩增（RACE）技术，从栉孔扇贝中克隆到了超氧化物岐化酶(Superoxide dismutase，SOD)、过氧化氢酶(Catalase，CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶（Glutathione peroxidase，GPX）等抗氧化酶基因的全长 cDNA序列，并对其基因结构进行了分析。同时，用实时定量PCR方法对这三个基因在健康扇贝血淋巴细胞、肾、鳃、肌肉、性腺等组织和在分别用鳗弧菌，溶壁微球菌和假丝酵母处理扇贝后不同时间段的表达差异情况进行了研究。 超氧化物歧化酶基因CfSOD的cDNA 全长为1022 bp，其中开放阅读框（Open Reading Frame, ORF）含有 459 bp，编码 153个氨基酸残基，无信号肽，为胞内蛋白。经BLASTP分析发现，CfSOD与其它动物具有较高的同源性。CfSOD中存在两个Cu/Zn-SOD的签名序列；另外Cu结合必须氨基酸(His-45，-47，-62 和-119)和Zn结合必须氨基酸(His-62，-70，-79和Asp-82)在CfSOD中保守。实时定量PCR 检测发现，CfSOD在鳃、血细胞和肾中有较高的表达。在鳗弧菌和溶壁微球菌刺激后，CfSOD的相对表达量逐渐下降，然后分别在32小时和16小时的时候恢复到刺激前的表达水平。在假丝酵母刺激后，CfSOD的mRNA表达没有显著差异。 栉孔扇贝过氧化氢酶基因CfCAT的cDNA全长为3146 bp，其中开放阅读框含有1521bp，编码507个氨基酸残基，无信号肽，为胞内蛋白。经BLASTP分析发现，CfCAT与其它动物具有较高的同源性。 CfCAT中存在过氧化氢酶近端活性位点和过氧化氢酶近端血红素配体签名序列，另外存在两个糖基化位点 NFS和 NFT，同时在CfCAT 的C末端存在过氧化物酶体定位信号AQL，为典型过氧化氢酶。实时定量PCR 检测发现，健康的扇贝中CfCAT在鳃和性腺中有较高的表达。CfCAT基因在鳗弧菌刺后表达升高，在4小时达到最高，约是刺激前表达量的6.8倍（P<0.05），后随着时间的变化而逐渐下降。在8小时表达量达到为刺激前表达量的1.3倍（P<0.05），在16和32小时略高于刺激前的水平。在溶壁微球菌刺激后CfCAT基因表达量也呈上升趋势，在刺激后4小时达到刺激前表达量的约2倍，然后有所下降，在16 小时又上升到刺激前表达量的2.9倍。CfCAT基因在假丝酵母刺激后的表达略有升高，4小时约是刺激前的1.2倍（P<0.05），在其他时间段变化不明显。 栉孔扇贝谷胱甘肽过氧化物酶基因CfGPX的cDNA 全长为1290 bp，其中开放阅读框含有705bp，编码235个氨基酸残基，有一个24核苷酸的信号肽序列。经BLASTP 分析发现，CfSOD与其它动物具有较高的同源性。CfGPX中发现谷胱甘肽过氧化物酶活性位点的签名序列， 另外发现硒半胱氨酸和硒半胱氨酸插入序列，为含硒型谷胱甘肽过氧化物酶。实时定量PCR 检测发现，未经处理的扇贝中CfGPX在性腺、肌肉、血和肾中有较高的表达。CfGPX基因在鳗弧菌刺后表达量快速上升，在6 小时的时候表达量达到最高，为刺激前的4.0倍（P>0.05），后随着时间的变化而逐渐下降。在溶壁微球菌刺激后CfGPX在前6小时表达略有降低，在6小时的时候表达量为刺激前的0.5倍（P<0.05），后随着时间的变化而逐渐升高。在16小时的时候表达量为刺激前的2.1倍（P<0.05）。在假丝酵母刺激后， CfGPX的表达量略有下降在8小时的时候表达量为刺激前的0.8倍（P<0.05）。 实验证明栉孔扇贝的超氧化物歧化酶基因CfSOD，过氧化氢酶基因CfCAT，谷胱甘肽过氧化物酶基因CfGPX基因在机体抵抗外界微生物刺激中起到了重要的作用。

中国明对虾重要分子伴侣蛋白基因的克隆及表达研究

对虾养殖业的可持续发展面临着种质退化、病害严重和养殖环境恶化等问题的严重挑战。养殖环境恶化造成的环境胁迫，不但影响对虾的生长性状，而且导致对虾的抵抗力下降，更容易引发病害的发生。养殖环境恶化已经严重影响了对虾养殖业的健康可持续发展。本论文针对环境恶化造成的环境胁迫对对虾影响的分子机理进行了研究。 克隆了中国明对虾对环境胁迫应答的重要伴侣蛋白基因，包括钙网蛋白（FcCRT）、葡萄糖调节蛋白78 （FcGrp78）、热休克蛋白70（FcHsp70）和热休克蛋白90（FcHsp90）的全长cDNA，研究了这些基因的组织表达特征，并对这些基因在不同胁迫条件下的转录表达特征进行了分析。 钙网蛋白是一种多功能的内质网钙结合蛋白，负责蛋白折叠和糖蛋白修饰。本论文首次在中国明对虾报道了钙网蛋白FcCRT基因的全长cDNA序列，编码406个氨基酸，具有保守的N-，P-和C-功能域，以及信号肽和保守的HDEL内质网回收标签。FcCRT基因与其它物种的钙网蛋白具有高度的相似性，系统进化分析表明，FcCRT在亲缘关系上更接近昆虫的钙网蛋白。Northern blot和原位杂交结果显示，FcCRT基因在中国明对虾各组织中均有表达，且在卵巢中发育早起的卵母细胞中表达量最高，说明FcCRT很可能参与了卵母细胞的成熟。FcCRT基因在不同胁迫条件下，其转录表达均呈现明显的变化。在WSSV感染实验中，中国明对虾肝胰脏和淋巴器官中FcCRT转录表达均明显上调；热休克、重金属处理均可引起FcCRT基因转录表达的变化，但不同重金属处理引起FcCRT转录表达变化的模式不同。铜离子处理6小时，会引起FcCRT基因的下调表达，但在12小时之后出现明显上调；镉离子处理12小时后引起FcCRT基因的下调表达，但在24小时又出现明显的上调表达。 葡萄糖调节蛋白78（GRP78）是内质网重要的伴侣蛋白。中国明对虾的Grp78基因（FcGrp78）的cDNA全长为2325bp，编码665个氨基酸。FcGrp78具有三个Hsp70蛋白家族标签，并含有KDEL内质网回收标签。FcGrp78基因与中国明对虾已有的Hsc70和Hsp70具有高度相似性。Northern blot杂交结果显示FcGrp78基因在中国明对虾各组织中均有表达。FcGrp78基因在WSSV感染的中国明对虾肝胰脏中呈上调表达，在血细胞中下调表达，说明FcGrp78可能与对虾的免疫应答有关。热休克处理会诱导FcGrp78基因转录的上调。不同重金属离子胁迫引起的FcGrp78转录表达有所不同：铜离子处理可以诱导FcGrp78基因在处理后24小时的上调表达；镉离子的处理导致FcGrp78基因处理后12小时的下调以及处理后24小时的上调表达变化。短期低氧胁迫则抑制对虾FcGrp78基因的转录表达。 本论文报道的中国明对虾FcHsp90基因 cDNA全长2552bp，编码726个氨基酸，具有保守的N端功能域、中间功能域和C端功能域，具有五个保守的Hsp90蛋白家族标签，序列上与其他物种Hsp90相似性高。Real-time RT-PCR结果显示FcHsp90基因在发育的卵巢中表达量较高，说明Hsp90可能参与了对虾卵母细胞成熟过程中的蛋白合成和卵黄蛋白原的分泌。WSSV感染引起中国明对虾肝胰脏的FcHsp90的转录表达明显上调，说明FcHsp90很可能与对虾的免疫相关。热休克处理诱导FcHsp90基因转录表达的迅速上调。铜离子处理也可诱导FcHsp90基因转录的上调表达，而镉离子处理首先引起FcHsp90基因的下调表达，24小时后开始上调。低氧胁迫也会抑制FcHsp90基因在对虾体内的转录表达。 诱导型FcHsp70基因cDNA全长2511bp，编码629个氨基酸，具有三个保守的Hsp70蛋白家族标签和C末端EEVD序列。与其他物种的Hsp70蛋白具有高度的相似性。FcHsp70基因转录表达对于热休克处理和铜离子的处理非常敏感：热休克处理2小时后FcHsp70基因的转录水平是对照组的80倍；铜离子处理12小时FcHsp70基因转录表达达到对照组的15倍。而镉离子处理后没有诱导FcHsp70显著的上调表达。 以上研究结果为阐明对虾对环境胁迫应答的机制奠定了重要基础，并可为抗逆对虾的培育提供依据。

栉孔扇贝凝集素家族基因研究

栉孔扇贝是我国北方重要的贝类养殖品种。自1997年以来爆发的栉孔扇贝大规模死亡，给地区经济造成了重大损失并且已经严重威胁扇贝养殖业的健康发展。然而，到目前为止，对扇贝免疫防御的分子机理了解还很少，深入研究扇贝免疫应答的分子机制是认识和了解病害发生和实现病害控制的关键问题之一。本研究采用了EST大规模测序结合cDNA锚定扩增的方法，从栉孔扇贝cDNA文库中克隆到五个C－型凝集素基因，并对其中部分基因进行了深入研究。 C－型凝集素CFLec－1的基因全长1785bp，其中含有5’非翻译区66bp，随后是666bp的开放阅读框；最后一条非常长的3’非翻译区1040bp，其中包含多个多聚腺甘酸加尾信号和polyA尾巴。栉孔扇贝CFLec－1编码221个氨基酸的蛋白，其N末端为15个氨基酸的信号肽。CFLec－1的成熟肽为206个氨基酸，其等电点为5.12，计算分子量为23.49kDa。SMART程序分析显示，C末端130氨基酸是一个标准的长型C－型凝集素结构域，其中四个半光胺酸（Cys104，Cys177，Cys193，Cys202）形成的两对二硫键维持了C－型凝集素的空间结构，而位于N末端的两个二硫键（Cys74，Cys85）构成了长型C－型凝集素结构域特有的一对额外二硫键。同源性分析表明，CFLec－1的C－型凝集素结构域与红原鸡的甘露糖受体中的C－型凝集素结构域有47％的相似度，与大西洋鲑的C－型凝集素受体C有31％的相似度。通过与其他同源的C－型凝集素结构域序列比对，发现了可能的糖结合位点EPD基域（Glu169-Pro170-Asp171）。通过RT－PCR研究CFLec－1在扇贝不同组织中的分布后发现，在健康扇贝中，CFLec－1在性腺中有中等程度的表达，在腮中有少量表达，在血淋巴和外套膜中有微量表达。经热处死的鳗弧菌刺激后，CFLec－1在几乎所有检测组织中的表达量都有明显的提高，其中，血淋巴中的表达量变化最为显著。这些结果说明CFLec－1是组成/诱导型基因，并且可能参与了黏膜防御。通过RT－PCR分析了CFLec－1在血淋巴中的表达特征后发现，在革兰氏阳性菌溶壁微球菌和革兰氏阴性菌鳗弧菌刺激后，CFLec－1的表达均显著高于对照组，并且成明显的随时间变化趋势。在大肠杆菌中表达的重组CFLec－1可以凝集革兰氏阴性菌大肠杆菌JM109，且凝集过程需要钙离子的参与。重组CFLec－1对大肠杆菌JM109有较弱的抑菌活性，对溶壁微球菌有明显的抑菌活性，对鳗弧菌没有抑菌活性。这一结果说明，CFLec－1可能不仅参与对入侵微生物的识别过程，而且可能作为效应分子起到了直接杀灭入侵微生物的作用。 CFLec-2的cDNA全长为708bp，其5’UTR为59bp。3’UTR为217bp。 CFLec-2的开放阅读框为432bp，编码160个氨基酸残基,其中包含5’信号肽17个残基。CFLec-2的编码区中含有一个C-型凝集素结构域。利用本研究中构建的原核表达载体，CFLec-2的成熟肽在大肠杆菌中被成功表达。 mCFLec-1的cDNA全长为2257bp，5’UTR17bp，3’UTR为713bp。mCFLec-1的开放阅读框为1527bp，编码508个氨基酸残基，其中包含17个氨基酸残基的信号肽序列。mCFLec-1的编码区含有三个串联的C-型凝集素结构域。利用本研究中构建的原核表达载体，mCFLec-2的成熟肽在大肠杆菌中被成功表达。 mCFLec-2的cDNA全长2086bp。其5’UTR长为18bp，3’UTR长为238bp。开放阅读框均为1776bp，编码609个氨基酸残基，其中包含N末端由18个氨基酸构成的信号肽。mCFLec-2的编码区包含四个C-型凝集素结构域。mCFlec-3的cDNA全长1897bp，其5’UTR和编码区与mCFLec-2几乎完全相同，只有个别碱基的差异。mCFlec-3的3’UTR为49bp。 本研究从扇贝机体本身的免疫机制入手，深入探讨其免疫机理，为进一步研究信号传导，了解扇贝先天性免疫的机制，为制定合理的研制策略提供坚实的理论基础；丰富和发展海水无脊椎动物免疫学的内容，为控制养殖生物疾病提供了新的思路；进一步通过高低等生物之间功能类似分子的同源性比对，为解释和阐明先天免疫这种已经存在数十亿年，从低等生物开始到人类仍旧保留且更加完善的免疫系统的奥秘和本质提供证据。

青岛文昌鱼肌肉生化分析及其功能基因的研究

本论文主要对青岛文昌鱼(Branchiostoma belcheri tsingtauense)肌肉组织进行了酶组织化学实验和电镜观察，分离了青岛文昌鱼肌球蛋白重链基因异构体并将其重组表达；克隆了青岛文昌鱼新生肽链相关复合体α亚基基因，并检测了其时空表达情况。 根据NADH酶组化实验可以将文昌鱼的肌细胞分成两类，即蓝紫色、有氧代谢型的浅层肌和基本不着色、无氧代谢型的深层肌。电镜观察进一步验证了酶组化的结果，并首次发现浅层肌和中间肌细胞肌丝密度明显大于深层肌。而mATPase组化实验没能对肌纤维进行分类，这也许是由于实验的pH条件不是文昌鱼的肌纤维ATP酶活的pH；或者其很容易失活；或者该酶的活化需要不同于其它动物的金属离子的缘故。 克隆到三条对应于肌球蛋白重链尾部保守区的异构体，其中两条是首次报道。这三条异构体都属于II类肌球蛋白并和脊椎、无脊椎动物的多种类型的肌球蛋白分子有较高的同源性；利用原核表达系统对异构体进行重组表达，获得了可溶性的表达蛋白，为制备文昌鱼肌球蛋白特异性抗体打下了基础。 从青岛文昌鱼成体中分离到了新生肽链相关复合体α亚基的全长cDNA，并检测了其时空表达情况。对其cDNA 5’端的基因组序列进行预测和比较分析，没有发现肌肉特异性外显子的存在。