Biodegradação de deoxinivalenol por aspergillus oryzae e rhizopus sp.: um estudo bioquímico de degradação e toxicidade

A contaminação aleatória de alimentos por micotoxinas afeta as condições de sanidade das dietas de humanos e animais. Dentre as toxinas fúngicas, deoxinivalenol (DON) se destaca pela freqüente contaminação de produtos agrícolas e alimentos e pela sua resistência a degradação pelo emprego de métodos tradicionais de processamento, o que motiva políticas de controle e a busca por técnicas de descontaminação. A descontaminação biológica empregando processsos fermentativos tem sido apontada como uma alternativa promissora, pois permite degradar micotoxinas através do sistema enzimático microbiano e melhorar características funcionais e sensoriais de matérias-primas e insumos alimentícios. Este trabalho teve por objetivo estudar condições e mecanismos de biodegradação de deoxinivalenol empregando Aspergillus oryzae e Rhizopus sp. em sistemas fermentativos submersos. Para tanto, foi necessário adequar metodologia para reação de derivação na determinação cromatográfica de DON; estudar o potencial e condições de degradação via fermentação submersa por Aspergillus oryzae e Rhizopus sp.; e avaliar a atividade de oxidoredutases e a citotoxicidade dos extratos fementados. A otimização da metodologia estabeleceu a melhor condição para a reação de derivação com 200 µL de anidrido trifluoroacético e 18 mg de bicarbonato de sódio, durante 6 minutos a 74 °C na faixa entre 7 e 21 µg de DON. A quantificação de DON residual no meio fermentado mostrou que as espécies fúngicas Rhizopus sp. e Aspergillus oryzae possuem a capacidade de degradar DON demonstrando índices médios de 87,4 e 62,4% respectivamente, principalmente quando o meio submerso foi água estéril e fermentação realizada durante 48 horas. A velocidade máxima de degradação neste intervalo foi de 10,8 e 12,4 ppb/h, observando também um aumento na atividade específica da enzima peroxidase. Os extratos dos fermentados com A. oryzae e Rhizopus sp. apresentaram efeito de inibição de proliferação celular (IC50) quando concentrados 10 vezes em 48 e 72 horas respectivamente. Os meios fermentados com Rhizopus sp. apresentaram menor efeito (1,5 vezes) quando comparado com Aspergillus oryzae.

Optimization of lipase production from yeasts strains isolated from olive mil wastewater

Dissertação submetida à Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências para a obtenção do Grau de Mestre em Microbiologia Aplicada.

Hybrid materials for biomedical applications

The increased longevity of humans and the demand for a better quality of life have led to a continuous search for new implant materials. Scientific development coupled with a growing multidisciplinarity between materials science and life sciences has given rise to new approaches such as regenerative medicine and tissue engineering. The search for a material with mechanical properties close to those of human bone produced a new family of hybrid materials that take advantage of the synergy between inorganic silica (SiO4) domains, based on sol-gel bioactive glass compositions, and organic polydimethylsiloxane, PDMS ((CH3)2.SiO2)n, domains. Several studies have shown that hybrid materials based on the system PDMS-SiO2 constitute a promising group of biomaterials with several potential applications from bone tissue regeneration to brain tissue recovery, passing by bioactive coatings and drug delivery systems. The objective of the present work was to prepare hybrid materials for biomedical applications based on the PDMS-SiO2 system and to achieve a better understanding of the relationship among the sol-gel processing conditions, the chemical structures, the microstructure and the macroscopic properties. For that, different characterization techniques were used: Fourier transform infrared spectrometry, liquid and solid state nuclear magnetic resonance techniques, X-ray diffraction, small-angle X-ray scattering, smallangle neutron scattering, surface area analysis by Brunauer–Emmett–Teller method, scanning electron microscopy and transmission electron microscopy. Surface roughness and wettability were analyzed by 3D optical profilometry and by contact angle measurements respectively. Bioactivity was evaluated in vitro by immersion of the materials in Kokubos’s simulated body fluid and posterior surface analysis by different techniques as well as supernatant liquid analysis by inductively coupled plasma spectroscopy. Biocompatibility was assessed using MG63 osteoblastic cells. PDMS-SiO2-CaO materials were first prepared using nitrate as a calcium source. To avoid the presence of nitrate residues in the final product due to its potential toxicity, a heat-treatment step (above 400 °C) is required. In order to enhance the thermal stability of the materials subjected to high temperatures titanium was added to the hybrid system, and a material containing calcium, with no traces of nitrate and the preservation of a significant amount of methyl groups was successfully obtained. The difficulty in eliminating all nitrates from bulk PDMS-SiO2-CaO samples obtained by sol-gel synthesis and subsequent heat-treatment created a new goal which was the search for alternative sources of calcium. New calcium sources were evaluated in order to substitute the nitrate and calcium acetate was chosen due to its good solubility in water. Preparation solgel protocols were tested and homogeneous monolithic samples were obtained. Besides their ability to improve the bioactivity, titanium and zirconium influence the structural and microstructural features of the SiO2-TiO2 and SiO2-ZrO2 binary systems, and also of the PDMS-TiO2 and PDMS-ZrO2 systems. Detailed studies with different sol-gel conditions allowed the understanding of the roles of titanium and zirconium as additives in the PDMS-SiO2 system. It was concluded that titanium and zirconium influence the kinetics of the sol-gel process due to their different alkoxide reactivity leading to hybrid xerogels with dissimilar characteristics and morphologies. Titanium isopropoxide, less reactive than zirconium propoxide, was chosen as source of titanium, used as an additive to the system PDMS-SiO2-CaO. Two different sol-gel preparation routes were followed, using the same base composition and calcium acetate as calcium source. Different microstructures with high hydrophobicit were obtained and both proved to be biocompatible after tested with MG63 osteoblastic cells. Finally, the role of strontium (typically known in bioglasses to promote bone formation and reduce bone resorption) was studied in the PDMS-SiO2-CaOTiO2 hybrid system. A biocompatible material, tested with MG63 osteoblastic cells, was obtained with the ability to release strontium within the values reported as suitable for bone tissue regeneration.

Efeitos do cobre na macrófita potamogeton pectinatus L. e sua possível utilização o monitoramento ou remediação de ambientes aquáticos contaminados por este metal

O cobre é um metal essencial para as plantas, porém considerado tóxico quando em elevadas concentrações na água. No caso de macrófitas aquáticas já foi demonstrado que este metal inibe o processo fotossintético e provoca alterações pigmentares. Neste contexto, expusemos (96h) a macrófita aquática Potamogeton pectinatus (L.) à diferentes concentrações de cobre 1, 10, 100 e 1000 µM para avaliar o potencial bioacumulador da planta, e às concentrações de 1, 10 e 100 µM de Cu para verificar os possíveis efeitos do metal na taxa fotossintética (24 e 96h) em diferentes intensidades luminosas (17, 100, 300 e 500 µmol/m2 /s), no teor pigmentar (96h) e no crescimento das macrófitas (30 dias). Para os experimentos de bioacumulação mantivemos um grupo de plantas controle (sem adição de cobre no meio), enquanto que para os outros testes mantivemos um grupo controle e um grupo em solução nutritiva de Hoagland 100%, que contem cobre e outros micronutrientes em concentrações ideais para sobrevivência e crescimento de P. pectinatus. Nossos resultados mostram que a macrófita P. pectinatus é capaz de acumular altas concentrações de cobre, sendo que este acúmulo aumenta com a elevação dos níveis do metal na água. Apesar de basicamente não haver diferença estatística entre a concentração do metal nos diferentes órgãos da planta, as raízes mostraram-se capazes de acumular mais cobre que as folhas e caule com base no fator de bioconcentração. Com relação aos teores de clorofila “a”, “b” e carotenoides, estes foram menores nas folhas das plantas controle em comparação com as plantas em solução de Hogland, mas esta diferença só foi significativa nas plantas expostas ao cobre, que apresentaram menor concentração dos teores pigmentares já à 1 µM de Cu. Quanto à fotossíntese, em 24h de exposição, novamente observamos um efeito negativo da ausência e presença de cobre nas concentrações de 1, 10 e 100 µM, bem como, um efeito da luminosidade, de forma que as plantas em solução de Hoagland apresentaram maior taxa fotossintética quando em 100 µmol/m2 /s. Em virtude de um aumento na respiração em 96h, a fotossíntese, quando ocorreu, foi menor que em 24h e não diferiu entre os grupos e luminosidade. Em relação ao crescimento, as plantas perderam biomassa, mas mantiveram seus comprimentos e apenas aquelas em solução de Hoagland aumentaram seu número de folhas. Ainda, verificou-se clorose e necrose nas plantas controle e expostas ao cobre. Diante do exposto, concluímos que a macrófita P. pectinatus acumula altas concentrações de cobre, principalmente na raiz, sendo capaz e refletir as concentrações do metal no meio. Esta condição, sugere seu uso no biomonitoramento e fitorremediação de locais contaminados por cobre. Por outro lado, elas mostram-se sensíveis ao metal pela redução no teor pigmentar e fotossíntese, sugerindo estes como mecanismos toxicidade do cobre.

O contributo da informação por segmentos nos testes de imparidade ao goodwill - Aplicação ao caso da EDP no segmento EDP Renováveis

Mestrado em Contabilidade

Avaliação ecotoxicológica de efluentes industriais utilizando Danio rerio Hamilton-Buchanan, 1822 (TELEOSTEI, CYPRINIDAE)

The industrial effluents are one of the main sources of water pollution. For an appropriate characterization and control of their discharges, the most efficient strategy is the integrated use of chemical, physical and ecotoxicological analyses. The aims of this study were to asses the efficiency of the treatment plant of a textile industry performing acute toxicity tests and physical-chemical analyses of the effluents before and after the treatment, besides evaluate the toxicity of the effluents of the Treatment System of Liquids Effluents (Sistema de Tratamento de Efluentes Líquidos - SITEL) of Distrito Industrial de Natal (DIN) and some of their physical-chemical variables. The species used in the ecotoxicological tests was the fish Danio rerio. The results showed that the treatment plant reduced significantly (around 50%) the toxicity of the raw textile effluent in only three of the seven tests but, in general, it promoted the reduction of the physical-chemical parameters analyzed. The toxicity and the physical-chemical factors of the effluents of SITEL of DIN varied among the tests and show the importance of monitoring their discharges in the Potengi river, one of the most important rivers of the Rio Grande do Norte state

A importância do uso de métodos complementares para a avaliação da toxicidade de hidrocarbonetos aromáticos policíclicos

Hidrocarbonetos Aromáticos Policíclicos (HAPs) e seus derivados Halogenados (HHAPs) são conhecidos como um conjunto de contaminantes ambientais, classificados como potencialmente tóxicos, mutagénicos e carcinogénicos, sendo um assunto de extrema importância e preocupação para a saúde pública. Diversos estudos têm reportado o potencial efeito tóxico destes compostos após longos períodos de exposição, pelo uso de métodos colorimétricos como o ensaio de brometo de 3-[4,5- dimetil-tiazol-2-il]-2,5-difeniltetrazólio (MTT) e vermelho neutro. Contudo, apesar de estes métodos clássicos de avaliação da citotoxicidade in vitro permitirem, de forma rápida, identificar as propriedades nocivas dos compostos, não permitem compreender os mecanismos moleculares subjacentes responsáveis pela sua toxicidade. Deste modo, no presente estudo, para avaliar os efeitos à exposição aos compostos Pireno (Pir) e seu derivado resultante da desinfeção de águas por bromação, 1-BromoPireno (1-BrPir), foram utilizados outros métodos complementares como avaliação do stress oxidativo e vários fenómenos associados à morte celular programada. Os resultados obtidos comprovam não só a existência de efeitos citotóxicos dos poluentes quando acumulados, como também possíveis efeitos genotóxicos. Assim, pelos métodos complementares, foi possível a identificação de alvos moleculares passiveis de ação farmacológica, o que pode constituir o primeiro passo para o desenho de estratégias terapêuticas que visem prevenir ou tratar os danos provocados por estes poluentes no Homem.

Controlo de Qualidade Testes Rápidos

Agenda: 1- Definição e Conceitos Testes Rápidos: “Testes Laboratoriais Remotos (POCT)” 2- Fases do Processo Analítico e Controlo de Qualidade 3- Estudo em Portugal: Utilização dos Testes Rápidos em Instituições de Saúde (2012) Apresentação dos dados do questionário ProMeQuaLab (2015) 4- Experiência na Europa 5- Sistema de Gestão da Qualidade Legislação, Normas ISO e Guidelines 6- Perspetivas

Avaliação da ecotoxicidade de percolados em áreas de disposição de resíduos na região metropolitana de Natal/RN

Leachates are effluent produced by decomposition of solid waste, they have complex composition and can be highly toxic. Therefore such percolated liquid should be collected and treated properly to avoid environmental contamination of soil and of water bodies. The objective of this study was to evaluate the toxicity through ecotoxicological tests with Ceriodaphnia dubia (Cladocera - Crustacea) of percolated liquids generated in two different systems of municipal solid waste (MSW) disposal in the city of Natal/ RN: A Sanitary Landfill in the Metropolitan Region of Natal/ RN, and in a dump off area. Furthermore, it was evaluated the possible contamination of the underground water of the dump off area. Two monthly samples were taken at four points between the months of May/2009 and January/2010. The Point "A" corresponds to the end of the pond leachate treatment in ASRMN; The Point "B" corresponds to a containment pond at the dump. The Point "C" is an area near one of the cells of the dump off area where the leachate outcrops; The Point "D" stands for an underground water well at the area. The last point, called "E" was sampled only once and corresponds to the slurry produced by temporary accumulation of solid waste in the open area of the dump. The ecotoxicological tests, acute and chronic, followed the ABNT 13373/2005 rules, with some modifications. The samples were characterized by measuring the pH number, the dissolved oxygen (DO), the salinity, BOD5, COD, Cd, Cu, Pb, Cr, Fe, Mg, Ni, and Zn. At Point A, the average number of EC50-48h ranged between 1.0% and 2.77% (v/v), showing a high toxicity of the leachate to C.dubia in all months. To this point, positive correlations were found between the EC50- 48 with precipitation. Negative correlations were found between the EC50- 48h with salinity. At point B there was no response of the acute exposure of organisms to the test samples. At point C the EC50-48h ranged from 17.68% to 35.36% in just two months of the five ones analyzed, not correlated meaning. Point D, the EC50-48h level ranged between 12.31% and 71.27%, showed a negative correlation with, only, precipitation. Although it was observed toxicity of underground water in the Landfill Area, there was no evidence of water contamination by leachate, however, due to the toxic character of this water, additional tests should be conducted to confirm the quality of water that is used for human supply. At point E there was no acute toxicity. These results support the dangers of inappropriate disposal of MSW to water bodies due to the high toxicity of the leachate produced highlighting the necessity of places of safe confinement and a treatment system more effective to it

Diagnóstico ecotoxicológico dos efluentes lançados no complexo estuarino do Jundiaí/Potengi, Natal/RN

Untreated effluents that reach surface water affect the aquatic life and humans. This study aimed to evaluate the wastewater s toxicity (municipal, industrial and shrimp pond effluents) released in the Estuarine Complex of Jundiaí- Potengi, Natal/RN, through chronic quantitative e qualitative toxicity tests using the test organism Mysidopsis Juniae, CRUSTACEA, MYSIDACEA (Silva, 1979). For this, a new methodology for viewing chronic effects on organisms of M. juniae was used (only renewal), based on another existing methodology to another testorganism very similar to M. Juniae, the M. Bahia (daily renewal).Toxicity tests 7 days duration were used for detecting effects on the survival and fecundity in M. juniae. Lethal Concentration 50% (LC50%) was determined by the Trimmed Spearman-Karber; Inhibition Concentration 50% (IC50%) in fecundity was determined by Linear Interpolation. ANOVA (One Way) tests (p = 0.05) were used to determinate the No Observed Effect Concentration (NOEC) and Low Observed Effect Concentration (LOEC). Effluents flows were measured and the toxic load of the effluents was estimated. Multivariate analysis - Principal Component Analysis (PCA) and Correspondence Analysis (CA) - identified the physic-chemical parameters better explain the patterns of toxicity found in survival and fecundity of M. juniae. We verified the feasibility of applying the only renewal system in chronic tests with M. Juniae. Most efluentes proved toxic on the survival and fecundity of M. Juniae, except for some shrimp pond effluents. The most toxic effluent was ETE Lagoa Aerada (LC50, 6.24%; IC50, 4.82%), ETE Quintas (LC50, 5.85%), Giselda Trigueiro Hospital (LC50, 2.05%), CLAN (LC50, 2.14%) and COTEMINAS (LC50, IC50 and 38.51%, 6.94%). The greatest toxic load was originated from ETE inefficient high flow effluents, textile effluents and CLAN. The organic load was related to the toxic effects of wastewater and hospital effluents in survival of M. Juniae, as well as heavy metals, total residual chlorine and phenols. In industrial effluents was found relationship between toxicity and organic load, phenols, oils and greases and benzene. The effects on fertility were related, in turn, with chlorine and heavy metals. Toxicity tests using other organisms of different trophic levels, as well as analysis of sediment toxicity are recommended to confirm the patterns found with M. Juniae. However, the results indicate the necessity for implementation and improvement of sewage treatment systems affluent to the Potengi s estuary

Obtenção de extratos de agaricus bisporus com ergosterol para incorporação em iogurtes e procedimentos de microencapsulação

Além de ser o cogumelo mais consumido no mundo, Agaricus bisporus é um dos cogumelos mais ricos em ergosterol, representando esta molécula quase 90% da sua fração de esteróis. Vários estudos têm atribuído ao ergosterol diferentes bioatividades, incluindo efeitos hipocolesterolémicos semelhantes aos exibidos pelos fitoesteróis. Isto torna o ergosterol uma molécula interessante para ser estudada como composto nutracêutico. Assim, este trabalho teve como objetivo avaliar o potencial de utilização dos extratos de A. bisporus ricos em ergosterol na produção de bebidas lácteas funcionais. Para o efeito, foram realizados testes de incorporação do extrato e do ergosterol puro em iogurtes que se compararam com bebidas lácteas funcionais comerciais (aditivadas com fitoesteróis). As amostras de A. bisporus foram submetidas a uma extração assistida por ultrassons e os extratos obtidos (IEXT), bem como a molécula de ergosterol em diferentes concentrações (IERG1 e IERG2), foram incorporados em iogurtes, e comparadas com amostras controlo (amostras de iogurte sem aditivos) (ICN) e iogurtes comerciais contendo fitoesteróis (ICP). Todas as amostras foram analisadas imediatamente após a incorporação (T0), e após sete dias de armazenagem a 4°C (T1), em relação aos parâmetros nutricionais, atividade antioxidante e propriedades citotóxicas em linhas celulares tumorais humanas e numa cultura primária de células de fígado de porco (não tumoral) para avaliação da toxicidade. O teor de ergosterol incorporado na forma pura, ou presente nos extratos, foi monitorizado por HPLC-UV. Adicionalmente, foi realizado um estudo de microencapsulação utilizando a técnica de coacervação, tendo o quitosano e o isolado proteico de soro como materiais encapsulantes. Num ensaio preliminar determinou-se o pH conducente a um maior rendimento de encapsulação e, seguidamente, verificou-se a influência da razão proteína:quitosano (P/Q) e da temperatura utilizada, no rendimento de encapsulação (Y1), na eficiência de encapsulação (Y2) e na carga (teor de ergosterol nas microesferas) (Y3). Posteriormente, o estudo foi realizado baseando-se nas melhores condições para encapsular ergosterol, sendo também avaliadas as respostas Y1, Y2 e Y3. Além de ser o cogumelo mais consumido no mundo, Agaricus bisporus é um dos cogumelos mais ricos em ergosterol, representando esta molécula quase 90% da sua fração de esteróis. Vários estudos têm atribuído ao ergosterol diferentes bioatividades, incluindo efeitos hipocolesterolémicos semelhantes aos exibidos pelos fitoesteróis. Isto torna o ergosterol uma molécula interessante para ser estudada como composto nutracêutico. Assim, este trabalho teve como objetivo avaliar o potencial de utilização dos extratos de A. bisporus ricos em ergosterol na produção de bebidas lácteas funcionais. Para o efeito, foram realizados testes de incorporação do extrato e do ergosterol puro em iogurtes que se compararam com bebidas lácteas funcionais comerciais (aditivadas com fitoesteróis). As amostras de A. bisporus foram submetidas a uma extração assistida por ultrassons e os extratos obtidos (IEXT), bem como a molécula de ergosterol em diferentes concentrações (IERG1 e IERG2), foram incorporados em iogurtes, e comparadas com amostras controlo (amostras de iogurte sem aditivos) (ICN) e iogurtes comerciais contendo fitoesteróis (ICP). Todas as amostras foram analisadas imediatamente após a incorporação (T0), e após sete dias de armazenagem a 4°C (T1), em relação aos parâmetros nutricionais, atividade antioxidante e propriedades citotóxicas em linhas celulares tumorais humanas e numa cultura primária de células de fígado de porco (não tumoral) para avaliação da toxicidade. O teor de ergosterol incorporado na forma pura, ou presente nos extratos, foi monitorizado por HPLC-UV. Adicionalmente, foi realizado um estudo de microencapsulação utilizando a técnica de coacervação, tendo o quitosano e o isolado proteico de soro como materiais encapsulantes. Num ensaio preliminar determinou-se o pH conducente a um maior rendimento de encapsulação e, seguidamente, verificou-se a influência da razão proteína:quitosano (P/Q) e da temperatura utilizada, no rendimento de encapsulação (Y1), na eficiência de encapsulação (Y2) e na carga (teor de ergosterol nas microesferas) (Y3). Posteriormente, o estudo foi realizado baseando-se nas melhores condições para encapsular ergosterol, sendo também avaliadas as respostas Y1, Y2 e Y3. As bebidas funcionalizadas com o extrato (IEXT) e com ergosterol na mesma concentração existente no extrato (IERG1) revelaram uma atividade antioxidante similar às bebidas comerciais com fitoesteróis. No entanto, as bebidas com ergosterol na mesma concentração do extrato de A. bisporus e de fitoesteróis (IERG2) revelaram uma atividade antioxidante superior. Além disso, apenas IEXT, IERG1 e IERG2 apresentaram um aumento na atividade antioxidante de T0 para T1, com destaque para a atividade exibida por IERG2, significando que o ergosterol e os extratos foram capazes de proteger a bebida láctea da oxidação, aumentando a vida de prateleira do produto. IERG2 foi a amostra que revelou a maior citotoxicidade para as linhas celulares tumorais, enquanto as bebidas com fitoesteróis mostraram a menor atividade, sem diferenças significativas entre T0 e T1. Os estudos de microencapsulação revelaram ainda que a técnica de coacervação permite obter cápsulas de distintos tamanhos e que as condições ótimas do processo ocorrem a pH 5,5, com temperatura de 55ºC e razão P/Q de 0,5, com um menor rendimento de encapsulação, mas com uma maior carga em ergosterol. Este trabalho contribuiu para o estudo do potencial da utilização de extratos de A. bisporus com ergosterol no desenvolvimento de novas bebidas funcionais. Constituiu um primeiro passo que necessita de estudos subsequentes relacionados com a avaliação da viabilidade da sua utilização ao nível industrial e demonstração clara da sua bioatividade in vivo.

Análise toxicológica in vitro e in vivo de uma fucana antitrombótica da alga marrom Spatoglossum schdöederi

Fucan is a term used to denominate a family of sulfated polysaccharides rich in L-fucose. They are extracted mainly from the extracellular matrix of brown algae and echinoderms. The brown alga Spatoglossum schröederi (Dictyotaceae) has three heterofucans named A, B and C. Our research group have been extracted non anticoagulant heterofucan from S. schröederi which possess antithrombotic activity in vivo. However, their toxicity in vitro and in vivo has not yet been determined. For the results in toxicity in vitro, we observed that the fucan A at 20, 500 and 1000 μg/plate showed no mutagenic activity in Kado test (Microsuspension), when the bacterial strains TA97a, TA98, TA100 and TA102, with and without S9 were used. The comet assay showed that fucan A (from 20 to 1000 μg/mL) did not cause any genotoxic effect on CHO cells. There was no damage to the DNA of these cells, as evidenced by the tail length and tail moment, which were similar to that found for the negative control. The fucan A from S. schröederi was administered at 20 μg/g of rat (dose which it showed high antithrombotic activity) during two months. After that, the animals were killed and examined. The data showed that fucan A did not cause any change in biochemistry and hematological parameters, as well as, in the morphology and size of the rat s organs analyzed. In conclusion, this study indicates that fucan is a compound with potential pharmacological that has no toxicity

Mineral and organic pollution in river Sabor (Northeastern Portugal): ecotoxicological effects on freshwater fauna

Aquatic ecosystems are final collectors of all kinds of pollution as an outcome of anthropogenic inputs, such us untreated industrial and municipal sewage and agricultural pollutants. There are several aquatic ecosystems that are threatened by mineral and organic pollution. In Northeastern Portugal, near Bragança, different watercourses are suffering negative impacts of human activities. It has been developed several studies in the monitoring of environmental impacts in these river basins, namely in Rio Fervença, affected by organic pollution, and in Portelo stream, affected, since 2009, by the collapse and continuous input of mining deposits. In this sense, the present study aimed to continue the monitoring study of ecological status of freshwater ecosystems of Northeastern Portugal, namely the following objectives: a) mineral pollution effects of mining deposits sudden incorporated into Portelo stream; b) organic pollution due to domestic and industrial inputs in River Fervença. Also, since fish are useful experimental models to evaluate toxicological mechanisms of contaminants, c) acute toxicity tests with Cu were conducted in laboratory conditions. During 2015/2016, it was made abiotic and biotic characterization of 16 sampling sites distributed by both Portelo and Fervença rivers, tributaries of main River Sabor (Douro Basin). Several physicochemical parameters were determined and Riparian Quality (QBR Index) and Channel Quality (GQC) Indexes were determined for habitat evaluation. Fish and invertebrate communities were sampled, according to protocols of Water Framework Directive (WFD). Several metrics were determined, with particular emphasis on the Biotic Index IBMWP and the Northern Portuguese Invertebrate Index (IPtIN). Acute toxicity tests were conducted with an Iberian fish species, common barbel (Luciobarbus bocagei) and some plasmatic electrolytes levels were evaluated, to assess their contribution to mitigate osmoregulatory adverse effects of Cu. Also, same electrolytes were measured after changing to clean water, in attempt to assess fish capacity to reverse this situation. Results obtained for both rivers showed a significant level of disturbance that affected decisively water, habitat and biological quality of aquatic ecosystems. Mineral and Organic Pollution in River Sabor (NE Portugal): Ecotoxicological Effects on Freshwater Fauna Due to this change of environmental conditions in Portelo stream (extreme pH values, high conductivity and presence of heavy metals), several biological metrics (e.g. taxonomic richness, abundance, diversity, evenness) confirmed, comparatively with reference sites, a substantial decrease on ecological integrity status. The same pattern was found for Fervença River; however other water parameters, namely the content of most limiting nutrients (e.g. N and P) seemed to have more influence in the composition and structure of macroinvertebrate and fish communities. In fact, despite the operation of the Sewage Treatment Plant of Bragança, Fervença River presented significant levels of disturbance that affected decisively the quality and ecological integrity of the aquatic ecosystem. The synergic effect of domestic and industrial pollution, intensive agriculture, regulation and degradation of aquatic and riparian habitats contributed to the decrease of ecological condition, namely in the downstream zones (after Bragança). The results for acute toxicity, showed that fish can change Na+ and K+ levels face to Cu exposition and, depending of Cu concentration tested, can also return to normal levels, providing some insights to that are believed to occurred in fish population, near the Portelo mines. The low ecological integrity status detected in the lotic ecosystems in NE Portugal as a result of mineral and organic pollution deserves the development of several measures for rehabilitation and improving of water quality. On the other hand, environmental education actions are needed to contribute to improvement of ecological integrity of the river and its conservation.

Degradação de Ocratoxina a: estudo de processo e toxicidade

A ocratoxina A (OTA), micotoxina encontrada em diferentes níveis e em diversas matrizes, apresenta efeitos carcinogênicos, nefrotóxicos e teratogênicos. O desenvolvimento de métodos capazes de diminuir esta contaminação a níveis permitidos pela legislação é incentivado e os processos biológicos utilizados envolvem o uso de enzimas e/ou microrganismos para degradação da OTA e são preferenciais pela especificidade, bem como pelas condições brandas para a detoxificação. O objetivo do trabalho foi estudar a ação de carboxipeptidase A nos níveis e na toxicidade de OTA, visando aplicar a técnica para detoxificar farinhas de trigo. Primeiramente foi estimado o risco de exposição à ocratoxina A pelo consumo de farinhas de trigo. Para isso foram estabelecidas condições de determinação de OTA em farinhas de trigo, empregando técnicas de estatística multivariada para definir os principais interferentes na extração de OTA pelo método de QuEChERS e detecção em CLAE-FL. O método validado permitiu a avaliação da ocorrência natural em 20 amostras de farinha de trigo, estando estas contaminadas na faixa de 0,22 a 0,85 µg.kg-1 , apresentando um valor de ingestão diária de 0,08 ngOTA.dia-1 .kgmassacorpórea -1 e uma disponibilidade de 94,4%. Em seguida foi realizada a padronização da extração de carboxipeptidase A em biomassa de Rhizopus oryzae que consistiu em agitação ultrassônica durante 30 minutos numa potencia fixa de 150 W e 40 kHz e a triagem de agentes biológicos para degradação de OTA. Para o estudo da degradação in vitro de OTA, método de extração e detecção de OTA e OTα em CLAEFL foi validado e o processo de degradação foi realizado com Rhizopus oryzae e Trichoderma reesei, obtendo-se uma redução máxima de 63,5% e 57,7%, respectivamente. A degradação apresentou uma correlação alta (R>0,9) e significativa (p<0,05) com a produção de Otα, indicando que ocorreu a produção de enzimas capazes de hidrolisar a micotoxina, por exemplo, a carboxipeptidase A. O estudo da toxicidade de OTA e seu metabólito OTα foi realizado em neutrófilos humanos, onde foi observado a ausência de efeito tóxico de OTα. Também foi determinado o mecanismo de toxicidade de OTA pelo aumento de Ca2+ intracelular pela liberação a partir das reservas internas. Esta liberação, subsequentemente, provoca uma cascata de eventos, nomeadamente: a produção de espécies reativas, depleção de ATP, perda de ΔΨm, levando à morte por necrose. Para reduzir o risco de exposição à micotoxina pela ingestão de matéria prima contaminada, carboxipeptidase A extraída de diferentes fontes foi aplicada na hidrólise de OTA em farinha de trigo para posterior determinação do conteúdo residual de OTA e OTα, empregando método validado. O estudo mostrou uma redução de OTA entre 16,8 e 78,5% e produção de OTα entre 2 a 8,2 ng.g-1 . As carboxipeptidases mais promissoras para degradação foram as provenientes de Rhizopus e Trichoderma e a carboxipeptidase comercial. Ficou demonstrado que se pode recomendar a aplicação de enzimas proteolíticas, tipo carboxipeptidase, para reduzir o risco de exposição à micotoxina quando utilizada matéria prima contaminada, por exemplo, farinha de trigo para diferentes processos. A transformação de OTA para OTα e seus efeitos na redução da toxicidade da micotoxina corroboram com esta afirmação.

Ação fotodinâmica da C-Ficocianina, pigmento extraído da Spirulina platensis, nas linhagens tumorais humanas K562 (não MDR) e K562 – Lucena 1 (MDR)

A C-ficocianina (C-FC), um pigmento comum nas cianobctérias e um dos mais abundantes constituintes da Spirulina platensis, vem sendo estudada por possuir várias propriedades como antioxidante, hepatoprotetora, antiinflamatória e inibidora da enzima COX-2. Alguns autores atribuem também a C-FC um efeito oxidante quando ela é o agente fotossensibilizante utilizado na terapia fotodinâmica (TFD), podendo ser um importante agente no tratamento do câncer. Entretanto ainda pouco se sabe sobre a ação da C-FC, como substância fotosensibilizante, no tratamento de ação fotodinâmica (AFD) em modelos biológicos. A AFD provoca a fotooxidação de substratos biológicos através da geração de espécies reativas de oxigênio produzidas pela associação entre um determinado comprimento de onda, uma substância fotosensível e oxigênio. Existem dois caminhos que levam a morte celular pelo processo de fotooxidação conhecidos como mecanismo do tipo I e tipo II. No mecanismo tipo I são gerados radicais como o radical ânion superóxido e radical hidroxila, enquanto no mecanismo do tipo II a espécie reativa de oxigênio gerada é o oxigênio singlete (1O2). A TFD da C-PC possui muitas vantagens em relação ao uso das hematoporfirinas e seus derivados, como rápida preparação e fácil purificação, ampla faixa de absorção do UV e visível, nenhum efeito local, e significativa redução da fotosensibilidade em tecidos normais por ter uma rápida metabolização em vivo. As pesquisas que avaliam os possíveis efeitos celulares da AFD têm sido também estendidas para as células tumorais que adquirem fenótipo de resistência a múltiplas drogas (MDR). A MDR é um fenômeno no qual células tumorais, selecionadas resistentes a um agente quimioterápico, adquirem resistência a outras drogas, 5 aparentemente não relacionadas. O fenótipo MDR é multifatorial, mas o mecanismo melhor estudado é a super expressão da glicoproteína-P, que é uma proteína de membrana capaz de fazer a extrusão de quimioterápicos para fora de célula. Com isso o objetivo deste estudo é avaliar a sensibilidade das linhagens celulares que expressem (Lucena) ou não (K562) o fenótipo MDR à AFD do pigmento C-FC, extraído da cianobactéria S. platensis, e propor um possível mecanismo de ação. A extração da C-PC foi feita no Laboratorio de Microbiologia e Engenharia de Bioprocesos (FURG). Diferentes concentrações de C-PC (0.025, 0.05, 0.10, 0.20 e 0.40 mg/ml para os testes de PDA da C-PC e 0.05, 0.10, 0.20, 0.40 e 0.60 mg/ml para os testes no escuro) foram usadas. O número de células viáveis foi avaliada imediatamente, 24 h e 48 h após o tratamento com C-PC ou PDA da C-PC através de exclusão por azul de trypan. A concentração de 0.05 mg/ml foi utilizada para determinar o possível papel da Pgp na resposta da linhagem Lucena e a concentração de 0.10 mg/ml foi utilizada nos testes de peroxidação lipídica (LPO), de produção de espécies reativas de oxigênio (ROS) e quantificação de apoptose/necrose. A PDA da CPC causou uma diminuição no número de células viáveis em ambas linhagens K562 (não MDR) e Lucena (MDR), sendo que a linhagem MDR foi menos sensível que a não MDR. Já nos testes realizados no escuro, nenhuma toxicidade foi encontrada para as duas linhagens. Nenhuma alteração na resistência da linhagem Lucena foi encontrada quando o modulador verapamil foi colocado durante o tratamento de APD com C-PC e até às 48h de acompanhamento após o tratamento. Também não foi encontrada diferença significativa de lipoperoxidação (LPO) mas houve uma tendência de aumento na produção de ROS, que foi mais evidente na linhagem K562. Além disso a linhagem Lucena apresentou uma produção basal de ROS significativamente maior que a K562. Nos testes de apoptose/necrose nenhuma diferença foi encontrada entre as células controle e tratadas em ambas linhagens. Os resultados encontrados neste estudo sugerem que a C-PC possa ser um potente agente fotosensibilizante, tanto para linhagens não MDR quanto para linhagens MDR e também que o mecanismo tipo II esteja envolvido em maior parte no efeito observado na PDA da C-PC, mas uma menor participação do mecanismo tipo I não pode ser descartada.