Characterization of cytotoxic ribonucleases: from the internalization pathway to the importance of dimeric structures

En aquesta tesi s'ha caracteritzat la ruta d'internalització de l'onconasa, una RNasa citotòxica. Els resultats indiquen que l'onconasa entra a les cèl·lules per la via dependent de clatrina i del complex AP-2. Seguidament es dirigeix als endosomes de reciclatge i es a través d'aquesta ruta que la proteïna exerceix la citotoxicitat. Per altra banda, els resultats d'aquest treball demostren que PE5, una variant citotòxica de la ribonucleasa pancreàtica humana (HP-RNasa), interacciona amb la importina  mitjançant diferents residus que tot i que no són seqüencials, es troben propers en l'estructura tridimensional d'aquesta proteïna. PM8 és una HP-RNasa amb estructura cristal·logràfica dimèrica constituïda per intercanvi de dominis N-terminals. En aquesta tesi s'han establert les condicions per estabilitzar aquest dimer en solució i també es proposa un mecanisme per la dimerització.

Detecció de la Ribonucleasa 1 anòmalament glicosilada en sèrums humans: possible ús com a marcador tumoral del càncer de pàncreas

L'adenocarcinoma pancreàtic és una neoplàsia amb mal pronòstic per la que no existeixen marcadors específics. En aquesta tesi s'han estudiat possibles alteracions de les estructures glucídiques de la ribonucleasa pancreàtica humana (RNasa 1) de sèrum amb l'objectiu de determinar el seu ús diagnòstic. S'han descrit les estructures glucídiques de la RNasa 1 sèrica i de línies cel·lulars endotelials, i s'ha observat un increment en la proporció d'estructures biantenàries amb Fc en la RNasa 1 sèrica de pacients amb càncer de pàncreas, fet que podria ser d'utilitat diagnòstica. També, donada la gran similitud entre les estructures glucídiques descrites per la RNasa 1 sèrica i per l'endotelial, l'origen de la RNasa 1 sèrica sembla ser principalment endotelial. La RNasa 1 també s'ha avaluat per electroforesi bidimensional i s'ha establert una correlació entre el contingut d'àcid siàlic i el seu pI, fet que pot ajudar a la interpretació dels mapes bidimensionals d'altres glicoproteïnes.

Estabilitat conformacional de variants de la ribonucleasa A: pressió i temperatura com a inductors dels desplegament proteic

A fi d'analitzar la contribució de la regió C-terminal proposada com a iniciadora del plegament (CFIS 106-118) a l'estabilitat de l'RNasa A, els residus alifàtics d'aquesta regió es van substituir, mitjançant mutagènesi dirigida, per altres residus en els quals la cadena lateral alifàtica era rogressivament escurçada. La major part de les substitucions projectades suposaven delecions no disruptives de grups metil(è). A més, es va reemplaçar la Tyr115 per un Trp, de manera que, potencialment, s'introduïa una única sonda fluorescent, no desestabilitzant, per tal de seguir els canvis conformacionals que es poguessin generar en la regió durant el procés de legament/desplegament de la proteïna. Tant els paràmetres cinètics, com els espectres d'FTIR i CD, determinats per cadascuna de les ribonucleases variants, indiquen que els reemplaçaments aminoacídics efectuats presenten, en general, poc o cap efecte en l'estructura nativa i en l'activitat de l'enzim. Es va emprar l'espectroscòpia d'absorció a l'ultraviolat de quarta derivada, la fluorescència (per la variant amb Trp) i l'espectroscòpia d'infraroig per transformada de Fourier, per tal de seguir i caracteritzar, en condicions d'equilibri, les transicions conformacionals de cada variant en funció de la pressió i de la temperatura. Els resultats es van comparar amb els que es van obtenir per la proteïna salvatge. Per determinar més a fons les característiques del procés de desplegament de la variant Y115W, les transicions de desnaturalització induïdes per urea d'aquesta variant i de la proteïna salvatge, van ésser examinades per mitjà d'electroforesi en gradient d'urea i espectroscòpia de fluorescència. Curiosament, els canvis conformacionals que resulten de la desnaturalització per pressió són molt semblants als que s'obtenen per temperatura. Enfront d'un augment gradual tant de pressió com de temperatura, l'estructura terciària i els elements d'estructura secundària de les proteïnes estudiades es perden de manera conjunta i reversible. Aquestes variacions estructurals que es promouen descriuen un procés de desplegament molt cooperatiu i en dos estats. Atès que ambdues tècniques (UV i FTIR) utilitzen cadascuna un règim de concentració proteica molt diferent, els resultats indiquen que el procés de desplegament per pressió i per temperatura és intramolecular. Els resultats obtinguts suggereixen que la hidrofobicitat i el volum de les cadenes laterals del CFIS, juntament amb les interaccions de van der Waals entre elements d'estructura secundària intervenen de manera molt notable en l'estabilització de la proteïna. Entre els diferents aminoàcids alifàtics que pertanyen al CFIS C-terminal, la Val108 és el residu més important per tal de preservar la integritat estructural de l'estat natiu. Els reemplaçaments en aquesta posició causen petites alteracions conformacionals i una gran desestabilització de la proteïna (per exemple, el punt mig de la transició de desnaturalització per pressió i per temperatura de la variant V108G disminueix uns 592 MPa i 25ºC, respectivament, respecte a la proteïna salvatge). D'acord amb els resultats obtinguts, la variant Y115W ofereix una sonda útil per tal de seguir la cinètica de plegament/desplegament de l'RNasa A.

Estudi de l'acció de diferents bloquejadors de la via ErbB en la teràpia antitumoral

L'inhibidor de carboxipeptidasa de patata (PCI) és un antagonista de l'EGF. Un dels problemes del PCI, però, és la baixa afinitat per l'EGFR en comparació amb el lligand natural. En aquest treball s'han dissenyat nous bloquejadors de la via ErbB partint de l'estructura de l'EGF per tal d'augmentar l'afinitat d'unió. S'ha determinat que les variants tenen reduïda la capacitat d'activació del receptor però segueixen promovent la proliferació cel·lular. Tot i així, s'ha obtingut una variant, l'EGF Truncat, que tot i no estar correctament plegada, és la que ofereix uns millors. També s'ha dut a terme un tractament combinat entre el PCI i un inhibidor de tirosin quinases d'aquesta mateixa via, l'Iressa. Els resultats han posat de manifest que hi ha un antagonisme entre els dos tractaments. Aquesta és la primera vegada que s'associa de forma directa un tipus de tractament amb una resistència associada a l'activació de la producció autocrina de lligands, i representa un avenç molt important en la recerca oncològica.

Glicosilació aberrant en proteïnes de secreció com a marcadors tumorals

Als països desenvolupats, una de cada cinc persones morirà a causa del càncer. S'ha descrit que les cèl·lules canceroses presenten modificacions en els glicans presents a la superfície cel·lular i aquesta glicosilació anòmala podria reflectir-se en les glicoproteïnes de secreció. Per aquest motiu es planteja l'estudi de la glicosilació de dues proteïnes de secreció en situació normal i tumoral: la ribonucleasa pancreática humana (RNasa 1) i l'antigen prostàtic específic (PSA). La RNasa 1 és una glicoproteïna secretada majoritàriament pel pàncreas. S'ha desenvolupat un mètode immunològic per a detectar els nivells de RNasa 1 en sèrum. Malgrat la millora de la sensibilitat, respecte d'estudis anteriors, no s'han observat diferències significatives entre la concentració de RNasa 1 en sèrum de pacients control sans, afectats de neoplàsia pancreàtica, de pancreatitis o d'altres patologies. L'estudi de les estructures glucídiques de la RNasa 1, mitjançant assaigs immunològics, permet observar diferències importants en la glicosilació entre la situació normal i tumoral: Els antígens sialilats sLex i sLea només apareixen en la RNasa 1 de medi de cultiu de cèl·lules d'adenocarcinoma pancreàtic Capan-1 i MDAPanc-3 i l'antigen fucosilat Ley només apareix en la RNasa 1 de pàncreas de donant. S'ha purificat la RNasa 1 secretada per la línia MDAPanc-3, cosa que ha permès seqüenciar-ne les estructures glucídiques i comparar-les amb les de la RNasa 1 purificada del medi de les cèl·lules Capan-1 i de pàncreas de donant, corroborant els resultats abans esmentats. L'antigen prostàtic específic (PSA) és una glicoproteïna secretada principalment per la pròstata. Els seus nivells sèrics s'utilitzen actualment com a marcador del càncer de pròstata, però la seva especificitat no permet diferenciar clarament una situació benigna d'una maligna. La purificació i caracterització glucídica del PSA secretat per les cèl·lules de carcinoma prostàtic LNCaP mostren diferències molt clares amb la glicosilació que presenta el PSA purificat de plasma seminal de donant. Principalment, el PSA present en situació tumoral, purificat de les cèl·lules de carcinoma prostàtic, no conté àcid siàlic, però presenta nivells més alts de fucosilació que el PSA en situació normal. El PSA purificat de plasma seminal de donant sí que conté àcid siàlic. Aquests resultats s'han obtingut mitjançant assaigs immunològics amb detecció per lectines i s'han corroborat per seqüenciació glucídica. D'acord amb les estructures glucídiques que millor diferencien el PSA de situació normal i tumoral, s'ha portat a terme la caracterització glucídica de mostres biològiques que contenen PSA. S'han desenvolupat diferents assaigs immunològics de detecció per lectines o associats a l'activitat sialiltransferasa, amb un enriquiment previ en PSA per immunoadsorció indirecta o cromatografia per interacció tiofílica. Els resultats dels diferents assaigs permeten concloure que el PSA del sèrum de pacients de neoplàsia prostàtica presenten un contingut en àcid siàlic similar al del plasma seminal de donant, encara que són lleugerament menys sialilats. Aquests resultats s'adiuen amb els determinats sobre mostres de PSA purificat. La separació del PSA per electroforesi bidimensional mostra diverses formes amb pI àcid en el PSA de plasma seminal, explicades per la presència d'àcid siàlic. Es detecten formes de pI més bàsic que el teòric per al PSA en el secretat per les cèl·lules LNCaP, que correspon a formes pPSA. Al sèrum de pacients de neoplàsia prostàtica s'hi observen formes sialilades. Les proteïnes de secreció, RNasa 1 i PSA, es troben alterades a nivell glucídic en situació tumoral, cosa que podria ser d'utilitat per a finalitats diagnòstiques.

Intestinal microbiology in Crohn's disease: a study of Escherichia coli as a potential etiologic agent

La malaltia de Crohn és una malaltia inflamatòria intestinal crònica d'etiologia encara desconeguda. Actualment es pensa que hi participen factors genètics i immunològics que confereixen una susceptibilitat a l'hoste, i factors externs o ambientals, com serien els microorganismes i/o l'estil de vida. L'objectiu principal d'aquest treball ha estat descriure les poblacions bacterianes associades especialment als malalts de Crohn, amb la intenció d'identificar possibles agents etiològics. Els resultats d'aquest treball coincideixen amb investigacions prèvies que descriuen l'alteració bacteriana present en els malalts de Crohn (disbiosi) i recolzen la hipòtesi que implica el recentment descrit patovar "Adherent- Invasive Escherichia coli" (AIEC) en l'etiologia d'aquesta malaltia inflamatòria intestinal. A més, contribuïm a la descripció de les poblacions d'E. coli associades a la mucosa intestinal aportant dades sobre aspectes ecològics i patogènics. Finalment, descrivim nous aspectes fenotípics d'AIEC que podrien estar relacionats amb la seva patogènia, com seria la capacitat de formar biofilms.

Les sHsps en surera: capacitat protectora enfront l'estrés i variabilitat genètica

Els organismes responen a la temperatura i a molts altres estressos sintetitzant un grup de proteïnes anomenat proteïnes de xoc de calor (HSPs). En plantes les sHsps, d'entre 15 i 30 kDa formen el grup més abundant i divers, classificat en funció de la seva localització subcel.lular i homologia en: mitocondrials, cloroplàstiques, de reticle endoplasmàtic i citoplàsmiques de classe I i II. Les sHsps-CI s'ha descrit que s'indueixen per estrès tèrmic, hídric i oxidatiu (peròxid d'hidrògen, llum UV, ozó) i en resposta a algunes hormones. També s'expressen durant el desenvolupament, per exemple durant l'embriogènesi, on es creu que podrien tenir un paper protector de l'embrió enfront la dessecació. Tot i que hi ha abundants treballs que correlacionen la resistència a l'estrès i l'acumulació de sHsps-CI, els mecanismes moleculars d'aquesta activitat són poc conguts. Tot i això, per diverses sHsps-CI ha estat descrita una activitat xaperona in vitro i, més recentment, que la seva sobreexpressió augmenta la viabilitat de cèl.lules d'E.coli en condicions d'estrès tèrmic. L'estudi de l'acumulació de sHsps-CI en surera (Quercus suber) mitjançant immunodetecció en electroforesi bidimensional mostra uns patrons d'acumulació complexos i formats per dos grups d'espècies proteiques principals, a l'entorn dels 10 i 17 kDa respectivament, que mostren una inducció diferencial en funció del teixit i l'estrès. Mentre que les espècies proteiques de 17 kDa s'indueixen per temperatura però no per estrès oxidatiu, les de ca. 10 kDa ho fan per estrès oxidatiu i no per temperatura. Ambdós grups d'espècies proteiques s'acumulen conjuntament en fel.lema. Assajos de PCR i RT-PCR han permès clonar parcialment tres noves sHsps-CI en surera: Qshsp10-CI, QshspC-CI i QshspD-CI. Aquest fet confirma la multigeneïcitat de les sHsps-CI en surera que apuntava el patró bidimensional. Dels nous clons obtinguts destaca especialment Qshsp10-CI, un gen que presenta un codó stop enmig del domini -cristal.lí que fa que a la proteïna que se'n dedueix li manqui un 55% del domini -cristal.lí i tota l'extensió C-terminal. Es tractaria de la sHsp més petita i més truncada descrita fins al moment. L'anàlisi de l'expressió de Qshsp10-CI mitjançant RT-PCR mostra expressió en plantes tractades amb H2O2 però no en les que han estat sotmeses a un xoc de calor. Aprofitant l'oportunitat que oferia aquesta sHsp-CI de ser utilitzada com a model per l'estudi de la importància del domini -cristal.lí i l'extensió C-terminal en l'activitat protectora enfront l'estrès, es va voler determinar la capacitat que tenia d'augmentar la viabilitat de cèl.lules d'E. coli en condicions d'estrès tèrmic i oxidatiu. Els resultats mostren que la proteïna recombinant QsHsp10-CI, tot i la important truncació que té, és capaç de protegir cèl.lules d'E. coli en condicions d'estrès tèrmic i, remarcablement, en condicions d'estrès oxidatiu. Tots aquests resultats indiquen que les espècies proteiques de ca. 10 kDa podrien correspondre a Qshsp10-CI i tenir un paper en les cèl.lules del fel.lema en la protecció enfront l'estrès oxidatiu. L'estrès oxidatiu provoca lesions al DNA que poden produir errors en la replicació, transcripció o traducció i generar proteïnes aberrants. Donades les condicions d'estrès oxidatiu a les quals es troben sotmeses les cèl.lules del fel.lema, s'ha volgut estudiar la variabilitat dels seus àcids nucleics. La determinació de la taxa de mutació de la regió codificant del gen Qshsp17.4-CI en mRNA i DNA de fel.lema i àpex radicular, un teixit jove i en creixement actiu va mostrar unes taxes sorprenentment elevades en l'mRNA (1/1784 pb) i el DNA genòmic (1/1520 pb) del fel.lema. Aquestes taxes són les més altes descrites en un genoma nuclear eucariota i són similars a les dels virus d'RNA d'evolució ràpida com el virus de l'Hepatitis C. Amb aquestes taxes de mutació, un terç dels mRNAs del fel.lema de la surera contindrien missatges aberrants i la supervivència de les cel.lules es veuria compromesa. Això implica que el fel.lema hauria de ser considerat com un mosaic de cèl.lules genèticament heterogènies i, per tant, una sola seqüència no defineix en tota la seva amplitud un gen en aquest teixit. No es va detectar cap mutació en àpex de rel. Amb l'objectiu d'aprofundir en el coneixement de les mutacions que es donen en aquests dos teixits i per tal de poder fer una anàlisi qualitativa més completa que permetés especular sobre el seu origen, es va aplicar un mètode de selecció de seqüències mutants en base a la utilització d'enzims de restricció. Les mutacions detectades en fel.lema es corresponen amb les relacionades, en altres sistemes no nuclears (plasmidis, fags i DNA bacterià), amb l'estrès oxidatiu. En conseqüència, l'estrès oxidatiu al qual estan sotmeses les cèl.lules del fel.lema podria ser el causant de l'elevada taxa de mutació detectada. D'acord amb això, el tipus majoritari de productes d'oxidació de les bases del DNA que s'acumulen en brots de plàntules de surera en resposta al peròxid d'hidrògen produeixen el mateix tipus de mutacions detectades en l'mRNA del fel.lema de la surera. La major sensibilitat d'aquest nou mètode ha permès, a més, detectar mutacions en molècules d'mRNA de rel, un teixit en el qual no s'havia trobat cap mutació utilitzant el mètode de clonatge i seqüenciació directa. Tot i això, el tipus de mutacions predominants no estan relacionades amb l'estrès oxidatiu sinó amb erros en la reparació dels àcids nucleics.

L´onconasa com a model per l´estudi de les bases moleculars de la citotoxicitat de les ribonucleases pancreàtiques. Aplicacions a la construcció de ribonucleases amb activitat antimicrobiana

La primera part d'aquest treball s´ha centrat en la caracterització i optimització del procés d'activació de l´onconasa recombinant per tal d'obtenir l´enzim igual a la forma nativa. Per això, les reaccions d'eliminació de la Met-1 i la ciclació de la Glu1, necessàries per generar el piroglutamic han estat seguides per MALDI-TOF MS. La segona part d´aquest treball s´ha centrat en l´estudi de la contribució del pont disulfur 30-75 de l´onconasa a les seves propietats biològiques. Els resultats suggereixen que el potencial redox del citosol cel·lular podria reduir el pont disulfur 30-75 de l´onconasa salvatge afectant la unió onconasa -inhibidor proteic de ribonucleases. La tercera part ha consistit en la construcció de variants de l´HP-RNasa i onconasa amb activitat bactericida. Per això, s´ha introduït el determinant bactericida (YRWR) descrit per la proteïna catiònica d'eosinòfils en els dos enzims. Els resultats obtinguts han evidenciat que les dues ribonucleases amb el determinant bactericida presenten activitat citotòxica contra bacteris gram-negatius preferentment.

Mecanismes cel·lulars en la curació de ferides a Hirudo medicinalis

S'estudia la histologia normal de la paret corporal d'Hirudo medicinalis i els canvis morfogenètics que es donen durant el procés de cicatrització de ferides per incisió, cauterització i nitrat de plata. El procés de curació de ferides a Hirudo medicinalis consta d'una fase de formació d'un tap cel·lular, el pseudoblastema, d'un procés de reepitelització i de la formació d'un teixit cicatricial, com en els altres hirudinis estudiats (Myers, 1935; LeGore i Sparks, 1971; Cornec, 1984). Hem observat també el fenomen de la contracció de la ferida que permet l'acostament dels marges de la ferida. Formació i evolució del pseudoblastema El pseudoblastema, a diferència d'altres espècies estudiades, està format per un sol tipus cel·lular: les cèl·lules vasocentrals, provinents del teixit vasofibrós, una especialització del teixit connectiu. Aquestes cèl·lules estan capacitades per realitzar les diferents funcions que en espècies rincobdèl·lides realitzen diferents tipus cel·lulars. En concret: taponament de la ferida a través de la formació del pseudoblastema, fagocitosi dels teixits necrosats i regeneració, almenys d'una part, de la matriu connectiva cicatricial. També són responsables de la contracció de la ferida. Les cèl·lules vasocentrals en el seu estadi de repòs es troben en el teixit vasofibrós formant agrupacions coherents, però sense mostrar unions intercel·lulars especialitzades visibles en ME. La coherència del grup queda assegurada per les interdigitacions entre les cèl·lules vasocentrals i probablement per unions tipus adherens o especialitzades. Les unions amb la matriu són de tipus adherens. Aquestes cèl·lules vasocentrals presenten feixos de filaments d'actina força conspicus. En produir-se una ferida les cèl·lules vasocentrals s'activen, desconnecten les unions intercel·lulars i amb la matriu i migren cap a la zona afectada, on s'acumulen. El pseudoblastema actua com un tap cel·lular que funciona de forma eficient per tancar la ferida en un plaç de temps relativament curt. El pseudoblastema forma un teixit coherent amb unions intercel·lulars tipus adherens, caracteritzades per material electrodens en la cara intracitoplasmàtica, feixos de filaments d'actina que hi convergeixen i espais intercel·lulars petits, de 17-20 mm, atravessats per petites fibril·les. Un cop finalitzat el procés de reepitelització, es produeix una contracció de la ferida. Es produeix per la retracció del pseudoblastema cap a l'interior de l'animal. El pseudoblastema disminueix la seva amplària i arrossega els teixits contigus provocant un tancament. La força motriu que provoca la retracció i l'arrossegament dels teixits vindria donada per la presència dels filaments d'actina a les cèl·lules del pseudoblastema, els quals durant aquesta fase es tornen mes conspicus. La presència d'unions intercel·lulars especialitzades característiques de la fase de contracció, està relacionada amb la transmissió de la força de tensió. Aquestes unions connecten els feixos de filaments d'actina de les cèl·lules amb la matriu o d'una cèl·lula a altre a través d'espais intercel·lulars força amples en els que s'observa material electrodens. Reepitelització L'epitelització s'inicia quan el pseudoblastema està consolidat i segueix el mateix patró que la reepitelització de ferides en epitelis monoestratificats de vertebrats (Stem i DePalma, 1983, és a dir, per migració de tota la capa per sobre del substrat, segons l'anomenat model de lliscament. Les glàndules unicel·lulars mucoses del tegument degeneren abans de produir-se la migració epitelial i posteriorment, un cop consolidat l'epiteli a sobre de la ferida, es diferencien a partir de les cèl·lules epitelials. Durant l'epitelització es produeixen canvis importants en el citosquelet i les unions basals de les cèl·lules epitelials. En canvi, el complex d'unió lateral es manté durant tot el procés. En iniciar-se la migració els tonofilaments es desconnecten dels hemidesmosomes cuticulars i dèrmics i es reagrupen al voltant del nucli, a la vegada que els hemidesmosomes dèrmics es desconnecten de la làmina basal. Un cop acabada la migració, les cèl·lules epitelials estableixen unions basals amb les cèl·lules del pseudoblastema. Aquestes unions no són hemidesmosomes sinó que presenten el mateix aspecte que les unions intercel·lulars del pseudoblastema. Els hemidesmosomes no es tornen a formar fins que les cèl·lules epitelials han restablert la membrana basal. La regeneració de la membrana basal no s'inicia fins que no s'ha començat a regenerar matriu connectiva a la zona cicatricial. Regeneració de la cicatriu Al mateix temps que es dona el fenomen de contracció, s'observa regeneració de la matriu connectiva entre les cèl·lules del pseudoblastema. Aquestes cèl·lules són responsables almenys del recobriment fibrós que presenten en aquest estadi, durant el qual mostren sàculs del reticle endoplasmàtic rugós molt dilatats, característics de cèl·lules que secreten constituents de la matriu. A més, s'observa infiltració de matriu connectiva i processos citoplasmàtics dels fibròcits en els marges del pseudoblastema. En la matriu del teixit connectiu normal s'observen fibres que estan constituïdes per un còrtex de fibril·les col·làgenes organitzades al voltant dels processos citoplasmàtics dels fibròcits. Les fibres del teixit connectiu peridigestiu, d'uns 1,2-1,9 mm de diàmetre, presenten el còrtex prim, amb les fibril·les organitzades paral·lelament a l'eix de la fibra. En canvi, les fibres de la dermis i teixit connectiu intramuscular, d'uns 2,5-7,1 mm de diàmetre, tenen el còrtex gruixut, amb fibril·les que s'organitzen paral·lelament en la zona proximal a la medul·la i de forma desorganitzada en la part més distal. Als 8 mesos la cicatriu encara és detectable. La matriu cicatricial presenta fibres connectives del tipus prim i força material fibril·lar desorganitzat disposat laxament. S'observa colonització per part de fibròcits, cromatòfors, petites fibres musculars i nervis.

Nous factors inflamatoris de la diabetis tipus 2: SP-D, SP-A, a-Defensives i visfatina

La DM 2 és una malaltia multifactorial i multigènica. Aquest fet condueix a l'estudi de molts gens i proteïnes susceptibles d'estar implicades amb la DM 2. Algunes d'aquestes proteïnes i gens estan associats a un estat lleu d'inflamació crònica, la qual pot desencadenar la síndrome metabòlica (SRI) i DM 2. Moltes d'aquestes proteïnes poden usar-se com a possibles marcadors de malaltia cardiovascular, resistència a la insulina i futura DM 2. Aquest treball presenta quatre proteïnes i la seva relació amb la SRI i la DM 2. L'SP-D i l'SP-A s'estudien per la relació que hi ha entre la disminució de la funció pulmonar i la resistència a la insulina i pel fet de ser moduladores de la inflamació. Les α-defensines s'estudien perquè també són moduladores de la inflamació i per una possible relació amb l'arteriosclerosi i el colesterol LDL. La visfatina s'estudia per la possible associació amb la insulinosecreció.

Paper del nucli hidrofòbic principal de la RNasa A en el plegament i desplegament induïts per pressió i temperatura

Utilitzant temperatura i pressió com a agents desnaturalitzants s'ha explorat la contribució a l'estabilitat de diferents residus del principal nucli hidrofòbic de la RNasa A. Aquests resutats suggereixen que el principal nucli hidrofòbic d'aquest enzim, està fortament empaquetat i ha revelat l'existència de reordenacions en l'interior de la proteïna. El mètode dels valors , han permès estudiar el paper de les interaccions hidrofòbiques establertes pels residus del principal nucli hidrofòbic de la RNasa A en el seu estat de transició induït per pressió. En conjunt, aquests resultats suggereixen que l'estat de transició de la RNasa A, s'assemblaria a un glòbul col·lapsat amb una cadena estructurada però amb un debilitat nucli hidrofòbic. S'ha explorat també, el paisatge energètic del plegament/desplegament proteic de la variant Y115W de la RNasa A. L'estat de transició sembla interaccionar fortament amb la capa d'hidratació d'aquest estat, tal i com indiquen els resultats en presència de glicerol.

Producció i caracterització de variants de la ribonucleasa pancreàtica humana dissenyades per a adquirir propietats citotòxiques

Amb la finalitat d'aprofundir en les bases moleculars de la citotoxicitat de les ribonucleases pancreàtiques, es van construir variants derivades de l'HP-RNasa seguint dues estratègies. En la primera, es van generar variants de l'enzim resistents a l'acció de l'inhibidor proteic de les ribonucleases (hRI), substituint residus implicats en la interfície de contacte entre la ribonucleasa i l'hRI. En la segona, es va addicionar el motiu RGD en regions de superfície de la proteïna implicades en la formació del complex amb l'hRI, a fi de promoure la seva interacció amb la membrana plasmàtica de les cèl·lules i a la vegada disminuir l'afinitat de les variants per l'hRI. Es va comprovar que només les variants portadores de substitucions múltiples adquirien la capacitat de resistència a l'hRI. L'estudi del percentatge d'inhibició de la síntesi proteica en cèl·lules incubades amb cadascuna de les variants va mostrar que només dues de les variants construïdes havien adquirit propietats citotòxiques. La citotoxicitat més elevada la va presentar una variant que no era resistent a l'hRI, amb valors que eren només entre 5 i 15 vegades inferiors als de l'onconasa. Aquest resultat demostrà que la sensibilitat a l'hRI no és necessàriament un paràmetre limitant per a la citotoxicitat de les ribonucleases. Cap de les variants que incorporava un motiu RGD presentà citotoxicitat, evidenciant que aquest motiu no és efectiu a fi de dotar les ribonucleases pancreàtiques de propietats citotòxiques. Es van estudiar les bases moleculars de la citotoxicitat de la variant més citotòxica. En primer lloc, l'anàlisi de la internalització per marcatge radioactiu d'aquesta variant en relació amb l'onconasa i amb altres variants de l'HP-RNasa no citotòxiques, va posar en evidència que només l'onconasa era internalitzada eficientment. Es descartava així la possibilitat que l'acció citotòxica de l'enzim estudiat fos conseqüència d'una major eficiència d'endocitosi. També es va comprovar que l'addició del motiu RGD no era capaç de promoure la internalització de les proteïnes amb més eficàcia. Per microscòpia confocal de fluorescència, les variants humanes només es van començar a detectar a l'interior de la cèl·lula a partir de les 24 h d'incubació. Totes les variants generades van presentar una eficiència catalítica superior al 50 % de l'activitat de la seva proteïna parental, PM5, indicant que probablement l'estructura del centre actiu no havia estat afectada de manera dràstica per les substitucions introduïdes. No obstant, en tots els casos es va produir una disminució en la termoestabilitat respecte a PM5. Aquest resultat indicà que la correlació descrita a la bibliografia entre l'increment de termoestabilitat i l'increment de citotoxicitat per les ribonucleases no sempre es compleix. Per microscòpia confocal es va comprovar que tant la proteïna més citotòxica, com una variant no citotòxica resistent a l'hRI, així com la proteïna parental, seguien la via de degradació lisosomal. Aquesta ruta de trànsit no va ser afectada per l'addició de drogues que alteren les vies de trànsit retrògrad (monensina i brefeldina A), però sí per l'addició de la bafilomicina A1, una droga que neutralitza el pH endosomal i que va actuar alentint el trànsit de les proteïnes als lisosomes. D'acord amb aquests resultats, els valors de citotoxicitat de les variants es van incrementar de manera significativa només en presència de bafilomicina A1, suggerint que les ribonucleases transloquen al citoplasma a partir d'algun punt de la via de trànsit endosomal. Es va comprovar que l'acció de la variant més citotòxica era deguda a que l'addició d'un segon motiu de tres Arg en PE5 dota a aquesta proteïna amb un senyal de transport nuclear. La fracció d'enzim que aconsegueix translocar al citoplasma a partir d'algun punt de la via endosomal previ als lisosomes, és conduït ràpidament al nucli de la cèl·lula per mitjà del mecanisme clàssic de transport actiu. Per la seva afinitat amb l'rRNA, l'enzim es concentra en el nuclèol, on probablement duu a terme la seva activitat catalítica. La interacció d'aquesta variant amb els receptors nucleocitoplasmàtics, les importines, impediria per altra banda el bloqueig de l'enzim per part de l'hRI. Els resultats obtinguts presenten una nova estratègia de disseny de ribonucleases citotòxiques, basada en l'addició de segments NLS a fi de promoure el transport nuclear dels enzims. Aquesta estratègia podria permetre superar limitacions que fins al moment han estat descrites com a limitants de la citotoxicitat de les ribonucleases pancreàtiques, com la sensibilitat a l'hRI o la baixa eficiència d'internalització.

Resolució de l'estructura tridimensional de l'helicasa hexamètrica DnaB

Es presenta el model atòmic a 4.5 Å de DnaB, la principal helicasa replicativa bacteriana, d'Aquifex aeolicus. És un anell hexamèric de 100 Å d'amplada i 80 Å d'alçada amb dues capes de simetria diferenciada, la dels dominis N-terminals en C3 i la dels C-terminals propera a C6. El diàmetre central és de 25 Å al llarg d'ambdues capes, principal diferència amb les estructures prèvies, on era 25 Å més estret a la capa N-terminal. L'estretament s'origina pel trencament d'una de les dues superfícies d'interacció entre monòmers N-terminals, cosa que augmenta la flexibilitat del subdomini implicat. Només l'ssDNA pot atravessar l'anell, quan a les estructures prèvies hi podia passar tant ssDNA com dsDNA. L'estructura aquí presentada és més propera a la conformació funcional de DnaB durant la realització de l'activitat helicasa, mentre que les anteriors correspondrien a la forma inactiva o a la conformació capaç de translocar-se sobre dsDNA.

Anàlisi de la capacitat de regeneració en estadis inicials del desenvolupament en diverses espècies mediterrànies del gènere Quercus

Aquest treball es centra en l'estudi de la regeneració vegetativa en els estadis inicials del desenvolupament de Quercus coccifera, Q. humilis, Q. ilex i Q. suber, analitzant la capacitat de rebrotada després de l'eliminació de la biomassa aèria. S'ha realitzat una descripció, a nivell histològic, de l'ontogènesi del nus cotiledonar des de l'embrió fins a la plàntula de mig any d'edat de Q. coccifera, Q. humilis i Q. ilex. Així mateix, s'ha analitzat el contingut de midó i de nitrogen a la primavera, l'estiu i l'hivern en diferents parts de les plàntules de les quatre espècies, avaluant, alhora, l'efecte de la tala. D'altra banda, també s'ha estudiat la biometria de les glans, la capacitat de germinació i el creixement de les plàntules de les quatre espècies de Quercus. A partir dels resultats s'ha comprovat que les glans de Q. suber, en general, són més grans, tant en diàmetre com en longitud, i tenen un pes superior, mentre que les de Q. ilex són més petites i pesen menys. En les quatre espècies estudiades, el pes de la llavor està determinat per la longitud i el diàmetre, si bé, també hi ha un cert efecte de l'espècie. Amb les dades obtingudes de les tres variables de la gla s'ha calculat una funció discriminant a partir de la qual es pot determinar, amb un alt grau d'encert, a quina espècie pertany una determinada gla coneixent la mida i el pes. En relació a la capacitat de germinació, en Q. coccifera i Q. ilex la germinació depèn del pes de la gla, mentre que en Q. humilis i Q. suber és independent. Així mateix, també s'ha comprovat que el pes de la llavor afecta positivament en el creixement de les plàntules de tres i sis mesos d'edat. Possiblement un major pes de la gla implica un contingut de substàncies de reserva més elevat, i per tant representa un major subministrament de nutrients cap a la planta, repercutint així en el seu creixement inicial. En plàntules de nou mesos d'edat ja no s'ha trobat relació entre el pes de la gla i el creixement de la planta, la qual cosa es podria explicar pel fet que les substàncies de reserva de la llavor s'han esgotat. Pel que fa al creixement de la plàntula, les plàntules de Q. ilex han tingut la major taxa de creixement per quasi totes les variables estudiades. En aquesta espècie, al principi de l'experiment la grandària de les plàntules ha estat baixa, però al final han crescut més que les de les altres espècies. Les plàntules de Q. coccifera han presentat la menor taxa. En les plàntules de les quatre espècies s'ha constatat, també, que la biomassa del sistema radicular és superior a la de l'aeri. Les plàntules de Q. coccifera i Q. humilis han tingut una relació BA/BR (biomassa aèria/biomassa radicular) més baixa que les de Q. ilex i Q. suber. En espècies mediterrànies s'ha relacionat sovint una baixa relació BA/BR com una adaptació a la sequera. No obstant això, Q. humilis és una espècie que viu en zones més humides que la resta d'espècies estudiades. En referència a la regeneració vegetativa, amb aquest estudi es demostra que les plàntules de les quatre espècies tenen una elevada capacitat d'emissió de rebrots, quan s'elimina la biomassa aèria per sobre la zona d'inserció dels cotilèdons. Tanmateix, el grau de supervivència difereix segons l'espècie i la intervenció. Així, per exemple, les plàntules de Q. ilex han presentat una major mortalitat tant en la primera com en la segona tala, mentre que en Q. humilis i Q. suber la supervivència de les plàntules ha disminuït després de talar dues vegades. En el cas de Q. coccifera el grau de supervivència és bastant similar tant en la primera com en la segona intervenció. La tala successiva afecta negativament al vigor dels rebrots en Q. coccifera, Q. humilis i Q. ilex. Ara bé, en el cas de Q. suber s'ha trobat que els rebrots emesos després de talar dues vegades han estat més grans que els obtinguts després d'una sola tala. Després de tallar la biomassa aèria per sobre la zona d'inserció dels cotilèdons, els rebrots s'originen a partir de les gemmes del nus cotiledonar. L'estudi de l'ontogènesi del nus cotiledonar ens ha permès de constatar que el patró de desenvolupament d'aquest en Q. coccifera, Q. humilis i Q. ilex és similar, però difereix del descrit per a Q. suber. En les tres primeres espècies el nus cotiledonar pràcticament no s'allarga i només es desenvolupen gemmes cotiledonars just en l'axil·la del pecíol cotiledonar. En aquest sentit, cal ressaltar que en el cas de Q. coccifera i Q. ilex les gemmes es formen després de germinar la gla, mentre que en Q. humilis i Q. suber són ja presents en l'embrió. Tal i com també s'ha descrit en Q. suber, en l'estadi de plàntula, en Q. coccifera, Q. humilis i Q. ilex a l'axil·la de la gemma cotiledonar proliferen noves gemmes, de tal manera que es formen plaques de gemmes. Les anàlisis del contingut de midó han permès de determinar que el sistema radicular de les plàntules de Q. coccifera, Q. humilis, Q. ilex i Q. suber conté aproximadament un 90% del midó de tota la planta. Concretament de les diferents fraccions del sistema radicular (nus cotiledonar, 11 pimers centímetres de l'arrel i resta de l'arrel) la major concentració de midó es troba ens els 11 primers cm de l'arrel, que en el cas de Q. suber correspon al nus cotiledonar. Quant a les estacions, a l'estiu la concentració de midó de la part aèria i radicular disminueix en Q. coccifera, Q. humilis i Q. ilex, si bé es recuperen a l'hivern. En canvi en el cas de Q. suber els nivells més baixos de midó s'han obtingut a l'hivern. La tala provoca una disminució dels nivells de midó, ja que una part d'aquest és mobilitzat per a la síntesi dels nous brots. En les quatre espècies la major proporció de midó mobilitzat és en els primers 11 cm de l'arrel, és a dir, el nus cotiledonar en el cas de Q. suber. Per tant, amb aquest estudi es reafirma que el nus cotiledonar de Q. suber és un lignotúber. Tanmateix, Q. coccifera, Q. humilis i Q. ilex no presenten cap lignotúber o estructura especialitzada en la rebrotada, si bé el fet de tenir gemmes i substàncies de reserva els confereix igualment una elevada capacitat per rebrotar. En relació al nitrogen, en les quatre espècies el sistema radicular presenta aproximadament el 70% del nitrogen total de la planta. A l'estiu, la concentració de nitrogen del sistema radicular de Q. humilis i Q. suber és més baixa que a l'hivern, mentre que en Q. coccifera i Q. ilex els valors són bastant similars en ambdues estacions. La tala no provoca una davallada dels nivells de midó, això possiblement es degui a que les plàntules van rebre continuament un aport de nitrogen a través de l'aigua de reg.

Efectes de la invasió de la formiga argentina, Linepithema humile (Mayr), sobre el procés de dispersió de llavors de plantes mediterrànies

La formiga invasora Linepithema humile (Mayr), també coneguda com la formiga argentina, és una espècie present a la península Ibèrica. En aquesta tesi s'ha estudiat com afecta la presència d'aquesta espècie plaga a la comunitat de formigues autòctones y al procés de dispersió de llavors de plantes mediterrànies. L'estudi es va dur a terme en una àrea de sureda i brolla d'estepes i bruc boal situada al nord-est peninsular, prop de la línia de costa mediterrània. Un dels primers y més notables efectes de la invasió a les nostres àrees d'estudi és la dramàtica alteració de la comunitat de formigues, en forma de una reducció de la riquesa específica i de la homogeneïtat d'abundàncies. A més, a les zones envaïdes no hi queda cap espècie de formiga autòctona dispersant de llavors. A causa de la gran abundància d'obreres de la formiga argentina a les zones envaïdes, i del seu elevat ritme d'activitat, aquesta espècie efectua un intens rastreig del sòl, la qual cosa li permet localitzar els recursos en un temps menor que les formigues autòctones de les zones no envaïdes. No obstant, la obertura mandibular de la comunitat de formigues esdevé molt disminuïda a les zones envaïdes a causa de la desaparició de les espècies autòctones, la majoria d'elles de mida més grossa que la formiga argentina, la qual cosa podria limitar la capacitat de manipulació de l'entorn que té la comunitat de formigues a les zones envaïdes, i podria explicar la falta de reemplaçament d'alguns dels rols que duien a terme les espècies de formigues autòctones abans de la invasió. La formiga argentina es mostra atreta per les llavors de les nou espècies vegetals estudiades (dues euforbiàcies: Euphorbia biumbellata i E. characias; dues compostes: Cirsium vulgare i Galactites tomentosa; i cinc papilionàcies: Genista linifolia, G. monspessulana, G. triflora, Sarothamnus arboreus i Ulex parviflorus), arribant a transportar i fins i tot introduir al niu algunes llavors, però amb probabilitats inferiors a les realitzades per les formigues autòctones de les zones no envaïdes. No obstant, el seu comportament davant les nou espècies de llavors és variable, de manera que sembla que el seu efecte sobre la dispersió de llavors podria ser diferent per a cada espècie vegetal. L'alteració del procés de dispersió no sembla alterar l'èxit reproductiu d'una espècie concreta, Euphorbia characias, a les zones envaïdes; ni el seu reclutament, ni la distribució espacial, ni la supervivència de les plàntules són significativament diferents a les zones envaïdes que a les no envaïdes. La desaparició de les espècies de formigues granívores de les zones envaïdes pot afectar la dinàmica de les llavors de plantes no mirmecòcores. Així, les llavors de tres papilionàcies (Calicotome spinosa, Psoralea bituminosa i Spartium junceum) resulten amb un menor nivell de transports (i probablement menor depredació) a les zones envaïdes per la formiga argentina.