黄海葵神经毒素基因和牙鲆孵化酶基因分子克隆及相关生物技术研究

聚合酶链反应（PCR）是体外 DNA 扩增技术，用于扩增确定长度的特异 DNA 片段或从少量复合性模板中扩增目的的 DNA 序列。随着聚合酶链式反应技术的不断革新和仪器设备的优化，聚合酶链式反应已经成为分子生物学领域中广泛应用的技术，并对以分子生物学为基础的相关领域产生重要影响。本文研究了利用聚合酶链式反应分别克隆黄海葵神经毒素基因和牙鲆孵化酶基因。海葵神经毒素是一类海洋多肽毒素，它们能广泛作用于可激动细胞的电压门控的钠离子通道，并且有心肌刺激活性。在所有已知海葵毒素中，来源于黄海葵的 Anthopleurin-B 拥有最强的心肌刺激活性，因此 Anthopleurin-B 被广泛认为是未来设计强心药物的理想分子模型。孵化酶是特异存在于鱼类胚胎孵化腺中的一种金属蛋白酶。由于孵化酶存在时空特异性，它被认为是从细胞水平和分子水平研究胚胎分化的良好探针，克隆其基因将促进胚胎发育与分化的系统研究。海葵组织存在大量的粘我糖物质，目前采用的许多标准方法提取海葵组织中核酸的效果均不理想。在已有的核酸提取方法的基础上，西文设计了一种新方案用于分离总 RNA 和基因组 DNA ，其要点为：用强变性剂异硫氰酸胍匀浆海葵组织，在一定离子强度下，用表面活性剂溴化十六烷基三甲基胺（CTAB）处理匀浆液，并有氯仿抽提，可将粘多糖从核酸溶液中分离；或在一定离子强度下，通过二乙胺乙基（DEAE）纤维素层析柱，将多糖和其它杂质分离。结果表明这种新组合的方法效果良好，获得的总 RNA 和基因组 DNA 在 260nm 和 280nm 紫外吸光度的比值分别为 1.96－1.97 和 1.73－1.75。同时总 RNA 的完整性良好，基因组 DNA 为大片段。根据黄海葵神经毒素 Anthopleurin-B C 末端氨基酸序列密码子简并度低的特点，本文设计了四种方案，用聚合酶链式反应扩增 Anthopleurin-B 的 cDNA 序列。其中用连接锚定聚合酶链式反应，即末端 DNA 快速扩增技术（RACE）成功扩增了 Anthopleurin-B 的全长 cDNA 序列，表明末端 DNA 快速扩增技术适合于较小的多肽或蛋白基因序列的扩增。本研究还修改了胚胎细胞总 RNA 标准提取和纯化方法，删除了胚胎细胞匀浆步骤，改为在缓冲溶液中，于 55℃ 用高浓度蛋白酶 K 裂解胚胎细胞，从而减少细胞核的破损，用苯酚／氯仿抽提将细胞核除去。获得的总 RNA 不受基因组 DNA 的污染，RNA 在 260nm 和 280nm 紫外吸光度的比值为 1.93－1.99 之间。用反转录聚合酶链式反应获得了目的基因序列，证明该方法切实可行。通过反转录聚合酶链式反应获得了牙鲆孵化酶部分 cDNA 克隆，经过 DNA 测序并且与青鳉孵化酶（HCE）比较，两者之间的以应 cDNA 序列的同源性分别为 86.0%, 推演氨基酸序列的同源性为 80.7%，由此可知，两者之间的同源性确实很高，因此，我们推测在硬骨鱼纲中，孵化酶基因可能是一类保守性很强的 DNA 序列。